家蚕滞育卵对盐酸的反应性研究

在25℃保护时间短、尚未完全进入滞育的蚕卵,用一般即时浸酸方法处理,即可使2天孵化率达到90％以上。但保护时间长、完全进入滞育的蚕卵,低浸酸强度下,滞育解除率少,且有一部分已解除滞育卵蚁蚕不能破壳孵化而死亡;高浸酸强度下,一部分已解除滞育的胚胎不能发育到成熟就死亡;加上来自不同母蛾的蚕卵对盐酸的敏感性不尽相同;因此,用一般的浸酸方法处理,难以达到实用孵化的目的。本研究通过特殊浸酸方法,可使在25℃下保护15天和10天、5℃低温冷藏0至50天不等的滞育卵的2天孵化率接近或达到90％。     

适用于实用家蚕品种转基因的蚕卵滞育解除方法

实用家蚕品种转基因是利用分子靶标实现家蚕品种改良与创新的最直接和有效手段,建立高效的适合于转基因显微注射的蚕卵滞育解除方法则是目前家蚕转基因在技术层面尚待解决的关键问题之一。采用早期浸酸、低温催青、复式催青3种方法解除显微注射转基因蚕卵的滞育。结果表明,3种人工处理方法均能解除蚕卵滞育,且获得的非滞育性蚕卵可通过显微注射得到转基因阳性个体,其中采用复式催青法处理的子代蚕卵滞育解除率最高,转基因阳性蛾圈率约25.00%,明显优于低温催青和早期浸酸处理。此外,采用早期浸酸处理,日系品种的蚕卵滞育解除率高于中系品种;采用低温催青和复式催青处理,中系品种子代蚕卵滞育解除率则显著高于日系品种。     

盐酸处理蚕卵酯酶A4的活性变化及其与滞育性的关系

从家蚕C108品种蚕卵精制酯酶A4,首次测定了产卵后24～96h浸酸蚕卵酯酶A4的ATPase活性。蚕卵经盐酸处理后在体外5℃1～2d或体外25℃1～3h出现酶活性峰。与低温活化蚕卵比较,产卵后24～96h的浸酸蚕卵,在体外5℃酶活性峰出现时间提早了8．5～22d,在体外25℃提早了3～9h。浸酸后蚕卵迅速解除滞育,滞育发育时间显著缩短。将不同卵龄未浸酸蚕卵与盐酸处理蚕卵酯酶A4的ATPase活性峰出现时间差制成曲线,在体外5℃或25℃的结果几乎都完全与5℃冷藏时蚕卵的滞育发育时间曲线重叠。盐酸处理蚕卵酯酶A4的活性变化与蚕卵活化有高度相关性。     

合成滞育激素对家蚕卵Gpase、NAD-SDH、PFK、FBP活性的影响

二化性蚕品种大造在高温（25℃）明条件（每日光照18小时）下催青时,全部产滞育卵,在低温（16℃）暗条件（全天黑暗）下催青时全部产非滞育卵。低温暗条件下催青的大造在化蛹第3日注射一定剂量的合成滞育激素,可以诱导其产下70％左右左右的滞育卵。这种由合成滞育激素诱导形成的滞育卵,在滞育期中Gpase,PFK,FBP,NAD-SDH等与碳水化合物代谢相关的酶活性与非滞育卵不同,,但与天然滞育卵相似。只是酶活性和蚕卵解除滞育的时间比天然滞育卵有所提高。     

二化性家蚕卵低温和常温催青的胚胎期蛋白质表达差异分析

家蚕二化性品种的滞育性受上代胚胎期环境条件调控,查找家蚕胚胎期滞育关联蛋白,可为最终阐明家蚕滞育的分子机制提供实验依据。以家蚕二化性品种秋丰的蚕卵为材料,分别在25℃常温和18℃低温条件下催青,提取胚胎不同发育时期蚕卵的易溶性和难溶性蛋白,采用蛋白质双向电泳(2-DE)和图像分析技术,研究蚕卵在胚胎不同发育时期的蛋白质差异表达谱。在易溶性和难溶性蛋白图谱中分别检测到5个和7个差异显著的蛋白点。对这些差异蛋白点进行质谱鉴定,有8个蛋白点得到可信的最佳匹配蛋白报告,共鉴定出卵特异蛋白、卵黄原蛋白、表皮蛋白和丙酮酸脱氢酶激酶4种蛋白。这些差异表达蛋白可能导致蚕卵胚胎中物质代谢和能量代谢的不同,据此推测低温和常温催青可能在蚕卵胚胎中诱导了不同的生理生化反应。     

冷藏期家蚕滞育卵和即时浸酸卵的H2O2含量及过氧化氢酶基因表达的变化

将产下后48h的家蚕滞育卵和即时浸酸卵进行低温(5℃)冷藏处理30d以上,滞育卵孵化率显著上升,而即时浸酸卵孵化率显著下降。为了探讨低温处理对滞育卵和即时浸酸卵的孵化产生不同影响的分子机制,测定了冷藏期间2种卵中的H2O2含量、过氧化氢酶(CAT)基因mRNA转录水平和CAT活性变化。结果表明:2种卵在冷藏期间随着卵中的H2O2含量显著增加,CAT基因mRNA转录水平也上调;虽然冷藏后的10～70d,2种卵中的H2O2含量、CAT基因mRNA转录水平及CAT活性都显著上升,但滞育卵的H2O2含量仍显著高于即时浸酸卵,而CAT基因mRNA转录水平和CAT活性则显著低于即时浸酸卵。即时浸酸卵在冷藏过程中H2O2含量显著增加,可能造成了对胚胎的氧化伤害,从而降低其孵化率。然而,滞育卵在冷藏过程中的CAT基因mRNA转录水平及CAT活性相对较低,H2O2相对较高,胚胎却未受到氧化伤害,推测低温处理可能诱导了滞育卵中其它抗氧化反应。     

家蚕滞育卵中辅酶Ⅰ和辅酶Ⅱ的含量变化

利用苹果酸脱氢酶(MDH)和柠檬酸合酶(CS)串联反应以及葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)催化葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)脱氢反应,分别测定了家蚕滞育发动、即时浸酸和低温冷藏处理蚕卵辅酶Ⅰ(NAD+)和辅酶Ⅱ(NADP+)的含量。滞育发动时蚕卵NAD+含量显著下降,而即时浸酸和低温冷藏处理使蚕卵NAD+含量显著提高。蚕卵中的NADP+在滞育发动前大量积累,滞育发动时下降,即时浸酸处理后NADP+含量显著提高,在低温冷藏早期其含量进一步提高,低温冷藏处理后期又显著下降。分析上述结果认为,家蚕滞育卵中NAD+和NADP+含量的变化分别与呼吸耗氧量和糖元-山梨醇相互转化密切相关。     

家蚕二化性品种(品系)转基因用蚕卵的预处理技术研究

家蚕为卵滞育昆虫,二化性家蚕品种(品系)的化性由上代卵期温度与光照等调控。将若干个二化性家蚕品种(品系)以17~18℃温度催青诱导子代蚕卵非滞育,筛选出1个经济性状较优的实用品种"秋丰"、1个突变品系P33,二者非滞育卵圈比例分别达到96.4%和89.6%,正常催青的良卵实用孵化率分别达到96.11%和98.58%,解决了采用显微注射法以家蚕实用品种构建转基因系统过程中因蚕卵滞育不能及时孵化的难题。另对利用20%盐酸-2%甲醛混合液刺激解除蚕卵滞育的方法以及非滞育蚕卵表面用70%乙醇消毒的方法进行了尝试,前者可以获得96%以上的孵化率,后者可以缩短蚕卵预处理时间。     

低温处理对家蚕滞育卵还原型与氧化型谷胱甘肽比值的影响

还原型谷胱甘肽(GSH)与氧化型谷胱甘肽(GSSG)的比值反映出细胞的氧化胁迫状况。利用分光光度法分别测定家蚕滞育卵持续25℃保护和经5℃低温处理后卵内谷胱甘肽代谢的变化,探讨蚕卵的谷胱甘肽代谢与滞育解除的关系。与持续25℃滞育温度条件下的蚕卵相比,5℃低温解除滞育的处理显著提高了蚕卵总谷胱甘肽含量、GSSG含量和硫氧还蛋白过氧化物酶(TPX)活性,而显著降低了GSH含量以及GSH/GSSG比值。结果表明,低温处理过程中,滞育卵TPX活性显著升高,间接地促进GSH氧化为GSSG,使GSH/GSSG比值显著下降,由此导致蚕卵处于过氧化状态。     

家蚕滞育解除相关酶类的研究进展

家蚕是典型的卵滞育昆虫,通过滞育可以使家蚕度过不良的生长环境利于其发育繁殖.滞育的家蚕卵可通过低温冷藏和浸酸等方法解除滞育,使胚胎正常发育.对于家蚕卵滞育解除的分子机理已有不少研究,包括从酶类、蛋白质组学、相关信号通路等方面进行探索.文章主要对近几年来家蚕滞育解除过程中的相关酶类研究进行综述,希望给今后相关研究提供参考.     

体外25℃家蚕卵酯酶A4的ATP酶活性变化及其与滞育性的关系

从家蚕卵纯化出EA4酶蛋白 ,调查了温度对EA4的ATP酶最高活性和其出现时间的影响以及与蚕卵滞育性的关系。EA4的酶活性反应温度为 2 5℃时比 5℃时提高约 1 0倍。从滞育性卵和盐酸处理卵纯化EA4 ,或者用EA4的活性抑制多肽 (PIN)体外处理酶蛋白质 ,2 5℃中EA4的最高活性出现时间比 5℃中显著提早。随纯化时卵龄或PIN处理时间的改变 ,2 5、5℃中EA4的最高活性出现时间以及与蚕卵 5℃冷藏时滞育发育时间有相同趋势的变化。体外 2 5℃和体外 5℃一样 ,EA4的最高活性出现时间与蚕卵的滞育发育有密切的关系     

催青温度对家蚕二化性品种滞育激素受体基因表达的影响及基因的结构特征

家蚕二化性品种的卵滞育与否受上代环境影响,25℃高温明催青将产滞育卵,而15℃低温暗催青将产非滞育卵。为探究催青温度调控二化性家蚕滞育的分子机制,对从家蚕卵巢细胞中克隆的家蚕滞育激素受体基因(Bmdhr)的5种cDNA进行生物信息学分析,结果表明Bmdhr基因的5种cDNA由相同的mRNA转录本通过不同的剪接方式而来,其中Bmdhr mR-NA-1与Bmdhr mRNA-2编码的氨基酸序列相同,Bmdhr mRNA-4编码的氨基酸序列与家蚕滞育激素BmDHR-1的序列相似度达99.2%。将家蚕二化性品种秋丰的蚕卵用蛾区半分法分成2组,分别以15℃暗催青和25℃明催青,利用实时荧光定量PCR分析催青温度对家蚕不同发育时期及蚕体组织中Bmdhr基因mRNA转录的影响。结果显示:Bmdhr mRNA-1主要在蛹期卵巢中表达,在对滞育激素最敏感的化蛹后4 d时,其转录水平急速上升至峰值,并且高温催青的转录水平高于低温催青;Bm-dhr mRNA-4主要在各发育时期的蚕体血液中表达,特别是在高温明催青条件下,其在蛹期血液中的转录水平是低温暗催青的7.7倍,说明BmDHR-4可能是决定家蚕二化性品种卵滞育与否的关键因子之一;Bmdhr mRNA-5在化蛹后2～3 d的卵巢中转录水平高,且低温催青的转录水平高于高温催青,化蛹后3 d其转录水平开始下降,至化蛹后4～5 d 2种催青处理间的转录水平无显著差异。研究结果为阐明家蚕滞育的分子机制积累了实验数据。     

家蚕滞育分子机制的研究

简述了有关家蚕滞育机制的分子生物学研究进展。家蚕的胚胎滞育是由环境条件和遗传性支配的。二化性蚕品种在胚胎中期和晚期经受高温和长光照 ,其结果是下一代胚胎滞育。不同的环境信息被神经分泌细胞“解读”和“受纳”。在特定的环境条件信息下 ,神经分泌细胞产生和分泌滞育激素 (DH)。滞育激素进入卵内 ,调节和建立滞育卵专一的内部环境。其特征是 ,滞育卵中发生有关糖原和山梨醇转换的一系列酶促反应 ,从而实现进入滞育、解除滞育等生理过程。     

滞育发动前家蚕滞育性与非滞育性卵的谷胱甘肽氧化还原循环状态分析

为了调查滞育和非滞育性家蚕卵的谷胱甘肽氧化还原循环在滞育发动前是否存在差异,利用分光光度法检测滞育发动前(25℃中蚕卵产下后0～24 h)滞育与非滞育蚕卵的谷胱甘肽含量和相关代谢酶活性。滞育发动前,滞育性家蚕卵中的还原型谷胱甘肽(GSH)含量、氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量、总谷胱甘肽(GSH+2GSSG)含量和GSH/GSSG比值变化不显著,谷胱甘肽S-转移酶(GST)活性变化不显著,但硫氧还蛋白过氧化物酶(TPX)活性下降23%,谷胱甘肽还原酶(GR)活性升高57%;非滞育性家蚕卵中的GSH含量及TPX和GST活性变化不显著,但GSSG含量升高61%,GSH+2GSSG含量升高41%,GSH/GSSG比值下降33%,GR活性下降16%。与非滞育性家蚕卵相比,滞育发动前滞育性家蚕卵中的GSH含量、GSSG含量和GSH+2GSSG含量较低,GSH/GSSG比值较高,TPX活性较低,GST活性无显著差异,GR活性较高。两种蚕卵中都未能检测到谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)和硫氧还蛋白还原酶(TrxR)活性。结果表明,滞育发动前滞育性家蚕卵中较低的TPX活性和较高的GR活性共同导致较高的GSH/GSSG比值,使其谷胱甘肽氧化还原循环处于相对还原态。     

家蚕的半活化胚现象初探

滞育是家蚕的生理现象 ,家蚕滞育卵的活化处理是养蚕生产上重要的技术操作。研究了家蚕盐酸处理卵、复式冷藏卵和长期保存卵的胚胎活化过程 ,认为家蚕胚胎除滞育态和活化态以外 ,还存在半活化状态。半活化胚胎的形态与萌动期 (乙 1)至反转期 (己 1)的活化胚相似 ,但胚胎整体发育不平衡 ,后部发育慢于前部 ,在 2 5℃、RH 75 %～ 85 %催青环境中的发育速度明显慢于活化胚 ,而越接近反转期发育速度越接近活化胚。同一群体内出现的半活化胚胎之间发育比较整齐 ,而不同群体的半活化胚胎之间发育有一定差异。活化刺激量越大 ,出现的半活化胚胎发育越快。探讨了半活化胚胎产生的机理以及对蚕种生产的影响     

滞育诱导温度和光照节律对家蚕sod基因和cat基因的表达的影响

家蚕(Bombyxmori)是卵滞育性鳞翅目模式昆虫,其滞育性受亲代卵孵化期(催青期)温度、光节律等环境因子诱导。为了研究家蚕滞育与温度和光照节律的关系,本文调查了温度、光照节律对家蚕sod基因和cat基因表达的影响。催青期中除了孵化期,25℃持续光照下(25LL)卵的sodmRNA均保持在较高水平,另外,sod基因在20℃光照黑暗(20LD)12h交替环境下的表达量要高于15℃持续黑暗(15DD)条件,且孵化后期这种现象更加明显。cat基因在25LL、20LD和15DD环境之间的表达量无差异,但是孵化后期(积温2160-3600℃.h),cat基因表达水平显著上调,这与在此阶段的蚕卵胚胎对滞育诱导环境温度和光节律比较敏感的结论相一致。此外,本文还调查了子代卵中sod基因和cat基因的表达情况。sod基因在人工活化卵(DTE)中的表达水平显著高于非浸酸的滞育性卵(DDE);卵龄24-192h,25LL子代卵逐渐进入滞育,sod基因表达量下调。低温黑暗条件会上调家蚕子代卵sod基因的表达水平。在初期的盐酸活化卵(DTE)中,cat表达量低于滞育卵(DDE),而后逐渐上升,直至接近滞育卵表达量,这表明盐酸可能会抑制cat基因表达。在恒温条件下,黑暗条件会促进子代卵上调cat表达。在温度光照协同作用下,20LD子代卵中cat表达量低于25LL和15DD。     

二化性家蚕滞育发动期间滞育性卵和非滞育性卵的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸变化

为了探究家蚕滞育发动期间呼吸耗氧量下降与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)含量变化的关系,用高效液相色谱法和分光光度法分别检测在25℃条件下产下后12～72 h的二化性家蚕滞育性卵与非滞育性卵中的还原型NAD(NADH)含量、氧化型NAD(NAD+)含量、乳酸脱氢酶(LDH)活性和胞质苹果酸脱氢酶(cMDH)活性。滞育性卵中的NADH+NAD+含量、NADH/NAD+值及LDH活性分别在产下后18、36、24 h达到峰值,而cMDH活性处于波动中。在产下后24～72 h,非滞育性卵中的NADH/NAD+值极显著低于滞育性卵,而LDH和cMDH活性极显著高于滞育性卵。据此可以推测,滞育发动期间家蚕滞育性卵的NAD+降解增强和NAD+再生下降共同导致呼吸耗氧量下降。