马铃薯类黄酮-3-O-葡萄糖基化酶基因的克隆与表达分析

根据茄科植物花色苷生物合成相关基因的资料,设计简并引物,通过RT-PCR的方法从马铃薯(Solanum tuberosum cv.Chieftain)紫色芽的cDNA中克隆到类黄酮-3-O-葡萄糖基化酶基因(3GT)的全长cDNA.序列分析表明,这个3GT基因编码的多肽为448个氨基酸残基,在氨基酸水平上与茄科的矮牵牛和茄子的一致性最高,均为76%,多重比较和系统发育分析均表明,该基因为3GT家族中的一个新成员.用半定量RT-PCR进行了表达分析表明,3GT在根、叶和块茎中的表达量远高于茎和花;此外,3GT在Chieftain的红色愈伤组织中表达而在非红色愈伤组织中不表达,可见,3GT的表达与花色苷的积累是相关的.     

绣球花花色相关基因HmF3H的克隆及其表达分析

花色是植物重要的观赏性状之一,而黄烷酮羟化酶是植物花色素物质积累的关键酶,对植物花色差异具有重要影响。本研究利用PCR技术从盛花期蓝色花绣球品种‘无尽夏’不孕花中克隆获得了Hm F3H基因的全长序列,该基因的ORF序列长度为1 095 bp,编码364个氨基酸,编码蛋白的理论分子量为41.08 k D,理论等电点为5.48,为亲水性蛋白,该蛋白属于PLNO2515超家族成员,具有2-酮戊二酸双加氧酶结构域。系统进化树分析表明,该蛋白与咖啡树和佛手瓜的亲缘关系最近。实时定量PCR分析表明,Hm F3H基因在绣球花不同组织器官中均有表达,红色绣球品种‘粉黛’盛花期不孕花比蓝色绣球品种‘无尽夏’盛花期不孕花中表达量高,说明Hm F3H基因对绣球花花色差异形成具有一定影响。本研究获得了绣球花Hm F3H基因序列及其表达情况,为探讨绣球花品种花色差异形成机制具有一定指导意义。     

‘胎里红’枣果皮花青素合成酶ZjANS基因克隆及表达分析

为了研究枣果实发育过程中花青苷的积累和相关基因的表达模式,以紫色枣品种‘胎里红’为研究材料,利用枣基因组数据克隆获得两条ANS基因全长序列,将其命名为ZjANS1和ZjANS2。其开放阅读框分别为888和648 bp,分别编码295和215个氨基酸。蛋白多序列比对和进化树分析表明,ZjANS1和ZjANS2具有典型的2OG-Fe(II)-Oxy保守结构域。蛋白互作预测发现,含有LDOX/ANS结构域的蛋白主要与MYB113及DFR、UF3GT、F3H、TT8等存在互作关系。ZjANS1和ZjANS2与甜橙CsANS蛋白序列聚为一支,亲缘关系较近。亚细胞定位分析发现,ZjANS1和ZjANS2的功能结构域均定位在内质网上。RT-qPCR结果表明,ZjANS1和ZjANS2在不同组织中均有表达,但表达存在差异。ZjANS1在茎、芽和幼果中表达量较高,在成熟叶中最低,而ZjANS2在茎中表达量相对较高,在其他组织中较低。花青苷含量测定结果表明‘,胎里红’果实发育前期总花青苷和各花青苷组分的含量较高,后期花青苷含量较少。此外,将花青苷合成相关结构基因表达模式和与总花青苷含量进行关联分析,结果表...     

水稻花色苷含量及合成结构基因的差异表达研究

水稻花色苷的生物合成受许多因素影响,而控制关键酶的结构基因是最主要的因素。针对2个红米材料和2个白米材料,采用实时荧光定量的方法,对合成水稻花色苷的结构基因(OsPAL、OsCHS、OsCHI、OsF3H、OsF3′H、OsDFR、OsANS、OsF3′5′H、OsUFGT)在茎、叶及种子发育过程中的相对表达水平进行了测定。结果表明:1)OsPAL、OsCHS在水稻的茎、叶和种子中表达,OsCHI在白米恢复系蜀恢498和白米株系的组织中均有表达,是花色苷合成的组成型基因;其它基因在参试材料的茎、叶和种子中的表达量不同,具有组织特异性。2)在红米品种贵红1号和红米株系开花后7～28 d的花色苷含量逐渐增加,而白米恢复系蜀恢498和白米株系的花色苷含量逐渐下降;这些基因在红米品种贵红1号和红米株系的前中后期均有表达且表达量较高,OsCHS在红米品种贵红1号种子发育过程中的表达量逐渐增加;这些基因在白米恢复系蜀恢498和白米株系开花后7～28 d的前中期表达量较低,后期急剧降低。表明这些基因的表达量与其花色苷的含量动态变化相同,对花色苷的积累有一定的作用。3)OsPAL、OsCHS表达量与红米品种贵红1号花色苷含量呈显著正相关,OsF3H表达量与白米株系花色苷含量呈显著正相关,OsPAL表达量与红米株系花色苷含量呈显著正相关,OsCHI、OsF3′5′H、OsUFGT表达量与红米株系花色苷含量呈极显著正相关。研究表明,这些基因在参试材料的茎、叶和种子开花后7～28 d前中后期的差异表达,可能是造成它们着色差异的主要原因。OsPAL、OsCHS是红米品种贵红1号籽粒花色苷合成的关键基因,OsF3H在白米株系籽粒发育过程中扮演重要的角色,OsPAL、OsCHI、OsF3′5′H、OsUFGT在红米株系籽粒花色苷积累中起重要作用。     

苦荞鼠李糖基转移酶FtF3GT1基因的克隆与转化毛状根研究

苦荞中的黄酮类化合物具有很高的药用价值和保健功能。以苦荞川荞1号为材料,克隆出FtF3GT1基因,其CDS全长为1 401bp,编码467个氨基酸。系统发育分析表明,FtF3GT1与甜荞中的FeUF7GT蛋白亲缘关系最近。组织特异性表达分析结果表明,FtF3GT1基因在各个组织中均有表达,在根部最低,在茎部最高;MeJA处理苦荞和转pCAMBIA3301:FtF3GT1pro::GUS毛状根中发现,FtF3GT1基因的表达量以及GUS的活性明显受MeJA诱导;转过表达FtF3GT1基因毛状根中,总黄酮含量明显升高,推测FtF3GT1基因可促进黄酮类物质的合成。     

紫色不结球白菜花色苷合酶基因BrcANS的克隆与表达分析

以不结球白菜紫色品系NJZX1-3和其绿色突变体NJZX1-0及其后代F₂的2个株系NJZX2-1和NJZX2-2为材料,研究花色苷合酶基因在紫色不结球白菜叶片花色苷合成途径中的作用。利用同源克隆的方法,分别在NJZX1-3及NJZX1-0中克隆到花色苷合酶基因;经序列比对发现,花色苷合酶基因的核苷酸和氨基酸序列在2种材料和大白菜中完全一致,长度为1077 bp,编码358个残基,第211~307肽段具有2OG-Fe (II)双加氧酶家族基因的结构域,被命名为BrcANS。BrcANS蛋白与同科芥菜的同源性高达99%,进化关系亦与其最相近。在全部4种材料鲜叶中,总花色苷的含量(TAC)与叶片紫色程度是一致的,其中,NJZX1-3叶片中总花色苷含量最高,达到80.15±5.74 mg 100 g^–1 FW;BrcANS表达量为NJZX1-0 < NJZX2-1 < NJZX2-2< NJZX1-3,与其总花色苷含量呈正相关。BrcANS的mRNA在NJZX1-3和NJZX1-0两种材料的不同组织中特异性表达：在叶片中高度表达,而在其他组织中表达较弱;另外,在两种材料间的表达亦存在显著差异,在NJZX1-3叶片中的表达丰度显著高于NJZX1-0。随着叶龄的增大,紫色不接球白菜叶片紫色变浅,BrcANS的表达量下降,但在NJZX1-3和NJZX1-0间的表达差异亦明显减小。以上结果表明,BrcANS基因是紫色不结球白菜中花色苷合成的关键基因之一,其mRNA表达量与叶片紫色直接相关,可能在其转录水平上调控叶片中紫色的形成。     

萝卜PAL全基因组家族鉴定及在不同颜色类型萝卜中的表达分析

苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase, PAL)是类黄酮生物合成途径中的第一个关键酶,在植物花色苷的积累过程中起着重要的作用。本研究从萝卜基因组中鉴定到了5个PAL家族成员并命名为RsPAL1～RsPAL5,以胭脂萝卜‘红心1号’为材料克隆了这5个RsPALs的开放阅读框,利用荧光定量PCR技术分析了其在红皮红肉的‘砂罐萝卜’和‘红心1号’、红皮白肉的‘砂罐1号’和‘满堂红’和白皮白肉的‘春不老’的叶片、叶柄、皮和肉中的表达水平。结果显示,5个RsPALs基因开放阅读框长度分别为2 160、2 166、2 163、2 124和2 109 bp,分别编码719、721、720、707和702个氨基酸。氨基酸序列比对和系统进化树分析发现5个Rs PALs成员都有MIO保守结构域(Ala-Gly-Ser),RsPAL1～RsPAL4与拟南芥AtPAL1和At-PAL2聚在一起,Rs PAL5与AtPAL4聚在一起。不同品种不同组织中的定量PCR结果显示,RsPAL4仅在积累花色苷的组织中表达,且与花色苷含量呈正相关,这表明RsPAL4是参与萝卜花色苷生物合成途径的关键基因;其他4个成员在不同品种和不同组织中的表达并无明显的规律,可能参与了苯丙烷类代谢的其他次生代谢途径。本研究为进一步深入研究萝卜PAL的功能奠定了基础。     

滇水金凤黄烷酮3-羟化酶基因(IuF3H)的克隆及表达分析

为探究黄烷酮3-羟化酶(flavanone 3-hydroxylase, F3H)基因对滇水金凤(Impatiens uliginosa)花色的调控机制。本研究以红色滇水金凤花器官为试验材料,通过RT-PCR及RACE技术分离克隆F3H基因,发现其c DNA序列全长1 104 bp,编码367 aa,故命名为Iu F3H;同时通过氨基酸比对发现其蛋白与其他植物F3H蛋白同源性较高,约为78.91%,说明F3H基因具有较高的保守性;通过进一步克隆其g DNA序列,发现其全长为1 221 bp,其中包含3个外显子和2个内含子。q RT-PCR结果显示,Iu F3H基因在4种不同花色滇水金凤及其不同发育阶段均有不同程度的表达,其中以深红色的始花期表达量最高,粉红色的盛花期表达量最低。本研究结果表明,Iu F3H基因参与了相关色素生物合成,同时可能在滇水金凤花色素合成中具有关键作用,本研究为探讨Iu F3H基因在4种不同颜色滇水金凤中的分子机制提供数据参考。     

芒果二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)基因的克隆及其表达分析

二氢黄酮醇4-还原酶(dihydroflavonol 4-reductase,DFR)是花青素代谢后期重要的酶,是决定花青素从无色到有色的关键调控点。本研究以‘贵妃’芒果的果实为材料,采用同源克隆的方法克隆得到了一个二氢黄酮醇4-还原酶DFR基因。该基因c DNA全长为1 260 bp,开放阅读框为987 bp,编码328个氨基酸。进一步扩增得到其基因组DNA,全长为3 022 bp,分析发现其含有五个内含子,在已报道植物中表现保守。系统发育分析发现芒果DFR蛋白与火鹤花、小麦和大麦等植物具有较近的亲缘关系。对不同着色的果皮中的DFR基因表达进行分析发现,绿色果皮中表达量较高,而黄色果皮中表达量较低,暗示DFR调控花色苷合成的功能待深入研究。     

金鱼草丙二烯环化酶基因AmAOC的克隆及表达分析

作为植物信号分子的茉莉酸(JA)参与植物的发育与代谢过程,丙二烯环化酶(AOC)是JA合成途径的关键酶。在本研究中,利用同源克隆结合RACE技术从金鱼草中克隆AOC基因,命名为Am AOC。Am AOC基因开放阅读框长762 bp,由254个氨基酸残基组成,该基因包含一个Alleneoxcyc结构域,有两个内含子和三个外显子。同源比对分析结果表明Am AOC与其他植物的AOC有较高的同源性。Am AOC基因在不同组织中的表达分析发现金鱼草花中的Am AOC相对表达量较高,不同花期金鱼草RT-PCR表明,花蕾期的Am AOC相对表达量最高,盛花期的不同花器官荧光定量PCR分析表明,金鱼草花筒和花萼中Am AOC相对表达量较高。     

花生mtACP3基因的克隆与表达分析

旨在探究酰基载体蛋白在植物脂肪酸合成途径中的作用机制,本研究采用传统PCR方法从花生中克隆得到了一个线粒体型基因,命名为AhmtACP3。并采用荧光定量PCR技术分析了基因的表达特性。该基因全长为859 bp,开放阅读框ORF为390 bp,开放阅读框对应的基因组序列为543 bp,由2个外显子和1个内含子组成,该基因编码129个氨基酸,理论分子量为14.5345 k D,理论等电点为5.22,可能定位于线粒体上。系统发育分析表明,花生线粒体型ACP蛋白分成2个分支:AhmtACP1和AhmtACP2有较近的亲缘关系,与AhmtACP3亲缘关系较远。荧光定量PCR结果显示,AhmtACP3基因在花中的表达量明显高于其他组织,其次是子叶和根。AhmtACP3基因在种子发育过程中的表达量呈现下降趋势。     

乌桃果胶裂解酶基因(PpPL)的克隆及其在花色苷降解中的作用

花色苷是调控果实着色的主要色素之一,具有多种保健功能。为探索花色苷在乌桃果实成熟过程中的降解与果胶裂解酶的关系,利用已报到的碧桃果胶裂解酶基因序列设计特异引物,从乌桃中克隆出果胶裂解酶基因PpPL,PpPL包括1239bp的开放阅读框,编码413个氨基酸。利用荧光定量PCR检测PpPL在果实不同成熟度及不同组织中的表达,数据显示,乌桃PpPL基因的表达量随着果实的成熟及花色苷的降解呈现递增的趋势,且在果实成熟末期表达量明显增多;不同组织中PpPL基因均有表达,同一成熟度,其相对表达量从少到多依次为:幼果果肉叶幼果果皮茎,推测PpPL可能参与花色苷的降解。     

芒果赤霉素氧化酶基因GA3ox的克隆、表达及亚细胞定位分析

赤霉素3-氧化酶(gibberellin 3-oxidases, GA3ox)是赤霉素(gibberellic acid, GA)生物合成途径中的关键限速酶之一。芒果中GA3ox基因的功能及其表达模式未见报道。本研究利用RACE技术克隆了一个芒果GA3-氧化酶基因(GA3ox),该基因全长cDNA序列为1 680 bp,编码氨基酸381个,开放阅读框(open reading frame, ORF)为1 146 bp,蛋白分子量为42.6 kD,等电点为5.13,不含信号肽,不含跨膜结构域。系统发育树分析发现,该基因编码的蛋白主要与开心果亲缘关系较近,其次为克莱门柚、甜橙、麻疯树等植物。通过拟南芥原生质体亚细胞定位分析发现,该基因主要定位在细胞质中。通过对乔化、矮化芒果品种不同发育时期的叶片的实时荧光定量PCR分析发现,该基因主要在矮化品种中表达量较高,在乔化品种各个时期表达量较低,且差异不大。矮化品种中主要在开花期表达量最高,坐果期7～8周含量最低,但都高于乔化品种的任何取样时期。该基因的克隆和表达分析为下一步功能的研究及其在芒果株形调控分子机制提供理论依据。     

华丽龙胆花青素合成酶GsANS基因的克隆及其表达分析

花青素合成酶(anthocyanidin synthase,ANS)是植物花青素苷生物合成途径末端的关键酶。本研究以华丽龙胆(Gentiana sino-ornata) 5个不同开放阶段(H₁～H₅)花冠及根、茎、叶为试材,采用RT-PCR技术从花冠H₂阶段分离出了华丽龙胆花青素合成酶基因GsANS的全长序列,利用生物信息学软件分析其序列信息,通过RT-qPCR技术分析表达模式。结果显示GsANS开放阅读框为1 086 bp,编码362个氨基酸,含有PcbC结构域和2OG-FeⅡ-Oxy保守结构域。系统进化分析表明,其与三花龙胆花青素合成酶氨基酸序列相似性高达91.23%,亲缘关系最近。对不同开放阶段花冠及根、茎、叶中GsANS的表达模式进行分析,结果显示GsANS在花冠中表达量均高于根、茎、叶中的表达量,同时在花冠发育的H₄阶段GsANS的相对表达量达到最高值,随后降低,推测Gs ANS基因参与华丽龙胆花冠花青素苷的合成。本研究可为解析华丽龙胆花冠中花青素苷生物合成的分子调控机理提供科学依据。     

大豆胁迫相关蛋白GmSAP3基因的克隆和表达分析

胁迫是影响植物生长发育和农作物产量的重要因素.胁迫相关蛋白(stress associated protein,SAP)是一类锌指蛋白,广泛参与植物发育和胁迫响应.为了研究大豆SAP基因的功能,本研究以'商豆1201'为材料克隆了GmSAP3基因,并进行了生物信息学分析,采用RT-PCR分析该基因在大豆不同组织和温度胁迫下的表达模式.结果 表明,GmSAP3基因CDS序列全长为513 bp,编码170个氨基酸,GmSAP3蛋白等电点pI为6.79,分子量为18.30568kD;序列分析发现,GmSAP3含有2个保守结构域(zf-A20和ZnF-AN1),序列比对和进化分析发现GmSAP3与GmSA P26亲缘关系最为接近.RT-PCR结果表明,GmSAP3在大豆不同组织中均有表达,其中根和叶片表达较高;GmSAP3受高温胁迫诱导表达,推测该基因在大豆胁迫响应中具有重要作用.本研究为GmSAP3基因功能研究提供了一定的理论支持.     

木薯MeRSZ21a的克隆、生物信息学分析和表达模式分析

在非生物胁迫过程中,植物中SR蛋白(serine/arginine-rich proteins, SR)发挥着重要作用。本研究利用生物信息学分析方法,对木薯MeRSZ21a基因结构、理化性质、结构域、保守基序、系统进化等方面进行了分析,并分析MeRSZ21a在各组织中的表达,以及胁迫后其剪接模式和表达水平。我们之前的研究表明,木薯MeRSZ21a是SR蛋白家族中RSZ亚家族的成员之一。本研究结果表明MeRSZ21a基因全长为2 263 bp,编码160个氨基酸,蛋白大小为18 kD,属于亲水性碱基蛋白。MeRSZ21a含有RRM和zf-CCHC结构域,与野生大豆亲缘关系最近。在3个木薯品种‘W14’、‘Arg7’和‘Ku50’各组织中,MeRSZ21a在发育前期组织中表达量较低,在成熟的侧芽与叶组织器官中表达量较高。胁迫处理后,MeRSZ21a的转录本及表达量发生较大变化,其中叶片中转录本数均上升,并且对木薯进行不同温度(42℃,-3℃)胁迫处理后,根和叶中MeRSZ21a的表达水平显著性上调,表明在响应胁迫过程中,MeRSZ21a发挥着重要作用。这有助于进一步探索木薯MeRSZ21a在植物响应非生物胁迫中的功能。     

蓝莓3-O-葡萄糖基转移酶基因克隆及生物信息学分析

为研究蓝莓3-O-葡萄糖基转移酶基因(3GT)的性质和功能，探明3-O-葡萄糖基转移酶在花青素合成过程中发挥的作用，以成熟的蓝莓果实为材料，利用同源克隆获得了3GT基因的单一拷贝，运用生物信息学软件分析预测蓝莓3GT的序列特征。结果表明：3GT基因长度为1 371 bp,编码456个氨基酸，位于蓝莓的4号染色体末端，含有3个外显子和2个内含子。蛋白的分子式为C₂₂₇₉H₃₅₂₁N₅₉₅O₆₅₀S₁₅,理论等电点(pI)为6.14。信息分析预测3GT蛋白有37个磷酸化位点，亲水指数小于0为亲水性蛋白，不稳定系数大于40为不稳定蛋白，无跨膜区和信号肽；蛋白质二级结构由α-螺旋(Hh)、延伸链(Ee)、β-转角(Tt)和无规则卷曲(Cc)4种结构形式组成，其中α-螺旋占比最高，达40%;3GT属植物糖基转移酶家族(GTB-型),PSPG结构域中第44位是组氨酸，糖基供体可能为UDP-半乳糖；与猕猴桃亲缘关系最近，同源性为67%;分子对接显示蓝莓3GT与矢车菊素分子存在4种相互作用力；...     

番茄SlWRKY6基因克隆及其在重金属胁迫下的表达分析

为了揭示SlWRKY6基因与植物重金属胁迫的相关性,通过RT-PCR的方法从番茄中克隆得到SlWRKY6基因,该基因序列号为:NM_001365762.1。生物信息学分析结果表明,该基因含有一个长度为1 342 bp的完整开放阅读框,编码447个氨基酸残基。该基因编码的蛋白含有一个WRKY结构域,属于典型的GroupⅡ亚家族成员。系统进化分析表明,与番茄SpWRKY31氨基酸序列之间的亲缘关系最近。组织特异性分析表明,SlWRKY6基因在番茄的不同组织中均有表达,在老叶中表达量最高。实时荧光定量PCR分析结果表明,SlWRKY6基因在3种重金属(CdCl_2、CuCl_2、HgSO_4)胁迫下均上调表达,且在Cd和Cu胁迫下番茄根部的表达量较高。CdCl_2胁迫下,SlWRKY6基因在番茄根中受胁迫诱导显著高于叶中;CuCl_2胁迫下,番茄叶中SlWRKY6基因表达量在3 h时达到最大值后降低,而根中的SlWRKY6基因水平随着浓度增加而下降;HgSO_4胁迫下,根部和叶片该基因的表达量显著高于对照(0 h),并随着HgSO_4胁迫时间延长,SlWRKY6基因相对表达量在番茄根和叶中呈现相反的趋势。综上,本研究获得了SlWRKY6基因的编码区序列,并初步阐述了番茄SlWRKY6基因在3种重金属胁迫下的表达情况,为筛选番茄中响应重金属胁迫功能基因的研究提供了研究基础。     

马铃薯甲基转移酶基因StDRM2的克隆及表达分析

DNA甲基化对植物的生长发育至关重要,DNA甲基转移酶建立和维持着DNA甲基化,其中结构域重排甲基转移酶DRM2催化非对称位点的从头甲基化。为了初步探究马铃薯StDRM2基因的功能,本研究利用同源克隆基因技术从马铃薯‘青薯9号’中克隆了StDRM2基因,利用Gateway技术构建过表达载体,农杆菌遗传转化马铃薯‘大西洋’,获得5株转基因马铃薯苗。利用qRT-PCR技术测定StDRM2基因在转基因马铃薯及其不同组织(根,茎,叶)中的表达量。结果表明,StDRM2基因CDS序列全长1812 bp,编码603个蛋白质氨基酸。系统发育进化树分析表明,StDRM2与茄科作物的番茄亲缘关系最近;qRT-PCR表明转基因马铃薯中的StDRM2基因表达量显著上调,最高相对表达量是野生型马铃薯的6.77倍。StDRM2基因在转基因马铃薯根、茎、叶中均有表达,其表达量不同且差异显著(P<0.05),其中根中的表达量最高,茎中的表达量最低。本研究中转基因马铃薯的获得为研究StDRM2功能提供试验材料,组织表达模式分析为进一步了解StDRM2基因功能和作用机制提供理论依据。     

马铃薯野生种CHS基因cDNA的克隆与表达分析

设计简并引物,用RT-PCR法从马铃薯野生种(Solanum pinnatisectum)克隆到了CHS(Chalcone synthase,查尔酮合酶)基因的全长cDNA,并用半定量RT-PCR法进行了表达分析.序列分析表明,CHS基因编码一个389个氨基酸残基的多肽,在氨基酸水平上与其他茄科植物的同源性达到89%～93%,多重比较和系统发育分析均表明该基因为CHS家族中的一个新成员;检测了CHS基因的空间表达模式,该基因在花和匍匐茎中表达量最高,在根和块茎中没有检测到,这与花和匍匐茎呈淡紫色有花色苷合成,而根和块茎呈白色无花色苷合成是相一致的;发现在块茎中CHS受光诱导表达,光照后的第3天表达量最高,而在光照前检测不到,光照前块茎为白色,随着光照时间的延长,其表层颜色因积累花色苷而变成紫红色.