东农冬麦1号TaPRK基因的生物信息学分析及低温和ABA、SA、MeJA对其表达模式的影响

磷酸核糖激酶(PRK)是卡尔文循环的关键酶,在调节糖代谢过程中起着关键作用。为探索TaPRK在小麦抗逆过程中的功能,以强抗寒冬小麦品种东农冬麦1号(Dn1)和弱抗寒冬小麦品种济麦22(J22)为材料,对TaPRK进行生物信息学分析和表达模式研究。结果表明,TaPRK基因含有一个1 215bp开放阅读框,编码404个氨基酸,表达产物为稳定的亲水蛋白,属于尿苷激酶家族,带有叶绿体转运肽,定位于叶绿体。越冬期间,Dn1分蘖节中TaPRK的相对表达量显著高于J22,Dn1叶片中TaPRK的相对表达量在-10℃和-25℃时高于J22,而在0℃时低于J22;外源ABA、SA和MeJA处理下,Dn1分蘖节中TaPRK的相对表达量均随着温度的降低表现为先升后降的趋势,且均在-10℃时达到表达量的峰值;外源ABA和SA处理下Dn1叶片中TaPRK的相对表达量呈现"降-升-降"的变化规律,在-10℃时显著高于对照;外源MeJA处理下,Dn1叶片中TaPRK的相对表达量在0℃和-25℃高于对照,且在0℃达到峰值。总体来说,TaPRK在小麦抗寒方面发挥正向调节作用。外源ABA、SA和MeJA增加了冬小麦TaPRK的表达量,有助于提高冬小麦的抗寒性。     

低温条件下不同抗寒性冬小麦内源激素的变化

为揭示寒冷地区冬小麦内源激素与抗寒能力的关系,以抗寒性强的冬小麦品种东农冬麦1号和抗寒性弱的品种济麦22为试验材料,在田间自然条件下,于越冬前不同降温时期分别对叶片、根系和分蘖节取样,采用酶联免疫吸附(ELISA)法测定和分析了内源激素ABA、IAA、ZR的含量变化.结果表明,两个品种的叶片和根系中的ABA、ZR、IAA的含量随气温的降低均表现为先升高后降低的趋势,但分蘖节中的ABA、ZR含量则持续增加.分蘖节中的IAA含量表现为东农冬麦1号随气温下降而逐渐增加,济麦22则先增后降.两个品种分蘖节中的IAA/ZR值均表现为前期急剧下降,后期趋于平稳.抗寒性强的东农冬麦1号各器官中的ABA、ZR、IAA含量均高于抗寒性弱的济麦22,对冬小麦安全越冬起重要作用的内源激素是ABA.东农冬麦1号分蘖节中的IAA/ZR低于济麦22,其分蘖能力比济麦22强,更利于安全越冬.     

油菜素内酯对低温胁迫下冬小麦wcor413-like基因表达的影响

为探索低温胁迫下油菜素内酯(BR)对冬小麦分蘖节及叶片 wcor413-like基因表达的影响,以寒地冬小麦东农冬麦1号为试验材料,利用RT-PCR法克隆 wcor413-like基因的cDNA序列,用生物信息学法分析该序列的特征,用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测5℃、0℃、-10℃和-25℃四个温度处理下分蘖节和叶片中 wcor413-like基因的表达量。结果表明, wcor413-like基因含有一个629 bp的开放阅读框,可编码209个氨基酸,编码的wcor413-like蛋白为稳定蛋白质,主要分布在细胞质中。qRT-PCR分析表明,在叶片中, wcor413-like基因的表达量随着温度的降低呈现先上升后下降的变化趋势,-10℃时表达量最高;在分蘖节中, wcor413-like基因的表达量随着温度的降低呈持续上升的趋势,-25℃时表达量最高。BR处理后的叶片和分蘖节中, wcor413-like基因的表达量均在-25℃时达到最高,叶片中该基因的表达量显著高于对照组,而分蘖节中该基因的表达量显著低于对照组。推测BR可通过调控叶片和分蘖节中 wcor413-li...     

外源SA对低温胁迫下冬小麦糖酵解代谢的影响

为揭示SA处理对低温胁迫下冬小麦糖酵解（glycolysis,EMP）代谢的影响,以强抗寒性冬小麦品种东农冬麦1号（Dn1）和弱抗寒性品种济麦22号（Jm22）为试验材料,在小麦幼苗三叶期喷施 1 mmol·L^-1 SA,于大田连续10 d自然降温至5、0、-10、-25 ℃时取小麦幼苗叶片和分蘖节,测定其果糖含量、丙酮酸含量及EMP代谢重要酶（己糖激酶HxK、磷酸果糖激酶PFK和丙酮酸激酶PK）的活性和相关基因（TaHxK、TaPFK、TaPK）的表达量。结果表明,SA处理提高了两种冬小麦叶片和分蘖节中果糖及丙酮酸含量,但对Jm22影响较弱;SA处理提高了Dn1叶片和分蘖节中EMP途径关键酶（HxK、PFK和PK）的活性及其相应基因（TaHxK、TaPFK、TaPK）的表达量。SA处理可有效调控冬小麦EMP代谢,促进果糖与丙酮酸积累与分解,提高植物的抗寒性。     

外源ABA对苗期低温下冬小麦蔗糖含量及其关键酶基因表达的影响

为了探讨外源ABA对苗期低温下冬小麦植株蔗糖代谢的调节作用,以抗寒性强的品种东农冬麦1号和抗寒性弱的品种济麦22为试验材料,在三叶期分别于不同温度下经ABA处理48 h后取叶片和地下茎,研究外源ABA对苗期低温下冬小麦的蔗糖含量及蔗糖代谢相关酶基因表达的影响。结果表明,外源ABA处理使低温下抗寒性强的东农冬麦1号中积累了更多的蔗糖,尤其是叶片,而在济麦22中则抑制了蔗糖的积累。4℃以上温度时,外源ABA促进了东农冬麦1号叶片和地下茎中UGP在蔗糖合成中的作用;在4℃以下低温时,外源ABA则促进了UGP在蔗糖分解中的作用。4℃以上温度时,外源ABA提高了东农冬麦1号叶片中Ta SPS基因和地下茎中Ta SAInv基因的表达,而抑制了济麦22各器官中Ta SPS基因和Ta SAInv基因的表达。此外,4℃以上温度时,外源ABA抑制了两个小麦品种各器官中Ta SS基因的表达。表明抗寒性强的东农冬麦1号对外源ABA可能更加敏感,其蔗糖合成能力的提高将有利于冬小麦植株抵御低温,进而维持植株的存活。     

外源ABA对冬小麦叶片抗寒相关蛋白的影响

为了解外源ABA对冬小麦抗寒性的蛋白质组学影响机制,以强抗寒品种东农冬麦1号和弱抗寒品种济麦22为材料,苗期经外源ABA和钨酸钠(ABA合成抑制剂)处理后,分别于18℃、4℃、-6℃和-20℃进行低温胁迫,对小麦叶片的全蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。结果表明,低温下,外源ABA诱导处理后,东农冬麦1号叶片产生23、35和51kD特异蛋白,15、43及53kD蛋白上调表达;济麦22叶片产生28和36kD特异蛋白,15、53及76kD蛋白上调表达。     

外源ABA及其合成抑制剂对冬小麦叶片抗寒指标的影响

为了研究外源ABA及其抑制剂对低温下冬小麦生理生化指标的影响,以冬小麦东农冬麦1号为试验材料,于三叶期分别叶面喷施10 μmol·L^-1 ABA、5 mmol·L^-1 钨酸钠和50 μmol·L^-1 氟啶酮,田间自然降温条件下,分别于10 d平均最低温度达到4、0、-10、-25 ℃时取叶片测定相关生理生化指标。结果显示,随着温度的降低,各处理组小麦叶片的可溶性糖、可溶性蛋白含量先升后降,在0 ℃达到峰值;脯氨酸、丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性逐渐升高。经ABA处理后,小麦叶片的可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸含量及SOD活性显著高于对照组,但不同温度下的变化水平有所差异;MDA含量低于对照组,在0 ℃时差异显著,说明外源ABA可提高冬小麦抗寒能力。两种合成抑制剂处理后,小麦叶片的可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸含量和SOD活性（除0 ℃）均显著低于对照组,MDA含量（除4 ℃）显著高于对照组,说明其对小麦的效应与ABA处理相反,可降低冬小麦抗寒性。钨酸钠处理组各项指标与ABA处理相比变化差异显著,氟啶酮处理组各项指标与ABA处理相比差异极显著,说明ABA在参与冬小麦抗寒性的调控过程中起着重要作用,且氟啶酮对冬小麦抗寒能力影响更大。     

外源MeJA对低温胁迫下冬小麦冷响应基因表达的影响

为了探讨外源MeJA(茉莉酸甲酯)处理对低温胁迫下东农冬麦1号(Dn1)叶片和分蘖节中 TaICE41(CBF表达诱导因子)及4个冷响应基因( Wcor14、 Wcor15、 Wcor18、 Wcor413)表达量的影响,了解Dn1强抗寒性是否与JA(茉莉酸)对CBF途径冷响应基因的调节有关,以Dn1为试验材料,叶面喷施1mmol·L~(-1)MeJA,采用荧光定量PCR法检测低温(5℃、0℃、-10℃和-25℃)胁迫下Dn1叶片及分蘖节中 TaICE41及下游4个冷响应基因的表达量。结果表明,外源MeJA处理提高了低温胁迫下Dn1叶片及分蘖节中上述基因的表达量;-10℃下,Dn1分蘖节中 TaICE41、 Wcor14、 Wcor15、 Wcor18、 Wcor413表达量均达到最高值,处理组依次约为对照组的3.3倍、38.0倍、12.7倍、9.4倍、3.5倍,表明JA对CBF途径冷响应基因的调节与低温胁迫下Dn1的强抗寒性有关;-10℃是Dn1抗寒的重要温度节点,分蘖节是影响其越冬性的主要部位。生物信息学分析及预测表明, TaICE41位于3A染色体上,定位于细胞核内,表达产物为无规则卷曲型蛋白,属于HLH蛋白家族成员,与节节麦的ICE1蛋白亲缘关系最近。本研究可为解析激素JA调控植物抗寒性的分子机制提供理论依据。     

外源6 BA对小麦种子萌发及越冬期植株冻害的缓解作用

为了解外源6-BA缓解越冬期间冬小麦植株冻害的生理机制,以冬小麦品种东农冬麦1号和济麦22为材料,研究了不同浓度外源6-BA处理对冬小麦种子萌发及越冬期间植株膜质过氧化及内源激素的影响.结果表明,外源6-BA提高了两个小麦品种的种子发芽势,且对东农冬麦1号影响明显大于济麦22;10μmol·L-1 6-BA处理显著提高了东农冬麦1号的发芽率,减缓其分蘖节的膜质过氧化.外源6-BA增加了低温后期(12月19日即温度低于-25℃时)济麦22的叶片相对电导率、低温中后期11月4日后即温度低于一10℃时东农冬麦1号分蘖节中ABA含量和ABA/GA值,降低了两个品种植株GA含量及低温中后期东农冬麦1号叶片中ABA含量和ABA/GA值,而对济麦22植株内源激素没有显著影响.说明在越冬期间10 μmol·L-16-BA处理可促进种子发芽,调节分蘖节内源激素和膜脂过氧化作用,提高东农冬麦1号抵御低温的能力.     

外源ABA对冬小麦越冬期呼吸代谢关键酶与糖代谢的影响

为探讨外源ABA对低温胁迫下冬小麦幼苗呼吸代谢的影响,以抗寒品种东农冬麦1号和冷敏感品种济麦22为材料,测定和分析了小麦三叶期叶面喷施ABA(浓度10-5 mol·L-1,剂量为每4 m2喷施1 L)后越冬期叶片和分蘖节在低温胁迫下碳水化合物含量、糖酵解代谢酶及三羧酸循环代谢酶活性的变化.结果表明,越冬期间随温度的降低,两个小麦品种的叶片和分蘖节中可溶性总糖和淀粉含量先升后降;参与糖酵解代谢的丙酮酸激酶、己糖激酶、磷酸果糖激酶及三羧酸循环代谢酶的活性在对照叶片中均先升后降,但在分蘖节中的变化则不尽相同.外源ABA处理使低温下两个小麦品种叶片和分蘖节积累更多的可溶性糖和淀粉,并且不同程度地提高了两个品种叶片及分蘖节中丙酮酸激酶、己糖激酶及磷酸果糖激酶的活性,尤其在最低温-25℃时明显抑制这几种酶活性的降低,这种影响在抗寒性强的东农冬麦1号中更明显;在低温胁迫后期抑制了三羧酸循环代谢酶和丙酮酸脱氢酶活性的降低,使其保持在相对较高的水平.外源ABA对碳水化合物积累的促进作用有利于植株呼吸和ATP合成维持在较高水平,进而提高低温下植株存活能力.     

寒地冬小麦不同品种越冬期组织结构的差异

冻害在冬小麦越冬期间能影响小麦的生长发育,并导致减产甚至绝产。为深入了解冬小麦的抗寒机制,通过调查统计以及显微观察,比较了冬小麦不同抗寒性品种东农冬麦1号(强冬性)、Nostar(半冬性)和济麦22(弱冬性)在黑龙江等高寒地区越冬期间分蘖节形态结构和显微结构的差异。结果表明,具有不同枯死度、返青率的冬小麦品种的生活习性、冬前分蘖、叶距、叶宽和分蘖节维管束的分布比例皆存在显著性差异。东农冬麦1号冬前分蘖数、返青率、分蘖节维管束分布比例较高,枯死度、叶距、叶宽较小,生长锥下方的15层细胞较小,组织结构紧密,生长锥外形为敦胖形;东农冬麦1号和Nostar在越冬前维管束组织较完整,济麦22的维管束呈现破损。东农冬麦1号返青率与冬前分蘖数、维管束比例呈极显著正相关,而与其他指标呈显著负相关。     

低温胁迫下冬小麦JA合成相关基因的研究

植物激素JA在植物响应低温胁迫中发挥重要的作用。本课题组前期研究发现,东农冬麦1号(Dn1)的强抗寒性与JA信号转导有关,为了探讨Dn1抗寒性的提高是否与内源JA合成基因的表达有关,以Dn1为试验材料,外施MeJA处理,对不同温度胁迫下JA合成基因(TaLOX1、TaLOX2、TaLOX3、TaAOS、TaAOC、TaOPR2、TaLOX2A、TaLOX2B和TaLOX2D)的表达量进行实时荧光定量分析,并结合生物信息学分析对TaLOX2A、TaLOX2B和TaLOX2D蛋白功能进行预测。结果表明,低温胁迫提高了Dn1分蘖节中TaLOX1、TaLOX3、TaAOC和TaOPR2的相对表达量,在-10℃表达量达到最大值;外源MeJA处理显著提高了0℃下分蘖节中TaLOX1、TaLOX2、TaLOX3、TaAOS、TaAOC的相对表达量;TaLOX2A、TaLOX2B和TaLOX2D基因均位于小麦5号染色体上,编码的蛋白均定位于细胞质中,属无规则卷曲蛋白,结构相似,保守结构域相同,蛋白功能相同或相似。本研究为进一步揭示JA合成基因在冬小麦响应抗寒中的作用奠定了基础。     

冬小麦miR172响应抗寒的特征分析

东农冬麦1号（Dn1）是我国首个能在黑龙江省高寒地区安全越冬的强抗寒冬小麦品种。为了解tae-miR172在Dn1抗寒中的调控机制，本研究克隆了Dn1中tae-miR172的前体pre-tae-miR172，根据生物信息学分析预测其靶基因为AP2dn1(TraesCS5D02G486600)。通过农杆菌介导的烟草瞬时表达试验，进一步证明tae-miR172靶向AP2dn1；利用qRT-PCR技术对大田越冬期Dn1分蘖节中pre-tae-miR172和Ap2dn1的相对表达量进行分析。结果表明，pre-tae-miR172的表达量随温度降低呈先升后降的变化趋势，而靶基因Ap2dn1的表达量变化趋势则相反，说明tae-miR172负调控Ap2dn1的表达。     

不同类型小麦品种孕穗期低温生理反应及其抗寒性分析

为明确冬小麦抗低温倒春寒的生理机制,以多穗型小麦品种济麦22、邯6172和大穗型小麦品种临麦4号、潍麦8号为材料,研究了孕穗期低温(1℃、-2℃)对小麦叶片可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸和丙二醛(MDA)含量以及超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响。结果表明,在低温处理当天,1℃低温下,4个品种的可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸和MDA含量均不同程度增加,SOD活性除济麦22外均提高;-2℃低温下,可溶性糖和脯氨酸含量增加更明显,SOD活性除临麦4号外均降低,各品种MDA含量均显著减少。低温处理第3d和第6d,低温最初诱导产生的脯氨酸逐渐减少,MDA含量大幅降低,其余指标均增加。经用隶属函数法综合分析,4个品种的抗寒性相近,穗型间差异不明显。     

低温驯化及封冻后不同抗寒性小麦品种细胞超微结构的比较

为分析不同抗寒性小麦品种在低温胁迫下细胞超微结构的差异,以抗寒品种东农冬麦1号和对照济麦22为材料,分别在低温驯化期和封冻期用透射电镜观察两个品种分蘖节和叶片的细胞超微结构。结果表明,低温驯化期（11月2日）两个品种分蘖节的细胞超微结构均没有受损。抗寒品种东农冬麦1号分蘖节细胞内有少量质体,且分蘖节的液泡占整个细胞的比例较济麦22小;封冻后10 d,济麦22分蘖节发生严重的质壁分离,线粒体外膜不再清晰,而东农冬麦1号分蘖节内除有的线粒体内外脊不再清晰外,其他细胞器官没有明显变化。封冻后30 d东农冬麦1号发生轻微的质壁分离,细胞核完整,线粒体膜不清晰;济麦22分蘖节细胞内含物基本没有,细胞空泡化。调查期内,济麦22叶片的叶绿体紧贴细胞壁排列,细胞内有较大的中央大液泡,11月2日叶绿体内出现拟脂颗粒,封冻后30 d叶片细胞基本空泡化;东农冬麦1号有一部分叶片细胞的叶绿体在细胞中部聚集,调查期内未见叶绿体内出现拟脂颗粒,封冻后30 d线粒体出现破损,叶绿体排列不再规则,但细胞核仍然清晰。     

冬小麦lncRNA1808调控PPP限速酶（Ta6PGDH）抗寒应答研究

为探索lncRNA1808调控Ta6PGDH应答寒胁迫的机制,以冬小麦品种东农冬麦1号（Dn1）为材料,应用生物信息学分析了lncRNA1808和Ta6PGDH的生物学特性和功能,预测了lncRNA1808-Ta6PGDH互作关系和共表达趋势;应用real-time PCR鉴定小麦分蘖节和叶片的lncRNA1808和Ta6PGDH寒胁迫下表达谱变化。结果显示,lncRNA1808为lncRNA,不具备编码能力,富含稳定的茎环结构;lncRNA1808与Ta6PGDH的启动子序列含多种响应环境因子的顺式作用元件;预测lncRNA1808-Ta6PGDH互作并协同共表达;Dn1分蘖节和叶片的lncRNA1808和Ta6PGDH的表达谱与协同共表达分析一致,表达趋势上调。本研究初步揭示了冬小麦lncRNA1808调控PPP限速酶Ta6PGDH的抗寒应答机制。     

低温驯化及封冻阶段不同冬小麦品种叶绿素荧光参数的比较

为了解小麦品种的抗寒机制,对抗寒品种东农冬麦1号和对照品种济麦22在低温驯化及封冻阶段植株的叶绿素荧光参数进行测定和分析.结果表明,低温驯化阶段对照品种济麦22新叶的最大荧光产量(Fm)、PSⅡ最大量子产量(Fv/Fm)、实际量子产量(yield)、光化学淬灭(qP)显著高于东农冬麦1号,低温驯化结束后济麦22的这些参数迅速降低,显著低于东农冬麦1号新叶相应的值;调查期内东农冬麦1号新叶的初始荧光(Fo)变化稳定,降幅为26.2%,济麦22新叶Fo的降幅为52.8%;两品种老叶的荧光参数值变化趋势接近一致,低温驯化结束后东农冬麦1号老叶的Fm、qN、qP值显著高于济麦22老叶相应的值.在生产上可以利用叶绿素荧光参数对品种抗寒性进行鉴定,鉴定时期为低温驯化期结束、封冻期开始时,鉴定的部位应为植株新叶.     

冬小麦miR398前体的克隆及其在低温条件下对靶基因CSD1表达的调控

miR398是受逆境胁迫负调控的miRNA,其靶基因CSD编码超氧化物歧化酶(SOD),使植物抵御活性氧(ROS)的毒害。为进一步了解低温胁迫下miR398的调控机制,从东农冬麦1号中克隆小麦miR398前体,构建过表达载体并转化拟南芥,用Real-time PCR检测T0代植株中小麦miR398及其靶基因CSD1在低温胁迫下的表达量。结果表明,随着低温胁迫时间的延长,miR398表达下调、CSD1基因表达上调,认为小麦miR398能响应低温胁迫、负调控CSD1基因表达,间接提高了拟南芥的抗寒性。     

冬小麦抗寒性鉴定的低温处理方式和鉴定指标的研究

为了筛选冬小麦抗寒性鉴定的低温处理方式和鉴定指标,以冬小麦强抗寒品种东农冬麦1号、弱抗寒品种济麦22和不抗寒品种中国春为试验材料,设室内快速低温、室内缓慢低温和田间种植三种处理,测定和分析了不同处理下小麦叶片超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性及抗坏血酸(ASA)、谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、过氧化氢(H2O2)含量.结果表明,与室内缓慢低温处理相比,室内快速低温处理下小麦各项指标较接近田间种植处理,且与田间种植处理相关性较显著.低温下抗寒品种的H2O2及MDA含量显著低于弱抗寒品种和不抗寒品种,SOD活性和ASA含量与H2O2含量呈极显著负相关.因此,室内快速低温处理结合SOD活性及ASA、H2O2和MDA含量分析可以进行小麦品种抗寒性鉴定.