龙眼miR397家族成员分子特性及其在体胚发生早期的表达分析

【目的】探讨龙眼miR397家族成员的分子特性及其在龙眼体胚发生早期的表达模式。【方法】以‘红核子’龙眼胚性愈伤组织为材料,通过对龙眼miR397前体序列二级结构分析、进化树构建、靶基因预测与裂解位点验证、以及龙眼miR397a在龙眼体胚发育早期和不同激素浓度处理下的表达规律进行分析。【结果】龙眼miR397前体序列5端臂上可生成两个序列高度重合的成熟体序列dlo-miR397a和dlo-miR397,二者仅有5端两个碱基TC之间的差异,前体能形成稳定的茎环结构;进化树分析发现龙眼miR397前体与桃、可可、脐橙等亲缘关系较近,处于同一分支,龙眼miR397与拟南芥、甜橙、葡萄等亲缘关系较近,处于较为保守的同一分支,miR397家族成员较前体序列在进化上更为保守。靶基因预测表明龙眼miR397家族主要靶向调控漆酶基因家族和一条姐妹染色单体粘连蛋白(dlo_039206.1)。裂解位点验证发现靶基因姐妹染色单体粘连蛋白的裂解位点,但位于预测区间外。miR397a在体胚发生过程中对于靶基因姐妹染色单体粘连蛋白的调控模式在0～3 d较为一致,均为下调表达,6～12 d为显著上调表达,且二者呈典型的负调控关系。龙眼miR397a在不同浓度2,4-D与GA3激素处理下均出现下调表达趋势,而靶基因姐妹染色单体粘连蛋白则在激素处理下的表达趋势并不明显,可能由于靶向裂解位点在预测区外所致。【结论】龙眼miR397a可能在龙眼体胚发生早期的6～12 d,通过靶向调控姐妹染色单体粘连蛋白影响龙眼体胚发生早期形态建成。龙眼miR397家族在进化上较为保守,其靶基因主要靶向调控龙眼漆酶家族和姐妹染色单体粘连蛋白。龙眼miR397a在不同浓度2,4-D与GA3激素处理下均出现下调表达趋势,表明其在龙眼体胚发生早期可能通过激素信号传导参与龙眼体胚发生早期形态建成。     

miR395分子进化特性及其在龙眼早期体胚发生中的表达分析

【目的】研究miR395的分子进化特性及其在龙眼早期体胚发生中的表达分析。【方法】通过龙眼miRNA文库、转录组数据库和miRBase数据库,得到所有植物miR395家族成员成熟体和前体序列,对其进行序列比对及进化分析、保守性分析、前体二级结构预测、潜在靶基因预测,对龙眼miR395a在龙眼早期体胚发生(SE)阶段的表达模式进行分析。【结果】龙眼miR395家族包含5条前体序列和2条成熟体序列。Mfold预测分析发现,龙眼pre-miR395序列均能形成稳定的发卡结构,其最小折叠自由能ΔG在-44.70～64.80 kal·mol-1,提示与序列长度没有显著相关性。其次,保守性分析显示,植物pre-miR395两端序列较保守,而中间序列不保守;系统进化分析提示,龙眼pre-miR395家族与脐橙、葡萄和苹果的亲缘关系更近。psRNAtarget预测显示,龙眼miR395调控的潜在靶基因主要包含富含亮氨酸重复受体蛋白激酶LRR-RLKs、ATP硫酸化酶APS1、蛋白磷酸酶PP2C、前体RNA蛋白质TSR1同系物TSR1、酮酯酰CoA硫解酶KAT2和EH结构域蛋白EHD1等6个,且都是以裂解靶标的方式进行调控。qRT-PCR分析表明,在龙眼早期体胚发生阶段,miR395a呈上调趋势,且miR395a与APS1呈显著负相关。【结论】龙眼miR395与其他植物miR395功能具有高度保守性和物种特异性,同时龙眼miR395a上调表达可能促进龙眼球形胚的形态建成。     

miR171家族成员分子特性及miR171b调控靶标在龙眼体胚发生早期的表达分析

【目的】研究龙眼miR171家族的分子特性及miR171b调控靶标对GA3、2,4-D的响应和在龙眼体胚发生早期的表达模式。【方法】通过龙眼基因组和转录组数据库筛选得到龙眼miR171成熟体与前体序列,基于邻近法(neighborjoining,NJ)利用MEGA 7.0以及iTOL进行系统发育树的构建以及序列多重比较分析;psRNAtarget预测龙眼miR171家族靶基因,利用改良的RLM-RACE验证靶基因裂解位点;利用qPCR分析不同浓度2,4-D、GA3处理的龙眼胚性愈伤组织(EC)及龙眼体胚发生早期miR171b与其靶基因SCL6(Scarecrow-like)的表达模式。【结果】分子特性分析提示,龙眼miR171各成员之间的进化关系较远,进化来源复杂,进化速率具有差异性;靶基因预测显示miR171家族靶基因主要包括SCL6、SCL15、SCL27、转录剪切体X2和RNA依赖的RNA聚合酶1等;裂解位点验证表明miR171b可以靶向切割SCL6,同时SCL27具有结合位点之外的切割位点。在不同浓度2,4-D和GA3处理下,miR171b与SCL6的表达趋势基本呈现为负调控模式;随着2,4-D浓度的升高,miR171b的转录水平总体呈下调趋势,SCL6的表达量总体呈上调趋势;GA3的存在显著下调miR171b的转录水平,而SCL6的表达量分别在2.5和12.5 mg·L~(-1)GA3时达到最高值和最低值。龙眼早期体胚发生前期(0～6 d),miR171b与SCL6表达模式相似,龙眼早期体胚发生后期(6～12 d),miR171b显著下调,SCL6显著上调,提示大量积累的SCL6对龙眼球形胚(GE)形态建成具有重要作用,而miR171b通过减少转录产物的积累促进SCL6表达。【结论】miR171具有物种间的保守性以及成员间的差异性,同时miR171b及其靶标SCL6通过响应激素调节龙眼早期体胚发生的形态建成。     

龙眼miR166家族的分子进化特性及时空表达分析

为了解miR166基因家族的分子进化特性及其在龙眼不同组织部位的表达规律,对龙眼miR166家族成员的成熟体和前体序列及其进化、前体二级结构预测、靶基因预测以及时空表达模式进行了分析。结果表明:龙眼miR166家族含有12条成熟体序列和7个前体序列(pre-miRNA)。Mfold预测显示pre-miR166家族7个成员的序列均能形成典型稳定的茎环二级结构,成熟序列的碱基保守性高,其他位置的则保守性减弱;它们的最小折叠自由能(ΔG)在–35.30~–83.30kal·mol~(-1)。系统发育进化树分析显示,龙眼pre-miR166家族与葡萄、碧桃的pre-miR166亲缘关系更为接近。靶基因预测显示,龙眼miR166基因家族靶基因包括同源异型域—亮氨酸拉链蛋白、三角状五肽重复结构蛋白、假定蛋白、DNA指导的RNA聚合酶Ⅲ亚单位RPC2、紫外线B受体等。实时荧光定量PCR显示,pre-miR166家族不同成员在龙眼生长发育进程中均有表达且表达模式不尽相同,提示其可能广泛参与龙眼各个器官的调控,且在功能上可能具有分工。     

龙眼miR172家族成员进化特性及其时空表达分析

【目的】研究龙眼miR172家族的进化特性及其在龙眼不同组织部位中的表达模式。【方法】采用生物信息学分析及实时荧光定量PCR的方法,对龙眼miR172家族5条前体(pre-miR172)序列及1条成熟体序列进行分析,并预测其前体二级结构,构建系统发育进化树,预测靶基因及分析不同组织部位的定量表达情况。【结果】对龙眼miR172家族5条前体序列进行多序列比对,发现miR172家族两端相对保守,中间区域则形成各自的特异性区域。对miR172家族5条前体及1条成熟体进行多序列比对,发现6条序列间存在1个约20个碱基的保守区域,推测该区域可能为miR172家族成熟体所在区域。Mfold软件预测结果显示,pre-miR172家族成员均能形成典型的茎环二级结构,其最小折叠自由能为-35.80~-54.45 kal·mol-1,较为稳定。系统发育进化树结果显示,龙眼pre-miR172家族成员与甜橙、毛果杨等植物的miR172亲缘关系较近。靶基因预测结果显示,龙眼miR172a的靶基因包括AP2、蝶呤型钼辅因子(molybdopterin cofactor)、谷氨酰-t RNA(glutamyl-t RNA)、假定蛋白(hypothetical protein)等。实时荧光定量PCR结果显示,miR172家族各成员在龙眼不同组织部位中的表达模式总体相似,均在叶芽和生殖生长阶段中大量表达,在营养生长阶段及果实中表达量则较低,但dlo-miR172-scaffold4293特异地在叶片中高表达。【结论】龙眼miR172家族在进化过程中保守性与特异性并存,且可能参与了龙眼部分器官的形成及发育过程。     

miR168家族进化特性及其在砂梨休眠期的表达模式分析

为了探究miR168家族的进化特性及其在梨休眠进程中的表达模式,通过检索实验室前期构建的砂梨（‘黄花’梨）miRNA文库、转录组数据库和miRBase数据库,得到植物miR168家族成员的成熟体和前体序列。从‘黄花’梨花芽中克隆了两条miR168前体,发现梨miR168家族包含2条前体序列和4条成熟体序列。采用生物信息分析和实时荧光定量PCR(qRT-PCR),对梨miR168家族的成熟体序列及前体（pre-miR168）序列进行分析,与已知植物miR168构建系统发育进化树,预测其靶基因,分析其在梨休眠发生进程中的表达情况。结果表明,梨pre-miR168序列均能形成稳定的发夹结构;植物pre-miR168两端序列较保守,而中间序列不保守;mi168成熟体保守性较高,进化树分析表明梨pre-miR168与苹果的亲缘关系最近,miR168成熟体主要分为两大类。梨miR168调控的潜在靶基因主要包含Argonaute1蛋白基因（protein argonaute 1,AGO1）和胼胝质合成酶3基因（callose synthase 3,CalS3）共21条mRNA,都是以裂解靶标的方式进...     

龙眼胚性愈伤组织AGO10基因克隆及其表达分析

【目的】探究龙眼胚性愈伤组织Argonaute10(AGO10)基因的特性与龙眼生长发育、激素响应及非生物胁迫响应之间的关系。【方法】根据龙眼胚性愈伤组织转录组数据库Unigene序列,采用RT-PCR结合RACE技术,以‘红核子’龙眼胚性愈伤组织cDNA为模板,进行龙眼胚性愈伤组织DlAGO10基因的克隆和生物信息学分析,同时利用qRTPCR技术分析DlAGO10基因在龙眼体胚发生过程中、不同组织部位中、对不同激素的响应以及非生物胁迫响应的表达情况。【结果】获得龙眼DlAGO10基因的c DNA全长序列(GeneBank登录号为MH708535),全长共3 859 bp,其中包含完整开放阅读框(ORF)3 003 bp,编码999个氨基酸。生物信息学分析表明,DlAGO10的保守结构域具有AGO的经典结构域PiWi结构,与甜橙和克莱门柚AGO10蛋白同源性较高。qPCR分析结果表明,在龙眼体胚发生过程中,DlAGO10在龙眼非胚性愈伤组织时期和子叶胚时期的表达量较高,在‘红核子’龙眼合子胚S5阶段的相对表达量最高;不同组织部位的表达情况为,DlAGO10在‘红核子’龙眼雌花中表达量最高,雄花次之,其他组织部位表达量均较低。植物激素和非生物胁迫处理下的表达分析表明,一定浓度的2,4-D、KT和水杨酸(SA)均可诱导DlAGO10上调表达,而茉莉酸甲酯(MeJA)即可上调也可下调;盐、渗透、干旱和脱落酸(ABA)胁迫均可上调DlAGO10的表达。【结论】DlAGO10可能参与龙眼体胚发生早期和晚期的转录调控过程,且可能参与生长素、细胞分裂素、SA和ABA的逆境胁迫信号转导途径,调控龙眼多种非生物胁迫应答过程。     

苹果miR396家族鉴定及在不定根发育过程中的表达分析

分析了苹果miR396家族进化特性及其在苹果不定根发育过程中的表达模式。结果表明：苹果miR396家族有4条成熟体和7条前体序列（pre-miRNA）。Mfold预测显示Pre-miR396家族7个成员序列均可形成典型稳定的茎环二级结构，最小折叠自由能介于–62.9 kal ? mol-1（pre-miR396b）~–51.9 kal ? mol-1（pre-miR396g）之间。系统发育进化树分析显示，pre-miR396家族亲缘关系可分为3个亚组（G1、G2、G3），每个亚组内基因数量不同，分别含有11、9、19个。靶基因预测显示，苹果miR396靶基因包括MdGRF1、MdGRF2和MdGRF5等，降解组测序进一步验证了miR396对其候选靶基因MdGRF1、MdGRF2和MdGRF5的剪切关系。苹果miR396家族成员在侧根和果实中的表达量显著高于其他组织，其候选靶基因表达量则在花芽和腋芽中显著高于其他组织；不定根发育过程中，miR396家族不同成员表达模式存在显著差异，整体上呈上调表达趋势，其候选靶基因呈下调表达趋势；外源IBA处理显著诱导miR396家族成员的表达，尤其是在不定根诱导期和根系生长期更为显著。     

苹果miR396家族鉴定及在不定根发育过程中的表达分析

分析了苹果miR396家族进化特性及其在苹果不定根发育过程中的表达模式。结果表明:苹果miR396家族有4条成熟体和7条前体序列(pre-miRNA)。Mfold预测显示Pre-miR396家族7个成员序列均可形成典型稳定的茎环二级结构,最小折叠自由能介于–62.9 kal·mol~(-1)(pre-miR396b)～–51.9kal·mol~(-1)(pre-miR396g)之间。系统发育进化树分析显示,pre-miR396家族亲缘关系可分为3个亚组(G1、G2、G3),每个亚组内基因数量不同,分别含有11、9、19个。靶基因预测显示,苹果miR396靶基因包括MdGRF1、MdGRF2和MdGRF5等,降解组测序进一步验证了mi R396对其候选靶基因MdGRF1、MdGRF2和MdGRF5的剪切关系。苹果miR396家族成员在侧根和果实中的表达量显著高于其他组织,其候选靶基因表达量则在花芽和腋芽中显著高于其他组织;不定根发育过程中,miR396家族不同成员表达模式存在显著差异,整体上呈上调表达趋势,其候选靶基因呈下调表达趋势;外源IBA处理显著诱导miR396家族成员的表达,尤其是在不定根诱导期和根系生长期更为显著。     

龙眼染色质重塑因子Snf2基因家族的进化动力学研究及在体胚发生早期的表达

以龙眼(Dimocarpus longan Lour.)'红核子'品种早期体细胞胚胎发生的胚性愈伤组织(embryogenic callus,EC)、不完全胚性紧实结构(incomplete embryogenic compact structures,ICpEC)和球形胚(globular embryos,GE)为材...     

蕹菜耐受长时间高温后的miRNA分析

miRNA是广泛存在于真核生物体内的一类长度为20～24 nt的小分子非编码RNA,在植物生长发育和逆境适应过程中发挥重要作用。蕹菜(Ipomoea aquatica)可以耐受长时间高温,而其miRNA还未被鉴定,其在耐受长时间高温后的作用还未知。以蕹菜耐热性强的品种‘泰国三叉’和耐热性差的品种‘柳叶’为材料,经42℃高温处理15d后分别构建两个高质量sRNA库,经检测两个库中碱基质量值大于或等于30的序列数量均超过17.3Mb,且‘泰国三叉’中24nt的序列数量远远高于‘柳叶’。与蕹菜转录组比对分析后,分别得到1 363 258和1 629 209条序列,两个库共有的序列仅有1 047 133条(11.36%),说明耐热性不同的蕹菜中s RNA有很大差别。共鉴定出蕹菜中存在71个miRNA,其中差异表达的有22个,通过TargetFinder预测其靶基因,共得到233个靶基因。进一步以耐热性强的品种‘本地三叉’和耐热性弱的品种‘竹叶’为材料研究其在长时间高温后miR160、miR166、miR172、miR393和miR3627前体的差异表达量,结果表明,高温后两品种中pre-miR160-2的表达都显著上调,但是不耐热的‘竹叶’中上调的倍数更多;mi R166在耐热性强的‘本地三叉’中表达量下降,在耐热性较差的‘竹叶’中表达量显著上升;miR172可以被长时间高温诱导,但在耐热性不同的两个品种蕹菜中并没有差异;miR3627的表达量在耐热蕹菜‘本地三叉’中下降,在不耐热蕹菜‘竹叶’中没有明显变化。miRNA前体表达模式的差异说明其在蕹菜耐受长时间高温过程中的作用机制不同。     

低夜温下番茄ABA缺失突变体和野生型叶片中miRNA差异表达分析

为揭示番茄叶片中miRNA对非生物胁迫的响应机制,以番茄ABA缺失突变体sit和野生型番茄RR为试验材料。采用实时荧光定量（qRT-PCR）技术检测叶片中6个miRNA（miR160、miR162、miR166、miR1919、miR397和miR6026）及其预测的靶基因在夜间低温和喷施外源ABA逆境胁迫下的表达情况。结果表明,在15 ℃夜温（对照）下,sit的ABA含量是60 ng · g^-1,RR是120 ng · g^-1,sit叶片的保卫细胞和气孔的开度都明显大于野生型RR,ABA缺失突变体sit中miRNA的表达量与野生型RR相比都显著下调,其靶基因除miR1919外,表达量都上调;夜间低温（6 ℃）处理12 h后,所有miRNA在sit中比RR中的表达量都显著增加;喷施80 mg · L^-1的ABA后,sit中miR162、miR166、miR1919及miR397比0 mg · L^-1 ABA处理的表达量显著上调。推测miR160、miR162和miR6026通过依赖ABA信号途径参与夜间低温胁迫。     

番茄LemiR390及其预测靶基因LeTAS3的鉴定与表达分析

以番茄（Lycopersicon esculentum）紫色花青素积累品系Aft基因型‘LA1996’为试验材料,以番茄总RNA反转录的cDNA文库为模板,根据mirbase数据库中MIR390基因和番茄unigene数据库预测到的靶基因序列,克隆番茄LemiR390前体基因及其预测靶基因LeTAS3;采用定量PCR技术检测LemiR390及其预测靶基因LeTAS3在番茄果实不同发育阶段的表达情况,利用RLM 5′RACE技术验证LemiR390对靶基因mRNA的剪切作用。结果表明,克隆到两个LemiR390的前体,分别与MIR390a和MIR390b一致,含有完整的茎环结构。LemiR390与其靶基因LeTAS3在番茄果实不同发育时期表达量不同,果实发育前期特别是花后1 ~ 2周幼果期表达量高,发育后期均下降为微量表达,并且在幼果期LemiR390与LeTAS3表达呈负调控关系。LemiR390能够靶作用于LeTAS3的转录本调控其降解,其剪切位点为LemiR390序列5′端的第10位碱基。     

拟南芥At-pri-miR828 基因的克隆及其对番茄的遗传转化

 MicroRNA828（miRNA828）是一种新近发现的生物学功能还未全面研究的miRNA。为从 不同角度阐明miRNA828 的生物学功能,从拟南芥中克隆到At-pri-miR828 基因并构建了该基因过量表达 的植物表达载体pC2300-pOT2-At-pri-miR828,通过农杆菌介导的叶盘法将pC2300-pOT2-At-pri-miR828 导入异源植物番茄品种‘Ailsa Craig’中。PCR 鉴定结果显示,外源基因At-pri-miR828 已成功整合到转 基因番茄基因组中,共获得9 个转基因株系,67 株转基因植株。定量PCR 检测结果显示,与野生型番茄 植株相比,转基因植株中miR828 的表达量显著增加,而生物信息学所预测的miR828 靶基因Sly-myb-like1 的表达水平则相应降低。花青素含量测定结果显示,miR828 过量表达的转基因番茄植株花青素含量明显 低于野生型植株,表明miR828 参与了番茄花青素的生物合成调控。     

番木瓜半胱氨酸蛋白酶基因CpCP的分离及表达分析

采用cDNA-AFLP技术分离了一个与番木瓜果实成熟衰老相关的差异片段,经生物信息学分析证实该片段属于半胱氨酸蛋白酶（Cysteine Protease,CP）基因。将差异片段序列在NCBI中的番木瓜基因组序列中搜索,获得了半胱氨酸蛋白酶基因DNA序列。设计开放型阅读框上、下游引物,以木瓜果肉RNA逆转录的cDNA为模板扩增该基因全长cDNA序列,命名为CpCP（登录号：JN689334）。该基因属于C1肽酶家族中的C1A亚家族,编码471个氨基酸,含有家族特有的催化三联体：Cys166-His302-Asn322。Real-time PCR结果显示CpCP在果实中大量表达,是根、茎、叶、花中表达量的几十倍;CpCP受乙烯处理诱导,受1-MCP处理抑制,表达模式与番木瓜果实成熟衰老进程一致,说明CpCP参与了番木瓜果实成熟衰老进程。     

氯酸钾对龙眼成花诱导期叶片和顶芽内源激素含量的影响

对中熟龙眼品种‘凤梨穗’施用氯酸钾（KClO3）配合环割和拉枝措施,诱导其反季节成花,研究龙眼花芽诱导期叶片和顶芽间激素动态变化以及与成花状况之间的关系。结果表明：KClO3提高了叶片中生长素（IAA）含量,降低了顶芽内含量,而KClO3 + 拉枝处理的植株顶芽内IAA含量处于最低水平,且成花率最高,说明顶芽内低含量的IAA有利于成花;KClO3配合环割和拉枝处理分别降低了顶芽内赤霉素（GA3）和脱落酸（ABA）的相对含量,与IAA类似,龙眼的花芽诱导同样需要一个低水平的GA3和ABA的条件;ZT含量变化与以上激素相反,KClO3处理提高了龙眼花芽诱导期顶芽内玉米素（ZT）含量,降低了叶片中其含量,表明顶芽内ZT的增加可能是龙眼反季节成花的主要因素或信号物质,但3种处理的成花率与ZT含量水平并未呈正相关,说明细胞分裂素促进龙眼成花取决于其浓度或水平。     

甜樱桃果实NCED基因的克隆及其表达

为了进一步研究ABA在甜樱桃果实成熟过程中的作用,通过RT-PCR以及RACE-PCR方法从甜樱桃果实克隆得到了ABA合成关键酶NCED基因片段PacNCED1及其3′ 末端序列,从乙烯利处理果实中克隆得到了乙烯合成关键酶ACO基因片段PacACO1。推测的PacNCED1和PacACO1氨基酸序列与其它物种的NCEDs和ACOs氨基酸序列具有很高的同源性。通过半定量RT-PCR及定量RT-PCR方法分析了PacNCED1和PacACO1的表达模式,发现PacNCED1在甜樱桃果实发育的整个过程以及不同部位都有表达,在果肉和种子中的表达不断增加,在果实成熟之前达到最高峰,而在果柄中的表达则在果实完熟时达到最大。PacNCED1在未失水的叶片和根中有微弱表达,但在失水叶片中的表达急剧上升,表现出与失水的相关性。外源ABA和乙烯利能促进PacNCED1在果实中的表达,而NDGA和IAA对PacNCED1在果实中的表达没有显著影响。在甜樱桃果实发育过程中并没有检测到PacACO1的表达信号,但是外源乙烯利和ABA处理能诱导其在果实中的表达。     

正交试验法在龙眼和荔枝组织培养中的应用

利用正交设计试验法研究了椰乳（ＣＭ）、２，４－Ｄ、赤霉素（ＧＡ３）和蔗糖等四个因素及其组合对石硖龙眼和桂味荔枝的幼胚愈伤组织产生的影响，并讨论了正交设计试验法应用于龙眼和荔枝组织培养培养基筛选的可能性。结果表明：１）对龙眼，诱导愈伤组织的最优组合是 ＣＭ １０％、２，４－Ｄ１．０ｍｇ·１－１、ＧＡ３０ｍｇ·１－１和蔗糖３％；对荔枝，最优组合是ＣＭ０％，２，４－Ｄ１．０ｍｇ·１－１，ＧＡ３０ｍｇ·１－１和蔗糖 ５％。 ２）适当的 ２，４－Ｄ浓度（１．０ ｍｇ·１－１）可提高愈伤组织的产量；３）ＧＡ３抑制了龙眼和荔枝的愈伤组织的产生；４）不同树种的胚需要不同的糖浓度；５）适当ＣＭ浓度（１０％）可提高龙眼愈伤组织的产量，而荔枝愈伤组织的产生并不需要ＣＭ。