基于马尾松干旱转录组的抗旱功能SSR位点分析

[目的]了解马尾松干旱胁迫转录组序列的功能分布和SSR位点分布特征,并探索与干旱关联的SSR位点。[方法]对马尾松幼苗进行持续干旱胁迫,选取干旱10、15、25 d及正常供水对照的马尾松针叶样品,通过总RNA提取、Illumina测序、raw reads去冗、Trinity拼接获得unigenes。利用Blast比对,对Unigene序列进行GO、KOG、KEGG功能注释及分类;利用Misa软件进行SSR位点批量搜寻,primer 3. 0软件进行规模化SSR引物设计;利用GOSeq(1. 10. 0)、KOBAS(v2. 0. 12)软件对差异表达的含SSR位点Unigene进行GO、KEGG显著性富集分析。[结果]马尾松转录组194 821个Unigene中,101 806个Unigene获得注释,包含64 943个GO功能注释、35 880个KOG功能注释及30 882个KEGG注释。搜寻到6 728个SSR位点,分布于6 367个Unigene中,SSR出现频率为3. 45%;重复类型以单、三、二核苷酸为主,分别占总SSR的35. 82%、33. 03%和25. 22%;重复基序以A/T、AT/AT、AG/CT、AGC/CTG、AAG/CTT为主;基序长度以10 20 bp的短序列SSR为主;基序重复次数以5～10次重复占优势;批量设计13 338对SSR引物。422个含SSR位点Unigene具有差异表达; KEGG富集分析发现,有11个含SSR位点的差异Unigene参与了光合作用、植物激素信号传导及类胡萝卜素合成等3个与干旱响应相关的代谢途径。[结论]从较高质量的马尾松转录组中获得101 806个具有注释的Unigene;从6 367个Unigene中挖掘出6 728个SSR位点; 422个含SSR位点的差异表达Unigene中筛选出11个与干旱关联的SSR功能位点,为抗旱功能基因定位及马尾松抗旱分子机制研究奠定基础。     

基于RNA-seq的西藏嵩草转录组分析

嵩草属植物是青藏高原及其周边地区高寒草甸的建群种,分蘖能力强、根系发达,耐寒,是优良的牧草资源。目前对该类植物转录组情况的研究相对不足。该文采用Illumina HiSeq 2500高通量测序技术,对西藏嵩草(Kobresia tibetica)茎、叶、花及果实的混合样进行转录组分析。经拼接组装共获得63 837个Unigene,序列平均长度890.1bp,N50为1 342bp。将Unigene序列与5个主要的公共数据库(NR,Swiss-Prot,KEGG,GO,KOG)进行比对(Evalue1e-5),共有40 705条Unigene获得了基因注释,占总Unigene的63.76%。通过KEGG pathways分析,共有10 043Unigene参与了274个代谢通路,获得了西藏嵩草分蘖和抗寒相关Unigene 179个。在15 044条Unigene中共搜索到5 310个SSR位点,其中二核苷酸和三核苷酸的重复类型占所有SSR位点的94.63%。这些数据为嵩草相关基因的发掘和SSR分子标记开发提供了重要依据。     

基于油脂合成期油桐种仁转录组数据的α－亚麻酸代谢途径解析

【目的】油桐种仁中产出的桐油经济利用价值极高。桐油中α－桐酸的含量高达70%,然而植物体内α－桐酸代谢通路的研究还未见报道,这对直接筛选油桐α－桐酸代谢通路相关酶基因造成一定的困难。α－亚麻酸作为α－桐酸的同分异构体,其代谢通路的研究则较为深入,能为α－桐酸代谢通路的解析提供参考。因此,本研究期望在油桐种仁转录组数据的基础上,解析油桐的α－亚麻酸代谢途径,为油桐α－桐酸代谢机理的阐明提供理论参考。此外,通过调控这些基因的表达模式以及开发与之紧密连锁的分子标记,可大大加快油桐遗传改良和分子育种的进程。【方法】采用 RNA-Seq技术对油桐种仁3个不同油脂合成期的转录组进行比较,获得大量差异表达的Unigene,并将这些Unigene归类于128个代谢途径。在此基础上,通过GO分类和Pathway富集性分析,解析油桐α－亚麻酸代谢通路并分析通路中相关酶基因在油脂合成期的表达变化规律。【结果】通过对Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ期的油桐种仁RNA测序,共获得长度为200～3000个核苷酸的非冗余Unigene序列58439条,其中能够比对到公共数据库中已知基因序列的 Unigene共有41059条,占所有非冗余基因的70.3%。不同长度的非冗余 Unigene序列与数据库中序列匹配的效率不同,越长的序列匹配效率越高。序列长度大于2000 bp的序列匹配效率达到98.28%,而500～1000 bp和100～500 bp的序列分别只有78.86%和48.99%的匹配效率。3个种仁油脂合成期的转录组数据中共有105个 Unigene可被富集于α－亚麻酸代谢途径,占所有非冗余 Unigene的0.47%。从3个转录组数据的两两比较中鉴别出一些差异表达Unigene,其中也有一些可被富集于α－亚麻酸代谢途径。通过在KEGG数据库中进行检索后发现,105个 Unigene序列分别对应于14个α－亚麻酸代谢途径关键酶基因,这些基因在其他物种中都有同源基因与之对应。通过基因表达模式分析发现,整体上与合成代谢相关的基因在油脂合成期呈现上调的表达模式,而与分解代谢相关的基因则呈现下调的表达模式。【结论】在油桐种仁转录组数据的基础上,解析油桐α－亚麻酸代谢途径,获得与α－亚麻酸代谢相关的重要酶基因并分析它们在油脂合成期的表达模式,这对后续研究具有重要的启示作用。     

油桐尺蛾核型多角体病毒广西株全基因组序列

油桐尺蛾核型多角体病毒广西株基因组序列由Sanger测序的方法得到。拼接后获得了121 268 bp序列,GC含量为36.76%。以长度不小于50 aa的序列认定为功能基因,共预测到131个开放阅读框,通过Blast比对,其中87个能注释到功能基因。对基因组序列进重复序列分析,共发现SSR位点174个,同源重复序列1个。在SSR位点中,包含6种长度的重复基序,且以富含AT的重复基序为主。同源重复序列两端为一59 bp片段或其一部分组成的重复序列,两端分别重复12次和7次,中间则为一段与重复片段无关的236 bp片段。与武汉株相比,广西株病毒在37个核心基因中有4个存在蛋白序列长度上的差异,而在其他非核心基因中有6个基因仅存在于一个病毒株中,另有13个基因存在蛋白序列长度上的差异。     

黑果枸杞果实发育过程中转录组测序分析

【目的】研究黑果枸杞果实在不同发育阶段基因表达谱的变化情况,为进一步开展黑果枸杞果实发育过程中的分子生物学研究提供基础资料。【方法】以黑果枸杞果实发育过程中青果期、变色期和成熟期的果实为材料,利用新一代高通量测序技术平台Illumina Solexa进行转录组测序和数据de novo组装,并对得到的Unigene进行功能注释、分类及代谢通路分析。【结果】基于转录组测序数据得到N50值为1 743 bp及平均长度为1 262.65bp的黑果枸杞Unigene共有43 573条。在GO、KEGG、KOG、NR和SwissProt数据库上得到注释的Unigene总数为23 723条,占总Unigene的54.44%,有3 726条Unigene在这5个数据库中同时得以注释,但还有19 850个Unigene在这些数据库中没有得到注释。23 559条和17 212条Unigene分别在Nr和SwissProt数据库有同源比对信息。GO数据库中注释到的15 064个Unigene分为细胞组分、分子功能及生物学过程等3大类62个功能组。KOG数据库中注释到的13 128个Unigene功能系统分为25类,其中黄酮类代谢途径所属的Q类(次生代谢产物生物合成、运输和代谢)共获得了520个Unigene注释。以KEGG数据库为参考,将4 951个Unigene定位到215个代谢途径分支,其中有45个Unigene与类黄酮生物合成相关。在黑果枸杞果实转录组中发现16 815个SSR位点:最多的为单核苷酸SSR,占72.92%;最少的是6核苷酸,占0.04%。【结论】共得到43 573条Unigene,有23 723条Unigene在GO、KEGG、KOG、NR和SwissProt 5个数据库中得以注释,筛选出与类黄酮生物合成有关的Unigene 45个,这为与黑果枸杞果实品质有关基因筛选、克隆和功能分析等提供研究基础和理论依据。     

基于桤木属转录组测序的SSR分子标记的开发

[目的]基于转录组数据开发适用于桤木属树种的SSR标记,揭示其在转录组序列中的分布类型及特征,为桤木属树种分子标记辅助育种提供有利工具。[方法]利用Micro SAtellite(MISA)软件对所有转录组序列进行SSRs搜索,并对SSR位点的数量、分布特征进行统计分析。设计100对SSR引物,采用琼脂糖凝胶电泳和毛细管电泳分离检测方法对3种不同倍性桤木属植物(12份材料)进行遗传多样性检测,确定引物多态性及通用性。[结果]85 769条Unigenes序列中发现8 678个SSR位点,分布在8 298条Unigenes中发生频率为9.67%,转录组序列中平均每14.04 kb长度就有一个SSR位点分布。其中,二核苷酸重复类型数量最多,占65.87%。根据转录组Unigenes序列,利用Primer 3软件共设计出4 531对符合要求的引物,挑选出的100对SSR引物中,获得18对多态性高、稳定性好的SSR引物。[结论]本研究可扩增出多态性位点的引物重复单元以二、三核苷酸重复为主。基于桤木属转录组序列的SSR标记开发是可行的,开发的引物为桤木属遗传多样性分析、分子育种、遗传图谱构建和功能基因的挖掘提供了丰富的候选分子标记。     

杜仲转录组微卫星特征分析

为给杜仲SSR分子标记的选择提供参考依据,利用MISA软件对杜仲转录组序列进行了微卫星查找,共获得重复单元长度为1~6碱基的29 067个微卫星序列。分析这些微卫星序列后发现,在杜仲转录组中,长度为二核苷酸的微卫星重复单元最为丰富,占43.7%;在单碱基重复和二碱基重复这两种类型中,最主要的优势重复单元分别是A/T和AG/CT;在三碱基、四碱基、五碱基重复类型中,(AAN)n、(ANAT)n、(AANAN)n分别为其对应的优势重复单元。杜仲转录组中,微卫星的频率随着微卫星总长度的增加而降低。     

麻竹笋转录组测序及苦涩味物质合成基因差异表达分析

[目的]研究避光处理对麻竹笋苦涩味物质合成相关基因表达的影响。[方法]利用Illumina HiSeq~(TM)2500平台对自然生长(CK)和覆土处理(EP)2种类型的麻竹笋进行转录组测序,并对差异表达基因进行分析。[结果]转录组测序共获得36.45 Gb原始数据,经组装去冗余处理得到53 388个Unigene,将所得Unigene比对到Nr、Pfam、COG、Swissprot、GO和KEGG数据库中进行功能注释,发现共有31 462条Unigene与其它物种的基因具有同源性。对CK和EP处理所测得的Unigene进行表达量的比较分析,筛选出1 846个差异基因,其中,在EP处理中上调表达基因998个,下调表达基因848个。由KEGG代谢通路分析发现,差异基因显著地富集在32个代谢途径中,其中,包含与苦涩味物质合成相关的糖酵解途径、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸合成途径等。进一步研究发现,参与麻竹笋芳香族氨基酸、单宁合成的PFK、ENO、PPY-AT/HPP-AT、LAR等酶基因在EP处理中表达量下降,荧光定量PCR验证结果与测序结果基本一致。[结论]避光处理抑制了苯丙氨酸、酪氨酸、单宁生物合成关键酶基因的表达,可能最终影响麻竹笋苦涩味物质的合成。     

云南干热河谷地区余甘子转录组分析

[目的]对云南干热河谷地区余甘子转录组特征进行描述,旨在为余甘子微卫星标记的开发和功能基因的挖掘提供较全面的背景信息。[方法]采用Illumina Hiseq 4000测序平台对余甘子叶片进行转录组测序,对原始数据进行过滤、de novo组装及聚类去冗余等处理后,再与公共数据库进行比对,对Unigenes进行基本功能注释、CDS预测、TF编码能力预测及R-Gene预测等分析。[结果]本研究共获得10. 52 Gb的Clean reads,Q20、Q30分别为98. 47%、95. 28%。组装并去冗余后获得76 881条Unigenes,平均长度、N50分别为713、1 257 nt。通过与NR、COG、KEGG和Swiss Prot数据库进行比对,44 768条Unigenes获得功能注释。余甘子转录组Unigenes根据COG功能注释信息大致分为25类;按GO功能注释信息划分为生物学过程、细胞组分和分子功能3大类47亚类;参考KEGG注释信息,可归为6大代谢通路、21类代谢途径,其中约3/5为代谢相关通路。根据以上注释结果共检测出42 953个CDS,其余未比对上的Unigenes用ESTScan预测后得到2 058个CDS。同时,预测到56个TF家族以及18种RGene。[结论]本研究获得的余甘子转录组Unigenes序列的组装质量较高、完整性较好、基因丰富、功能多样,极大地扩充了余甘子基因信息库,为今后余甘子乃至叶下珠属植物功能基因挖掘、抗性机理分析、分子标记开发、分子辅助育种等研究提供了重要的基础数据。     

基于RNA-seq数据开发梨网蝽SSR引物研究

以梨网蝽为材料,从其转录组中筛选功能微卫星序列(EST-SSR),并进行SSR位点的信息分析,开发梨网蝽SSR引物,旨在为深入探究梨网蝽的分子结构奠定理论基础。对梨网蝽转录组中16 449条基因数据库的数据进行搜索,共找到6 641个SSR位点,分布在4 420条基因数据库中,发生频率(含有SSR位点的基因数据库与基因数据库总数之比)为26.87%。在对其各组分数量分析中,发现梨网蝽转录组中SSR的主要重复类型是单核苷酸重复,占SSR总数的40.41%;其次是三核苷酸重复,占SSR总数的22.76%。本试验共设计80对梨网蝽EST-SSR引物,其中9对引物可以扩增得到预期的条带。     

白蜡虫雄虫真蛹转录组分析

[目的]蛹期对于白蜡虫雄虫发育和交配具有重要意义,但目前缺乏对于白蜡虫真蛹基因转录情况的分析,本研究旨在获得白蜡虫真蛹转录组数据,了解其转录组特征。[方法]采用Illumina Hi Seq 2000进行高通量测序,并进行生物信息学分析;采用荧光定量PCR(qRT-PCR)检测3个热激蛋白基因(hsp)在不同虫态中的表达动态。[结果]共获得63 957条unigene、63 272个开放阅读框(ORF)、9 561个SSR分子标记,unigene平均长度674 bp,共有14 327条unigene获得了注释,Gene Ontology(GO)注释和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)注释分析表明,很多基因参与的功能与白蜡虫蛹期的生理特征吻合。[结论]该转录组数据为白蜡虫基因功能鉴定和蛋白组学分析研究奠定了数据基础。     

穗花杉的转录组测序及其转录组特性分析

[目的]通过对红豆杉科穗花杉属的穗花杉进行转录组测序,为穗花杉的萜类合成途径和分类学研究提供支持。[方法]利用Hi Seq2500技术对穗花杉的茎叶进行转录组测序。[结果]穗花杉转录组测序共得到8.14 Gb的clean data。从头组装共获得82 884条unigene,其中有27 495条unigene被注释。此外,在82 884条unigene中共搜索到2 827个SSR位点,单核苷酸重复SSR出现频率最高(60.1%),其次为三核苷酸重复SSR(25.4%)。在穗花杉unigene中挖掘出了1个牦牛儿基焦磷酸合成酶(GPS)、1个法尼烯基焦磷酸合成酶(FPS)和5个牦牛儿基牦牛儿基焦磷酸合成酶(GGPS)的同源基因,同时得到紫杉二烯合成酶(TS)同源基因13个。[结论]发现了20个与萜类合成有关的unigene和2 827个SSR位点,为今后穗花杉萜类生物合成研究,特别是紫杉二烯合成酶编码基因的研究打下了基础,也为该物种系统分类地位及遗传多样性研究提供了新的遗传信息。     

白蜡虫蜡酯合酶基因cDNA全长克隆及原核表达

正白蜡虫(Ericerus pela)是我国特有的资源昆虫,泌蜡是白蜡虫二龄雄虫最为特化的性状[1]。白蜡虫分泌的白蜡在食品、医药、纺织等行业具有重要的经济价值[2]。白蜡的主要成分是26酸26酯[3],已有研究表明,蜡酯的生物合成在动植物中存在保守途径[4]。蜡酯生物合成的第一步由脂酰辅酶A还原酶催化脂酰辅酶A转化为脂肪醇,第二步由蜡酯合酶(WS)催化脂肪醇和脂肪酸的酯化反应[5]。WS     

滇东南濒危植物长梗杜鹃转录组微卫星特征分析

[目的]全面了解滇东南特有濒危植物长梗杜鹃转录组SSR位点的分布及序列特征,为长梗杜鹃的保护和合理开发利用提供遗传学资料,为同属植物及近缘种SSR标记的开发及遗传研究提供便利。[方法]利用Illumina Hiseq 4000高通量测序平台对长梗杜鹃叶片进行转录组测序,再通过MISA软件对测序所得Unigenes进行SSR位点的发掘和分析。[结果]发现含SSR的序列17 354条,共得到23 192个SSR,出现频率为31.30%,平均每3 kb出现1个SSR。二碱基和三碱基重复为长梗杜鹃SSR主要重复单元类型,分别占SSR总数的69.25%和15.07%,187种重复基元中,所占比例最高的是(AG/CT)n(62.01%),其次是(A/T)n(12.34%)、(AC/GT)n(4.52%)和(AAG/CTT)n(4.23%)。在SSR和CDS的交集基因中,共发现15 908个SSR位点,其中2 792个位于编码区,出现频率为0.076 SSR/kb,而非编码区为0.344 SSR/kb,在基因编码区中出现频率最高的是三碱基重复(1 356,48.57%)。在不同长度重复单元中,二碱基重复SSR长度变异程度最高,其次是单碱基重复。长梗杜鹃SSR的频率和长度呈显著负相关(P0.01),相关系数为-0.566。[结论]长梗杜鹃转录组SSR位点的出现频率高、分布密度大、基元类型丰富、重复次数较高、长片段较多,具有较高的多态性潜能,用于遗传分析的潜力很大,能满足该物种的保护遗传学研究。     

白蜡虫热激蛋白序列分析

[目的]了解白蜡虫泌蜡高峰期所表达的热激蛋白及其序列特征。[方法]从白蜡虫转录组数据库筛选获得hsp10、hsp20、hsp40、hsp60、hsp70、hsp90基因序列,进行序列联配和进化树分析,并对hsp40、hsp60、hsp90基因在不同温度下mRNA相对表达量情况进行荧光定量PCR检测。[结果]从白蜡虫转录组数据库中共筛选出32条hsp基因序列,序列分析发现它们与目前已报道的序列具有很高一致性,大部分含有保守区域和特征序列,能够与同目昆虫基因聚为一支。hsp40、hsp60、hsp90基因均能被温度诱导。[结论]在白蜡虫泌蜡高峰期共鉴定到32个热激蛋白非重复序列基因(unigene):hsp10 unigene 3个,hsp20 unigene 1个,hsp40 unigene 11个,hsp60 unigene 1个,hsp70 unigene 13个,hsp90 unigene 3个。     

马尾松谷胱甘肽过氧化物酶PmGPX6基因cDNA克隆及转化拟南芥耐旱性初步研究

[目的]克隆马尾松谷胱甘肽过氧化物酶基因,并对其进行功能研究。[方法]采用RACE技术克隆基因c DNA序列,实时荧光定量PCR检测基因在马尾松干旱胁迫下的表达模式,花序浸泡法转化拟南芥,并对转基因与野生型拟南芥的生长表型和根系生长进行分析。利用荧光显微镜技术对转基因拟南芥不定根进行GFP荧光检测。[结果]克隆到1个871 bp的GPX基因全长c DNA序列,命名为Pm GPX6。Pm GPX6包括513 bp的完整开放阅读框,编码170个氨基酸残基。Pm GPX6蛋白与油松Pt GPX蛋白同源性达95%。Pm GPX6在马尾松根中高表达,茎、叶中表达量低。在干旱胁迫下,Pm GPX6在根、茎、叶中的表达量均在第15天达到最大,随后出现下降趋势。过表达Pm GPX6与野生型拟南芥植株在正常水分条件下表型与根长差异不大,但在干旱胁迫下,转基因植株根系更长。转基因拟南芥根在蓝色光激发下能发出强烈的绿色荧光,表明Pm GPX6基因能高效表达。[结论]推测Pm GPX6可能参与马尾松干旱胁迫应答。     

泡泡刺高通量转录组鉴定及其黄酮类代谢途径初步分析

[目的]为了更好的了解泡泡刺黄酮类生物合成途径及其潜在的抗逆作用,[方法]应用高通量RNA-seq测序技术对泡泡刺当年生新叶进行了转录组测序及相关生物信息学分析。[结果]表明:泡泡刺当年生叶中获得了13 013 444 total reads,总核苷酸数为1 171 209 960 bp(1.09 Gb),组装拼接后得到48 921条unigene序列;Nr、Swiss-Prot、COG、GO、KEGG等数据库分析显示,有30 407个Nr注释,19 671个Swissprot注释,9 273个COG功能注释,46 153个GO功能注释,13 654个KEGG注释,并从KEGG通路中找到参与黄酮类化合物合成途径的关键基因片段186个。[结论]本研究获得了较好的泡泡刺转录组序列信息,并且其中富含黄酮类化合物代谢途径的相关基因,这为其抗逆机制、药用价值的研究及开发利用提供宝贵资源。