通过单蚜传毒纯化柑橘衰退病毒(CTV)分离物

对龙凤C、立间、FJ59和0号4种CTV(柑橘衰退病毒)毒源分别用单头橘蚜传毒进行分离纯化.用直接组织点免疫(DTBIA)和P25衣壳蛋白基因所表现出来限制性片段长度多态性(RFLP)对各毒源的蚜传阳性率和组群特征进行分析.从271株受毒植物中共获得31株感染CTV的阳性株,4种毒源的阳性检出率分别为25.0%、3.7%、3.1%和17.8%.有22株仅带有单一组群CTV,其中从龙凤C获得6株Ⅰ组群,3株Ⅲ组群;从FJ59获得1株Ⅰ组群;从0号获得7株潜伏侵染的Ⅰ组群,2株Ⅲ组群;从立间获得出3株Ⅳ组群CTV.     

寄主凤凰柚对柑橘衰退病病毒甜橙分离株构成的影响

 为研究不同柑橘类型对柑橘衰退病病毒构成的影响，将9个保存在新会橙上的引起甜橙茎陷点症状的柑橘衰退病毒强毒分离株嫁接接种到凤凰柚后，比较了接种前后p25基因的HinfⅠRFLP 和SSCP变化情况。分离株 CT90与CT20接种前后的RFLP组群没有发生变化；RFLP组群发生变化的分离株中有6个由混合组群变为单一组群。此外，除分离株CT90接种前后的SSCP谱带保持不变外，其余8个分离株从新会橙接种到凤凰柚后，SSCP谱带数均呈减少趋势。试验结果倾向于表明某些能在甜橙上增殖的CTV株系在凤凰柚上的增殖受到了抑制。     

甜橙品种(系)对柑桔衰退病毒多态性的影响

柑桔衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)存在复杂的株系分化现象,运用弱毒株交叉保护防治柑桔衰退病时需了解不同类型柑桔对CTV构成的影响.通过CTV分离株CT14和CT36分别嫁接接种28个甜橙品种(系)的研究发现,具有单一p25/HinfI RFLP组群构成的CT14在不同甜橙品种(系)上的组群构成和SSCP(单链构象多态性)图谱没有明显的变化；混有多个组群的CT36在不同的甜橙品种(系)上其组群构成和SSCP图谱差异明显,其中p25/HinfI RFLP第1组群的检出率最高.     

8种柑橘类植物对柑橘碎叶病毒分子组成的影响

探究不同柑橘类型对柑橘碎叶病毒(Citrus tatter leaf virus,CTLV)变异的影响,为研究寄主-CTLV的互作关系提供基础。将CTLV分离株HH和XLB分别嫁接接种于8种柑橘类植物,对CTLV分离株和获得的亚分离株样品进行CP基因的限制性长度多态性(RFLP)和单链构象多态性(SSCP)分析,以及序列比较。结果表明HH和XLB与其各自在不同柑橘植株上的亚分离株的CP/Hinf I RFLP酶切图谱无明显差异;混合侵染的CTLV分离株HH和其亚分离株之间的SSCP谱型存在差异,株系构成单一的CTLV分离株XLB与其亚分离株间的SSCP谱型差异不明显。通过序列分析进一步证实CTLV在不同寄主上其CP基因有几个核苷酸位点发生了变异。CTLV可能受寄主植物的影响发生了变异。     

柑橘衰退病毒研究进展

综合有关文献,就柑橘衰退病毒(Citrustristezavirus,CTV)的生物学特征、分子生物学、抗病毒基因工程和柑橘衰退病的检测、鉴定及防治作一综述。重点讨论CTV株系分化、基因组和亚基因组RNA、CTV的血清学和分子生物学检测方法。目前的研究表明,CTV通常以不同株系的混合物存在,并且和其他病原形成复合侵染,各分离物之间存在明显的遗传多样性。不同株系的分离纯化、各株系间的交叉保护及CTV和橘蚜的互作关系还有待深入的研究。     

基于p23基因的野生柑橘和栽培柑橘上衰退病毒分离株间的遗传特征分析

【目的】比较分析野生柑橘与栽培柑橘上衰退病毒(CTV)分离株间的分子遗传特征,为深入解析CTV的遗传进化提供相关依据。【方法】运用RT-PCR对我国云南、广西、四川、湖南、江西等省(区)的11个野生柑橘上的CTV分离株和4个国内栽培甜橙及柚上的CTV强弱毒代表株分离株的p23基因进行扩增、测序,所获序列与Gen Bank收录的具有代表性的国外CTV分离株的相应基因序列进行比对分析。【结果】野生柑橘与国内外栽培柑橘上CTV分离株的p23基因序列相似率为87.7%~99.3%;密码子中碱基含量GC%AT%,密码子转换数多于颠换数,第3位的碱基替换数最多,其次为第1位,最少是第2位;非同义突变与同义突变的比值(dN/dS)小于1,表明p23基因在进化过程中承受着净化选择。系统聚类分析表明,来自于野生柑橘上的11个CTV分离株在构建的系统发育树中分属不同的簇支,与不同来源地具有较高相似性和较低遗传距离的栽培柑橘上的CTV分离株构成同一组群。【结论】野生柑橘与栽培柑橘上的CTV分离株在碱基含量、密码子转换和颠换率及非同义突变与同义突变比值(dN/dS)等遗传特征方面均表现出一致性,系统发育分析表明,野生柑橘上CTV分离株基于p23基因序列的聚类关系与其地理来源之间无明显相关性。     

‘赣南早’与‘纽荷尔’脐橙对柑橘衰退病病毒变异的影响

研究‘纽荷尔’脐橙及其芽变品种‘赣南早’对柑橘衰退病病毒(Citrus tristeza virus,CTV)分离株变异的影响及抗性差异。将CTV分离株YC-3接种后分析‘赣南早’上的分离株YC-3Z和‘纽荷尔’上的分离株YC-3N外壳蛋白(CP)基因的限制性片段长度多态性(RFLP)和单链构象多态性(SSCP)及序列差异,测定两个品种体内CTV的复制水平及与抗性相关防御酶活性的变化。结果表明CTV分离株YC-3Z、YC-3N与接种前的YC-3相比,RFLP组群和SSCP谱带数无变化;密码子的替换主要发生在第3位的碱基位点上,其次为第1位,第2位未发生替换;密码子转换数多于颠换数;CTV分离株YC-3N密码子发生了非同义突变;CTV分离株在‘纽荷尔’上的复制水平是在‘赣南早’上的3.3倍。酶活性测定表明‘赣南早’和‘纽荷尔’接种CTV后,体内过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)活性增加了78.2%以上,苯丙氨酸解氨酶(PAL)和多酚氧化酶(PPO)活性均有提升,过氧化氢酶(CAT)活性降低,但两个品种间5种防御酶活性不存在显著差异。     

柑橘衰退病毒侵染对寄主植物同工酶及酸性病程相关蛋白表达的影响

以柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)不同致病力株系接种寄主植物,比较分析了寄主植物体内过氧化物酶(peroxidase,POD)和多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)活性变化特点。结果表明,该病毒侵染对这2种酶活性的影响因寄主品种和CTV株系而异,CTV强毒和弱毒株系侵染均导致墨西哥莱檬植株中POD活性明显降低;在甜橙上,CTV强毒株系接种植株中POD活性则显著性提高,而弱毒株系接种对POD的活性无明显影响;在对该病毒具有较高抗性的枳壳中,接种CTV不同株系对POD活性均无明显影响。而在接种强毒株系N25的墨西哥莱檬中PPO活性有所增强,在枳壳上则表现为接种植株的PPO活性降低,在甜橙上PPO活性无明显的变化。POD、PPO和酯酶(esterase,EST)同工酶酶谱分析的结果显示,CTV弱毒株系接种枳壳后诱导产生了2条新的EST同工酶谱带,而在其他CTV接种植株上均未诱导表达新的POD、PPO及EST酶谱。酸性病程相关蛋白分析结果显示,CTV强毒株系在甜橙上诱导产生有6条明显的酸性病程相关蛋白条带。     

柑橘黄龙病、裂皮病和衰退病病原的多重RT-PCR检测

 建立了一种同时检测柑橘黄龙病病原类细菌(Candidatus L iberibacter asiaticus, HLB) 、柑橘裂皮类病毒(Citrus exocortis viroid, CEVd) 、柑橘衰退病病毒(Citrus tristeza virus, CTV) 的多重RT-PCR技术体系。运用根据3 种病原核苷酸保守区序列设计的特异性引物, 成功的对同一样品中的HLB、CEVd、CTV进行多重RT2PCR扩增, 得到1 160 bp、371 bp、273 bp 3条特异性大小与试验设计相符的条带。就影响多重PCR 的主要因素引物浓度和退火温度进行了一系列优化, 建立了能同时检测HLB、CEVd、CTV的多重RT2PCR技术体系。该体系最低能从10 pg总RNA中检测出黄龙病类细菌和柑橘裂皮类病毒, 从1 pg总RNA中检测到柑橘衰退病毒。对采自田间37份材料的实际检测表明: 存在两种或3种病原的复合侵染。     

柑橘衰退病交叉保护研究进展

柑橘衰退病毒（CTV）是世界性的柑橘病毒病害,广泛分布于世界各柑橘产地,对全世界的柑橘产业造成了严重威胁。各国研究人员为防治CTV进行了细致的研究。本文从CTV的分子生物学特征、株系分化、传播途径和弱毒株系交叉保护综述了国内外的科研进展。     

柑橘黄化脉明病毒和衰退病毒的二重RT-PCR检测体系的建立与应用

选用柑橘黄化脉明病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)和柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)两种病毒外壳蛋白保守序列及内参基因Ubiquitin的特异性引物,优化影响二重RT-PCR反应的Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度、引物浓度和退火温度,建立了针对两种病毒的一步法二重RT-PCR检测体系。二重RT-PCR获得CYVCV、CTV及Ubiquitin的特异性片段大小分别为614、373和194 bp,克隆测序和序列对比结果显示它们与已报道的病毒序列具有较高的同源性。该体系最低能从40 ng·μL~(-1)总核酸中检测出CYVCV,从4 ng·μL~(-1)总核酸中检测出CTV,其灵敏度与单一RT-PCR检测灵敏度一致。利用该体系对33份田间样品进行检测,CYVCV和CTV感染率分别为54.5%和66.7%,复合侵染率高达36.4%。该一步法二重RT-PCR技术体系可用于大量田间样品中CYVCV和CTV的快速同步检测。     

应用SSCP技术分析我国柑橘衰退病毒的混合感染

以随机采样的方式,从湖北、湖南和江西3省10县的柑橘产区收集242份温州蜜柑(CitrusunshiuMarc.)、橘(C.reticulataBlanco)、甜橙(C.sinensisOsbeck)和柚(C.grandisOsbeck)样品。对PAS-ELISA法初步检测呈阳性的样品进行柑橘衰退病毒(Citrustristezavirus,CTV)CP基因(coatingproteingene,CPgene)的RT-PCR扩增,结果来自14个样品采集地的120份样品感染了CTV,单个采样点的感染率为20.0%～71.4%,而总感染率达49.6%,表明CTV在这些地区广泛发生。单链构象多态性(single-strandconformationpolymorphism,SSCP)分析显示,120份CTV的CP基因RT-PCR的扩增产物共产生120种SSCP带型,而且存在广泛的混合感染。     

柑橘衰退病毒弱毒株筛选方法研究进展

柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)引起的衰退病是一种严重危害世界柑橘产业的病毒病害。随着我国柑橘产业的发展,柑橘衰退病的危害也日趋严重。目前交叉保护技术是防治柑橘衰退病最有效的手段。现有研究表明,由于CTV存在复杂的株系分化现象,导致弱毒株筛选仍存在诸多困难。对运用生物学方法、血清学检测以及分子生物学技术鉴定CTV弱毒株的最新研究进展予以综述,同时就现有交叉保护防治技术的不足和解决途径进行讨论和展望,旨在为更好地防治柑橘衰退病提供借鉴。     

T3基因型柑橘衰退病毒实时荧光定量RT-PCR检测体系的建立及应用

根据不同基因型柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus,CTV）ORF1a的序列差异,设计T3基因型CTV的特异性引物T3-4F/R,通过优化得到最佳反应条件建立T3基因型CTV分离株的SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR,并进行灵敏性、重复性试验。应用该方法测定柑橘植株中T3基因型CTV分离株含量。建立了一种特异性检测T3基因型CTV分离株的SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR检测方法,其灵敏性比普通RT-PCR方法高100倍。标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,扩增效率为97.1%,相关性系数为0.992。组内和组间变异系数均小于2.94%,表明该方法重复性好。田间样品中T3基因型CTV含量差异较大,最高含量是最低含量的1 250倍。本研究中建立的实时荧光定量RT-PCR检测方法能够准确检测柑橘植株内的T3基因型CTV分离株,可用于研究T3基因型的CTV的变化规律。     

柑橘4种病毒多重PCR检测技术的建立及应用

柑橘衰退病毒(CTV)、柑橘碎叶病毒(CTLV)、柑橘黄化脉明病毒(CYVCV)和柑橘叶斑驳病毒(CLBV)是影响柑橘生产的重要病毒性病害,建立快速、准确的检测方法是防控该病害的基础。本研究通过筛选针对4种病毒基因组保守区域设计的特异性引物,优化影响多重RT-PCR扩增的引物浓度、退火温度,建立了可同时扩增4种病毒的多重RT-PCR检测体系。该检测体系扩增的特异片段大小分别是CTLV 889 bp、CYVCV 612 bp、CTV 462 bp和CLBV 294 bp,扩增产物清晰,特异,检测灵敏度较普通单重RT-PCR灵敏度低约10倍。采用多重RT-PCR和单重RT-PCR对收集到的59份田间样品分别进行检测,结果显示2种方法检测结果一致,4种病毒的检出率在11.9%～54.2%之间。建立的多重RT-PCR方法可准确、快速、灵敏地检测单一或复合侵染的4种柑橘病毒。     

辐射诱变和芽变柑橘品种(系)的AFLP分析

为了对广东省近年来新选育的16个60Co-γ辐射诱变和芽变柑橘优良品系(株系)进行遗传差异分析,应用AFLP技术,对3个亲本和16个辐射诱变和芽变的柑橘品种(系)进行了遗传差异分析。从64对引物中筛选出9对多态性高、分辨能力强的引物进行分析,结果表明:(1)与各自的亲本相比,供试16个辐射诱变和芽变的柑橘变异类型的遗传基础均已经发生了不同程度的变化。(2)利用引物EcoRⅠAAG+MseⅠCTT绘制供试样品的AFLP指纹图谱,并根据各自的差异带或特征带区分了19个柑橘试材。(3)对AFLP扩增结果进行聚类分析,根据相似系数0.77的水平可将19个样品分为4组。红江橙品系中的华青1号与亲本间的相似性系数仅为0.647 7,可将其单独划为一组。可为柑橘新品种选育研究的早期鉴定提供参考依据。     

基于SSR标记的赣南柑桔黄龙病菌遗传多样性分析

从已报道的韧皮部杆菌基因组的23个SSR位点中筛选出3个位点(LasSSR-C、LasSSRD、CWBJ44),用于赣南14个县(区、市)的342份柑桔黄龙病菌样品的遗传多样性及各地种群结构的分析。结果表明,赣南地区柑桔黄龙病菌种群在LasSSR-C、LasSSR-D和CWBJ44位点的Nei’s多样性指数H分别为0.734 6、0.576 2和0.291 3,赣州西南部县(区、市)的多样性指数H比东北部高;大余县的等位基因与其他县(区、市)区别较大。Powermarker软件UPGMA聚类分析将所有样品分为两个组群,大余县单独列为一个组群,其余县(区、市)聚为一个组群。Structure软件聚类分析也得出了相似的结果,大余县的种群构成较为单一,91.8%的样品属同一组群,而其他县(区、市)的种群则是由两个组群菌株按不同比例混合构成。     

基于微卫星技术的赣南脐橙溃疡病菌遗传多样性分析

在赣南18个县(市、区)收集到508份柑桔溃疡病菌样品,采用已报道的柑桔溃疡病菌A菌系306菌株(GenBank Accession no.AE008923)基因组上的14个SSR位点分析遗传多样性。从14个SSR位点中,筛选出用于赣南地区溃疡病菌种群多样性研究的SSR位点7个(XL1、XL2、XL3、XL4、XL5、XL6和XL7),测试得到的Nei’s基因多样性指数在0.66~0.83之间。通过这7个位点分析赣南不同地域的样品发现,大余县样品的遗传多态性最高,定南县样品的遗传多态性最低。采用Structure 3.25和PowerMarker 2.3.4软件聚类分析发现,赣南18县(市、区)的柑桔溃疡病菌样品分成两个组群,且某些县(区)群体结构构成单一。其中,信丰、定南和章贡区样品群体属于同一组群,兴国和会昌样品群体属于另一组群,其他县(区)样品群体则是由两个组群菌株按不同比例混合构成。     

柑橘果实中酚酸类化合物研究进展

柑橘是世界上种植最多的水果之一,广泛地分布于热带、亚热带和温带区域,主要包括甜橙类、宽皮柑橘类、葡萄柚和柚类、柠檬类、杂柑类和金柑类等[1]。我国是世界柑橘生产大国,2019年柑橘种植面积为2.61×10^(6)hm^(2),产量高达4.58×10^(7)t[2]。我国柑橘类水果消费以鲜食为主,部分以罐头、果汁形式进行加工。柑橘果实中富含对人体健康有益的活性成分和抗氧化物质如维生素、矿物质、酚类、萜类等[3]。     

巧治柑橘流胶爆皮病

<正>柑橘流胶病是柑橘生产中的重要病害之一,属于真菌性病害。陕西城固柑橘产区自2003年发生爆皮以来,流胶现象一直零星出现。近几年,该县部分柑橘园在5—7月流胶现象严重发生,导致树干爆皮(图1、图2),树势衰弱,甚至死亡。1侵染对象主要通过伤口侵染盛果期温州蜜柑的主干、多年生主枝,小枝上也有发生,严重时主干基部皮层爆裂(图3),导致全株死亡。在本地特别是以香橼为砧木的橘园发病最为严重。