苹果MdMYB2基因对非生物胁迫的响应

为阐明苹果(Malus×domestica)R2R3-MYB转录因子基因MdMYB2在非生物胁迫条件下的生物学功能,对MdMYB2的启动子序列进行分析,发现其含有非生物胁迫相关顺式作用元件,且MdMYB2的表达量受外源ABA、聚乙二醇(PEG)和4℃低温的诱导。在不同处理对MdMYB2过表达拟南芥植株和MdMYB2过表达苹果愈伤组织的试验中发现,外源ABA处理抑制了MdMYB2转基因拟南芥种子的萌发,且转基因幼苗提高了对ABA的敏感性、耐旱性和抗冷性。同时,过表达MdMYB2的苹果愈伤组织也表现出对ABA敏感、耐旱和抗冷的表型。以上结果说明MdMYB2在植物的逆境胁迫响应中发挥重要作用。     

苹果乙烯响应因子基因MdERF11对脱落酸的敏感性分析

以‘嘎拉’苹果(Malus×domestica Borkh.)为试材,克隆了乙烯响应因子基因MdERF11(序列号MDP0000756341)。测序发现,该基因包含全长为483 bp的完整开放阅读框,编码161个氨基酸。系统进化树分析表明,这一乙烯响应因子与拟南芥AtERF11蛋白同源序列相似性最高。利用PlantCare数据库进行基因启动子顺式作用元件预测,MdERF11启动子序列中含有与脱落酸(ABA)、乙烯及干旱信号相关的顺式作用元件。荧光定量PCR分析表明,MdERF11在苹果的各组织中均有表达,在叶柄和果实中表达量相对较高;并且MdERF11的表达明显受到ABA的诱导。在外源ABA的处理下,MdERF11过量表达的苹果愈伤组织的生长势明显比野生型强,表明MdERF11降低了苹果愈伤组织对ABA的敏感性。     

苹果U-box型E3泛素连接酶MdPUB24的耐盐性和ABA敏感性鉴定

从‘皇家嘎拉’苹果(Malus×domestica Borkh.)中克隆了一个E3泛素连接酶基因(序列号:MDP0000199588)。基因序列测序发现,该基因包含长为1 212 bp完整的开放阅读框,编码404个氨基酸。系统进化树分析表明,这一E3泛素连接酶与拟南芥At PUB24同源序列相似性最高,因此将其命名为MdPUB24。利用Plant Care数据库进行启动子顺式作用元件预测分析表明,MdPUB24启动子序列中含有与脱落酸、光、茉莉酸及干旱信号相关的顺式作用元件。荧光定量PCR分析表明,MdPUB24在‘皇家嘎拉’苹果的不同组织中均有表达,且在叶片中最高;外源ABA、NaCl和低温胁迫处理能够抑制‘皇家嘎拉’苹果组培苗中MdPUB24的表达。MdPUB24过量表达的‘王林’苹果愈伤组织和异位表达的拟南芥幼苗在盐胁迫条件下,生长势与野生型相比明显变弱,表明MdPUB24负调控盐胁迫。相反,在外源ABA处理条件下,MdPUB24过量表达苹果愈伤和异位表达拟南芥与对照相比,生长势明显增强,表明MdPUB24对ABA不敏感。     

苹果生长素阻遏蛋白基因MdIAA26的分子克隆与功能鉴定

从‘皇家嘎拉’苹果（Malus × domestica Borkh.）中克隆了一个生长素阻遏蛋白家族基因（基因序列号MDP0000164095）。测序发现,该基因包含长为978 bp完整的开放阅读框,编码325个氨基酸。系统进化树分析表明,这一生长素阻遏蛋白与拟南芥IAA26同源序列相似性最高,因此将该基因命名为MdIAA26。利用PlantCare数据库进行基因启动子顺式作用元件预测分析发现,MdIAA26启动子序列中含有与脱落酸（ABA）、赤霉素（GA）、水杨酸（SA）及干旱信号相关的顺式作用元件。荧光定量PCR分析表明,MdIAA26在苹果的各组织中均有表达,在根和叶片中表达量相对较高;苹果组培苗中MdIAA26的表达明显受到ABA和IAA的诱导。MdIAA26过量表达的苹果愈伤组织在外源ABA处理下和MdIAA26异位表达拟南芥在外源ABA、PEG和IAA处理条件下,生长势均明显比野生型对照强,表明MdIAA26降低了对ABA和IAA的敏感性和对干旱的抗性。     

苹果乙烯响应因子基因MdERF11对脱落酸的敏感性分析

以‘嘎拉’苹果（Malus × domestica Borkh.）为试材，克隆了乙烯响应因子基因MdERF11（序列号 MDP0000756341）。测序发现，该基因包含全长为483 bp的完整开放阅读框，编码161个氨基酸。系统进化树分析表明，这一乙烯响应因子与拟南芥AtERF11蛋白同源序列相似性最高。利用PlantCare数据库进行基因启动子顺式作用元件预测，MdERF11启动子序列中含有与脱落酸（ABA）、乙烯及干旱信号相关的顺式作用元件。荧光定量PCR分析表明，MdERF11在苹果的各组织中均有表达，在叶柄和果实中表达量相对较高；并且MdERF11的表达明显受到ABA的诱导。在外源ABA的处理下，MdERF11过量表达的苹果愈伤组织的生长势明显比野生型强，表明MdERF11降低了苹果愈伤组织对ABA的敏感性。     

葡萄PYL基因家族的鉴定与表达分析

【目的】通过分析葡萄(Vitis vinifera L.)PYL基因在非生物胁迫条件下的响应情况,丰富PYR/PYL/RCAR(Pyrabactin Resistance/Pyr1-Like/Regulatory Components of ABA Receptor)在ABA信号和启动信号转导中的功能。【方法】利用生物信息学方法,筛选葡萄中的PYL基因,并对其进行生物信息学及非生物胁迫下的响应分析。【结果】从葡萄基因组中共鉴定出6个PYL基因,Vv PYL家族无染色体偏好性,Vv PYL5无内含子结构;除Vv PYL4外均富含酸性氨基酸,该家族成员主要定位于细胞质中,并有多个保守位点。10%(ω)PEG和100μmol·L~(-1)ABA处理6 h后,Vv PYL1和Vv PYL2表达水平与对照相比差异显著,分别为对照的1.3~1.8倍。50μmol·L~(-1)ABA处理6 h后,Vv PYL1表达水平与对照差异显著,为对照的1.5倍;400 mmol·L~(-1)Na Cl、10%PEG、50μmol·L~(-1)ABA和100μmol·L~(-1)ABA处理24 h后,Vv PYL1和Vv PYL2的表达水平显著高于对照,为对照的1.2~2.2倍,400 mmol·L~(-1)Na Cl处理24 h后,Vv PYL6的表达水平显著高于对照,为对照的1.6倍。【结论】克隆得到葡萄的6个PYL基因,高度保守,分为3个亚组;能够响应不同非生物胁迫。本研究为葡萄PYL基因在逆境应答中的功能研究提供了基础。     

山葡萄VaCBL6参与非生物胁迫和ABA途径的响应

对山葡萄(Vitisamurensis)‘左山–1’中的1个类钙调素磷酸酶B亚基蛋白基因VaCBL6进行克隆及功能分析。VaCBL6位于第4条染色体,开放阅读框为777 bp,编码258个氨基酸;结构域分析表明,该蛋白包含4个EF-hand与1个跨膜结构域;蛋白进化树分析表明,VaCBL6与欧洲葡萄VvCBL9和VvCBL6相似性较高,分别为98.84%、94.96%。VaCBL6编码蛋白定位于细胞核与细胞膜。VaCBL6在根与卷须中有较高的表达,且其表达受低温、干旱、NaCl和ABA的诱导。基于酵母体系的转录激活分析表明,VaCBL6无转录激活活性。100～125μmol·L~(-1) NaCl和0.25～1.25μmol·L~(-1) ABA处理均抑制了VaCBL6转基因拟南芥种子的萌发,且转化拟南芥幼苗对NaCl与ABA的敏感性提高。以上结果说明VaCBL6在植物的逆境胁迫应答中具有重要作用。     

ABA和乙烯互作调控葡萄VlMybA1和VlMybA2表达并促进果皮着色

以‘巨峰’葡萄(Vitis vinifera×V. labrusca‘Kyoho’)为试材，研究了不同发育阶段果实花青素和ABA积累和乙烯释放的变化模式，及其与其合成或调控关键基因表达量的变化。基因表达、启动子响应和相对丰度分析表明，外源ABA处理上调了VlMybA1和VlMybA2表达，其中VlMybA1显著表达，促进果皮着色；外源ACC处理显著上调了Vl Myb A2表达，促进果皮着色。ABA和乙烯存在互作，100μmol·L^-1的外源ABA处理能够大幅度诱导内源乙烯的释放，500μmol·L^-1的外源ACC处理能够显著提高内源A BA含量；外源ABA处理能通过提高果皮内源乙烯释放水平增加VlMybA2的相对丰度。总之，ABA能直接调控VlMybA1表达，通过乙烯间接调控VlMybA2表达，促进葡萄果皮着色。     

苹果细胞分裂素氧化酶基因MdCKX7.2的克隆及抗性鉴定

采用同源克隆和PCR技术从‘嘎拉’苹果(Malus×domestica Borkh.)中克隆细胞分裂素氧化酶基因MdCKX7.2(基因序列号:MDP0000279125)。该基因含有1 542 bp的完整开放阅读框,编码513个氨基酸。利用Plant CARE数据库对MdCKX7.2启动子顺式作用元件进行预测分析,发现MdCKX7.2启动子序列中存在光、干旱、脱落酸、水杨酸、茉莉酸甲酯等响应元件。基因表达分析发现,‘嘎拉’幼苗中MdCKX7.2的表达明显受干旱和ABA的诱导。通过农杆菌介导的遗传转化获得MdCKX7.2转基因拟南芥植株。抗性试验表明,异位表达MdCKX7.2基因明显提高了拟南芥对干旱胁迫的抗性。拟南芥种子萌发试验表明,在拟南芥中异位表达MdCKX7.2提高了植株对ABA的敏感性,种子萌发率和幼苗鲜质量明显下降,与种子萌发相关基因的表达量明显上调。以上试验结果表明,MdCKX7.2在植物非生物胁迫响应中发挥重要作用。     

山梨B-box基因PuBBX24表达特性及其在童期调控中的功能分析

为了解PuBBX24基因在梨生长发育过程中的功能,以山梨(Pyrus ussuriensis Maxim.)实生苗为试材,分离PuBBX24及其启动子序列,qRT-PCR分析PuBBX24在山梨根、茎、花、叶片以及果实中的表达特性,对启动子顺式作用元件进行预测,获得PuBBX24启动子驱动GUS基因表达的转基因拟南芥并进行不同组织、不同生长发育阶段,以及ABA、非生物胁迫和不同光处理下PuBBX24基因启动子活性分析,同时在拟南芥中异源表达PuBBX24并验证其功能。结果表明,PuBBX24在山梨根、茎、叶、花以及果实中均有表达,但在茎中表达量最高,叶片表达量最低,且在由童期向成年期发育的叶片中表达水平逐渐降低。PuBBX24上游启动子序列中包含一系列响应激素、光、胁迫等顺式作用元件。而PuBBX24启动子驱动的GUS基因主要在转基因拟南芥叶片、下胚轴以及萼片中表达,且在叶片中的表达水平随童期向成年期的发育而逐渐降低,在根中表达不均匀,在柱头和花柄中表达水平较低,在角果中未检测到GUS活性。PuBBX24启动子显著响应ABA、光、低温、渗透以及盐胁迫处理,且PuBBX24的过量表达影响了转基因拟南芥植株童期—成年期阶段转变进程。这些结果表明,山梨PuBBX24可能参与ABA、光以及胁迫响应,同时在童期—成年期阶段转变过程中起负调控作用。     

H2S与ABA缓解低温胁迫对黄瓜幼苗氧化损伤的交互效应

为了探明硫化氢（H2S）与脱落酸（ABA）在提高植物耐冷性中的互作关系,以黄瓜幼苗为试材,叶面分别喷施1.0 mmol · L-1硫氢化钠（NaHS,H2S供体）、0.15 mmol · L-1次牛磺酸（HT,H2S清除剂）、50 μmol · L-1ABA、3 mmol · L-1 Na2WO4（钨酸钠,ABA合成抑制剂）、3 mmol · L-1 Na2WO4 + 1.0 mmol · L-1 NaHS、0.15 mmol · L-1 HT + 50 μmol · L-1 ABA及去离子水（H2O）,研究低温（8 ℃昼/5 ℃夜）胁迫下H2S和ABA对黄瓜幼苗活性氧积累及抗氧化系统的影响。结果表明,低温胁迫48 h,NaHS和ABA预处理的幼苗冷害指数显著降低。ABA可以提高L–/D–半胱氨酸脱巯基酶（LCD/DCD）活性及其基因表达量,促进内源H2S产生;NaHS处理的9–顺式–环氧类胡萝卜素双加氧酶（NCED）活性及其基因相对表达也明显增加,内源ABA含量快速升高。低温下NaHS和ABA处理均可减少活性氧积累,提高超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）和谷胱甘肽还原酶（GR）活性与基因相对表达量,增加抗坏血酸（AsA）和谷胱甘肽（GSH）含量及还原型/氧化型抗坏血酸（AsA/DHA）和还原型/氧化型谷胱甘肽（GSH/GSSG）比例,从而减轻低温胁迫对黄瓜幼苗的过氧化伤害。ABA合成抑制剂Na2WO4处理后,H2S对黄瓜幼苗抗氧化能力的促进效应明显减弱;同样,ABA对黄瓜幼苗活性氧的调控作用也被H2S清除剂HT所逆转。可见,H2S和ABA可诱导黄瓜幼苗耐冷性,二者在信号转导过程中存在交互效应和“对话”机制。     

臭氧胁迫及恢复过程中葡萄叶片光系统活性的变化

为探究臭氧（O3）胁迫及恢复过程中葡萄叶片光系统活性的响应,以1年生‘赤霞珠’葡萄（Vitis vinifera L.‘Cabernet Sauvignon’）为试材,设置臭氧 + 弱光（90 nL · L-1 O3 + 10 μmol · m-2 · s-1）、臭氧 + 适光（90 nL · L-1 + 800 μmol · m-2 · s-1）、臭氧 + 强光（90 nL · L-1 + 1 600 μmol · m-2 · s-1）3种处理,均处理3 h,以大气臭氧浓度、适光处理（10 nL · L-1 + 800 μmol · m-2 · s-1）作为对照,分别测定处理后1、5、9和13 h的叶片气体交换参数,同时利用Dual-PAM100荧光仪测定叶片PSⅠ及PSⅡ光系统活性分析臭氧胁迫及恢复过程中光系统活性的响应。结果表明：臭氧胁迫可以降低葡萄净光合速率和气孔导度,同时降低了叶片的Y(Ⅰ)和Y(Ⅱ)值,在相同臭氧浓度下,随着光照增强叶片受到的伤害加大。恢复13 h后,臭氧弱光和臭氧适光处理的叶片净光合速率、Y(Ⅰ)和Y(Ⅱ)值回升,但臭氧强光处理的叶片伤害不断加深,光系统活性不能得到恢复。     

大白菜KASP反应体系的优化与建立

以大白菜基因组DNA为模板,对影响竞争性等位基因特异性PCR（Kompetitive allele specific PCR,KASP）的反应体积、引物浓度和DNA模板用量等3个参数进行优化,建立了适用于大白菜的KASP反应体系。96孔模块最佳反应体系中,总反应体积为8 μL,其中模板DNA（60 ~ 80 ng · μL-1）1 μL,KASP Master mix（2×）4 μL,引物混合物（50 μmol · L-1）0.14 μL,ddH2O 3 μL。384孔模块最佳反应体系中,总反应体积为4 μL,其中模板DNA（60 ~ 80 ng · μL-1）1 μL,KASP Master mix（2×）2 μL,引物混合物（50 μmol · L-1）0.07 μL,ddH2O 1 μL。利用不同引物和不同的大白菜材料对优化的反应体系进行验证,均获得了较好的KASP-SNP分型,验证了该优化体系的稳定性。该反应体系可以用于大白菜遗传多样性研究、基因定位、遗传图谱构建等遗传学研究。     

外源ABA对叶子花开花及内源ABA合成关键酶的影响

以叶子花‘大红宝巾’（Bougainvillea glabra‘Mrs Butt’）为试材,研究外源脱落酸（ABA）对其开花及其生物合成关键酶含量与活性变化的影响。结果表明：外源ABA对叶子花的成花有促进作用;去甲二氢愈创木酸（NDGA）浓度大于10 μmol ? L-1时,ABA的合成明显被抑制,低浓度NDGA与高浓度ABA共同作用反而对内源ABA含量的升高具有增效作用;内源ABA的变化趋势与9–顺式–环氧类胡萝卜素双氧合酶（NCED）含量的变化趋势相一致,表明NCED为ABA生物合成途径中的限速酶;外源ABA使玉米黄质环氧化酶（ZEP）、NCED、ABA醛氧化酶（AAO）含量及活性均明显上升,表明ABA能自我催化调节其合成,且单一酶基因或单一酶促反应并不能合理解释ABA水平的变化,推测ABA信号的作用机制是一个由多酶有机统筹系统控制的结果。     

1-MCP对贮藏苦瓜生理及品质特性的影响

以‘大肉2号’苦瓜为材料,研究不同浓度1-MCP(0、0.25、0.5、1.0μl·L-1)处理后常温(22±2)℃贮藏中苦瓜呼吸强度、可溶性蛋白含量、维生素C(Vc)含量、丙二醛(MDA)含量的变化,以期筛选出保鲜苦瓜果实的最优处理。结果表明:1-MCP处理可明显抑制苦瓜果实的呼吸速率,延缓MDA积累,降低果实可溶性蛋白、叶绿素和Vc含量的损失,推迟苦瓜后熟衰老进程。各试验处理效果依次为:1.0μl·L-1>0.5μl·L-1>0.25μl·L-1>0μl·L-1,以1.0μl·L-11-MCP处理苦瓜保鲜效果最优。常温下,苦瓜果实货架期可达6 d。     

猕猴桃SRAP-PCR体系的建立及品种资源亲缘关系研究

以猕猴桃属（Actinidia Lindl.）不同种幼嫩叶片为材料,建立了基因组DNA提取的改良SDS法,在此基础上采用正交试验设计和单因素分析相结合的方法,建立了适合猕猴桃SRAP分析的优化体系,即在20 μL总的反应体系中包括：DNA（40 ng ? μL-1）1 μL、Taq DNA酶（5 U ? μL-1）0.2 μL、dNTPs（2.5 mmol ? L-1) 1.4 μL、引物（10 μmol ? L-1）各1.5 μL、Mg2+（25 mmol ? L-1）2.0 μL、10× 缓冲液2.5 μL、ddH2O 9.9 μL。利用该体系对32份猕猴桃品种资源进行遗传多样性和亲缘关系分析,结果表明14条引物共扩增出275个多态性位点,多态性百分率为100%,SRAP可以作为猕猴桃资源亲缘关系研究的有效标记;在遗传相似系数0.73水平处,供试材料可区分为4组,分别是中华猕猴桃、美味猕猴桃、黑蕊猕猴桃和毛花猕猴桃组。聚类结果表明中华猕猴桃与美味猕猴桃有着非常近的亲缘关系,毛花猕猴桃与中华猕猴桃之间的亲缘关系较远,黑蕊猕猴桃与美味猕猴桃之间亲缘关系可能较近。     

金冠/中砧1号苹果树耐低铁胁迫的评价

为了对苹果砧木‘中砧1号’耐低铁能力进行评价,本研究以金冠/山荆子为对照,设正常供铁（40 μmol ? L-1）和低铁胁迫（0、4、10、20和30 μmol ? L-1）,着重研究2年生金冠/中砧1号的形态以及生理生化指标的变化。研究表明,金冠/中砧1号在30 μmol ? L-1 Fe时,叶片未出现黄化,且新梢增长量、叶面积以及幼叶叶绿素含量、活性铁含量、光合速率与正常铁处理植株无显著差异;0 ~ 20 μmol ? L-1 Fe水平下,虽然出现黄化现象,但是其各项指标受影响程度均低于金冠/山荆子。金冠/山荆子在30 μmol ? L-1 Fe下15 d严重黄化;0 ~ 20 μmol ? L-1 Fe水平下在秋梢生长期出现了严重的小叶焦梢现象。表明在金冠长期低铁环境下,用中砧1号作砧木能耐30 μmol ? L-1低铁胁迫且生长发育基本正常。     

水杨酸和一氧化氮对姜黄生长及次生代谢产物的影响

以姜黄（Curcuma longa L.）组培苗为试材,在继代培养基中添加不同浓度水杨酸（SA）和硝普钠（SNP,NO供体）,研究SA和NO对姜黄生长、次生代谢和姜黄素类化合物含量的影响。试验结果表明：SA和NO均能调节姜黄的生长,促进姜黄次生代谢产物的生成;SA 10 μmol ? L-1或SNP 200 μmol ? L-1处理时,姜黄叶片叶绿素含量、类胡萝卜素含量和可溶性糖含量均达到最大值,姜黄生长处于最佳状态。SA和NO均能激活苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸–4–羟化酶（C4H）和4–香豆酸：辅酶A连接酶（4CL）活性,促进姜黄次生代谢途径中咖啡酸、对香豆酸、阿魏酸和肉桂酸的生成,提高双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素和姜黄素含量;因此,SA 10 μmol ? L-1或SNP 200 μmol ? L-1最有利于姜黄生长和次生代谢产物的合成。SA和NO对姜黄次生代谢生理调控具有浓度效应。     

不同化学药剂诱导西瓜抗病毒病试验

为了筛选出能够诱导西瓜对病毒病产生一定抗性的化学诱抗剂,在西瓜团棵期开始用硼酸、草酸、水杨酸、壳聚糖、硫酸亚铁、磷酸氢二钾、硅酸钠等7种化学药剂在西瓜作物上进行对病毒病的诱导抗性试验。结果表明,1 g·L-1壳聚糖、5 g·L-1硫酸亚铁和1 g·L-1草酸处理均可使西瓜对病毒病产生一定抗性,能降低病毒病的发生,病情指数较低;其中1 g·L-1壳聚糖处理防治效果最好,防治效果达69.7%。不同的化学药剂具有不同的诱抗效果,其持续效果也各不相同。     

高锌胁迫对八棱海棠幼苗锌积累、分配与9个MTP基因表达的影响

为了研究高锌(Zn)胁迫下苹果砧木八棱海棠(Malus robusta Rehd.)Zn积累、分配及分子响应机制,以其8叶龄实生苗为试验材料,采用溶液培养法进行不同浓度(4、25、50、100μmol·L~(-1))Zn处理。试验结果表明:过量Zn胁迫严重影响植株生长及Zn的积累与分配,随着Zn处理浓度的升高,八棱海棠幼苗根系中Zn含量显著高于茎和叶;富集系数(BAF)的增大和转运系数(TF)的减小都说明Zn在根系中大量积累,以减轻对地上部的伤害。根据对9个MTP基因的相对表达量以及相关性分析,认为在高Zn胁迫下MTP基因的表达与植株内Zn含量有密切联系。MTP1在茎、叶中显著表达,具有组织特异性。MTPC2-like的相对表达量在4μmol·L~(-1) Zn处理下与根、茎、叶的Zn含量显著正相关,而在较高浓度Zn胁迫下相关性减弱,这说明MTP基因的表达具有浓度效应。