GPNMB通过调控MITF下游色素相关基因表达影响黑色素细胞色素的生成

【目的】探究GPNMB是否会通过调控MITF及其下游色素相关基因的表达来影响黑色素细胞中色素的生成,为进一步阐明GPNMB对黑色素细胞中色素生成的具体机制提供理论依据。【方法】首先对小鼠GPNMB核酸序列进行检索,通过对GPNMB和慢病毒表达载体序列分析来筛选出合适的酶切位点,在此选取SalⅠ和XbaⅠ作为酶切位点。并对GPNMB基因序列设计含有SalⅠ和XbaⅠ酶切位点的全长引物,克隆GPNMB基因全长序列,将含有酶切位点的GPNMB基因片段与T载体进行连接,送华大基因测序。将构建成功的T载体提取质粒,双酶切后将其与含有绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒表达载体相连接,送华大基因进一步测序确认。使用质粒中提试剂盒获得大量去内毒素的GPNMB慢病毒真核表达载体。通过体外培养小鼠黑色素细胞,选择细胞对数生长期利用细胞转染技术过量表达GPNMB。观察转染后黑色素细胞形态特征变化和绿色荧光蛋白的表达量,收集黑色素细胞,并对其进行转染效率验证,黑色素含量进行测定,以及经Real-time PCR和Western blot检测转染后PMEL、MITF、TYR、TYRP1、TYRP2和OA1的mRNA和蛋白的表达量。【结果】与正常组(Control)相比试验组(Vector-GFP-GPNMB)、空载组(Vector-GFP)中黑色素细胞的形态特征无明显变化,并且试验组、空载组的绿色荧光蛋白表达量显示5μg DNA/孔转染效率最高。相对于空载组和正常组,试验组的GPNMB mRNA和蛋白水平都显著的升高(P0.01)。与空载组相比,试验组黑色素含量升高1.34倍,差异显著(P0.01)。Real-time PCR检测结果显示,MITF mRNA显著降低2.25倍(P0.01);PMEL mRNA显著升高1.59倍(P0.05);TYRP1 mRNA显著升高2.35倍(P0.01);TYRP2 mRNA显著升高1.60倍(P0.01);TYR mRNA升高1.65倍和OA1 mRNA升高1.5倍,但变化不明显。Western blot检测结果显示,MITF蛋白显著降低1.59倍(P0.01);TYR蛋白显著升高1.23倍(P0.01);TYRP2蛋白显著升高4.35倍(P0.01);OA1蛋白显著升高1.31倍(P0.05);TYRP1蛋白升高1.05倍,但变化不明显。【结论】GPNMB过量表达使MITF下游基因PMEL、TYR、TYRP1、TYRP2和OA1的表达量增加,却使MITF的表达量降低,由此表明GPNMB可能受非MITF调控路径调节PMEL、TYR、TYRP1、TYRP2和OA1的表达,从而影响黑色素的生成。     

黑色素细胞中过量表达Pax6~(10Neu)基因对MITF和TYR的影响

【目的】MITF和β-catenin是黑色素生成通路中重要的调节基因,而Pax6通过调控MITF和β-catenin来调控黑色素细胞的黑色素生成,通过对只含有正常Pax6 paird domain的前102个氨基酸的Pax6~(10Neu)的研究,来探究Pax6~(10Neu)是否还有生物学功能,以及Pax6对其下游基因的作用机理。【方法】根据NCBI查找到的Pax6~(10Neu)基因序列设计PCR引物,克隆Pax6~(10Neu),收集所得基因片段送华大基因测序确认。后通过对Pax6~(10Neu)和慢病毒表达载体的序列分析来筛选合适的酶切位点,通过分析选取Sal I和Xba I作为酶切位点,设计含有Sal I和Xba I酶切位点的PCR引物,大量克隆Pax6~(10Neu)基因,从而通过胶回收得到含有Sal I和Xba I酶切位点的Pax6~(10Neu)基因。将含有酶切位点的目的片段与T载体相连,并送华大基因测序。将与T载体连接成功的质粒导入感受态细胞使其大量扩增,提取质粒,双酶切后,胶回收,得到大量含有Sal I和Xba I酶切位点的Pax6~(10Neu)基因片段,将其与含有小鼠tyrp2特异性启动子和绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒表达载体相连接,送华大基因测序确认。将连接好的慢病毒表达载体导入感受态细胞使其大量扩增,通过质粒中提试剂盒获得大量去内毒素的Pax6~(10Neu)慢病毒真核表达载体。将慢病毒真核表达载体通过细胞转染导入到培养的绵羊黑色素细胞中,使其过量表达。收集细胞,分别通过观察绿色荧光蛋白和使用RT-PCR来检测转染效率,使用RT-PCR和Western blot来检测MITF和TYR在m RNA和蛋白水平的变化,同时检测黑色素细胞中黑色素生成量的变化。【结果】与正常组相比,在m RNA水平,MITF显著升高3.2倍(P0.05),TYR升高1.31倍,由此得出,Pax6~(10Neu)可以有效促进MITF m RNA的产生,对TYR m RNA产生的影响不是太显著;在蛋白质水平,MITF显著升高8.24倍(P0.001),TYR显著升高2.09倍(P0.001),由此得出,Pax6~(10Neu)可以显著提高MITF、TYR蛋白的产生;同时黑色素细胞产生黑色素的量显著升高1.22倍(P0.05),由此得出Pax6~(10Neu)可以有效促进黑色素细胞黑色素的生成。【结论】只含有正常Pax6 paird domain前102个氨基酸的Pax6~(10Neu),仍然可以在黑色素细胞中与MITF相互作用,同时间接调控TYR的表达,从而使黑色素细胞黑色素的生成量发生改变。     

Pax6 PAI亚结构域在黑色素细胞中对MITF、TYR、TYRP1和TYRP2的影响

【目的】高度保守的PAX转录因子家族在黑色素细胞的分化和黑色素的生成中起重要的作用,其家族共有的PD结构域是其与下游基因结合的主要位点,而PD结构域氨基端的PAI亚结构域在其与下游基因的结合过程中发挥重要的作用。研究表明Pax6在视网膜上皮黑色素细胞的分化中发挥至关重要的作用,本试验借助研究Pax6 PAI亚结构域的功能来对PAX转录因子家族共有的PD结构域和PAI亚结构域进行研究。【方法】首先通过Psipred对Pax6 PD结构域的结构进行分析,使用NCBI对Pax6 PD结构域与下游基因的结合位点进行分析,使用Jaspar对MITF、TYR、TYRP1和TYRP2启动子中Pax6 PD结构域可能的作用位点进行预测。使用普通PCR克隆Pax6PAI亚结构域,将其连入T载体,酶切后连入慢病毒载体,并送公司测序确认。将构建好的PAI亚结构域过表达载体通过细胞转染导入到培养的小鼠黑色素细胞中,使其过量表达。收集细胞,分别通过观察绿色荧光蛋白检测转染效率,使用RT-PCR和Western blot来检测MITF、TYR、TYRP1和TYRP2在m RNA和蛋白水平的变化,同时检测黑色素细胞中黑色素生成量的变化。【结果】通过NCBI分析可知,Pax6 PD结构域与下游基因的作用位点主要集中在氨基端的PAI亚结构域。通过Jaspar预测分析,得知,MITF启动子-695处存在Pax6 PD结构域的结合位点,TYR启动子-873和-1133处存在Pax6 PD结构域的结合位点,TYRP1启动子-629处存在Pax6 PD结构域的结合位点,TYRP2启动子-655处存在Pax6 PD结构域的结合位点。在黑色素细胞中过表达Pax6 PAI亚结构域后,与空载组相比,试验组MITF m RNA升高2.05倍(P0.01),蛋白质升高1.7倍(P0.01);TYR m RNA升高2.09倍,蛋白质升高2倍(P0.05);TYRP1 m RNA升高2.93倍(P0.05),蛋白质升高1.9倍(P0.01);TYRP2 m RNA升高3.62倍(P0.01),蛋白质升高1.37倍。同时试验组的黑色素含量是空载组黑色素含量的1.33倍(P0.001)。【结论】在小鼠黑色素细胞中,过表达Pax6 PAI亚结构域可以促进MITF、TYR、TYRP1和TYRP2的表达,进而使黑色素细胞黑色素的生成量增加。     

miR-7081-5p靶向SOX6对羊驼黑色素细胞色素的调控

[目的]miR-7081-5p在白色和棕色羊驼皮肤中呈差异表达,推测miR-7081-5p可能参与色素生成.[方法]运用生物信息学和双荧光素酶报告实验对miR-7081-5p的靶基因进行预测和验证;通过脂质体转染的方法,运用qRT-PCR和Western blotting检测miR-7081-5p过表达对靶基因和黑色素生成相关基因表达水平的影响;使用碱溶法检测miR-7081-5p过表达对黑色素含量的影响;使用分光光度计检测miR-7081-5p过表达对酪氨酸酶活性的影响.[结果]生物信息学预测SOX6是miR-7081-5p靶基因之一,双荧光素酶报告实验证实SOX6是其靶基因之一.qRT-PCR和Western blotting结果显示:在羊驼黑色素细胞中,过表达miR-7081-5p显著降低了SOX6、MITF、TYR、TYRP1和TYRP2的表达,其中mRNA表达水平分别降低了40.51％、63.63％、59.22％、58.84％和63.80％,蛋白质表达水平分别降低了71.69％、65.23％、63.23％、58.52％和62.95％.黑色素含量检测结果显示:过表达miR-7081-5p显著降低了总黑色素、真黑素和褐黑素的相对含量,分别下降了49.03％,62.4％和63.8％.酪氨酸酶活性检测结果显示:过表达miR-7081-5p,黑色素细胞内酪氨酸酶活性显著降低了63.06％.[结论]miR-7081-5p靶向SOX6抑制了羊驼黑色素细胞的色素生成.     

内皮素3对不同毛色绵羊黑色素细胞的影响

【目的】探索内皮素3(EDN3)对来源于不同毛色体外培养的黑色素细胞产生黑色素作用机制及差异的影响。【方法】体外培养不同毛色皮肤来源的黑色素细胞,通过MTT法检测不同细胞在EDN3影响下的增殖率,分别提取两种细胞的总RNA和总蛋白,总RNA经反转录合成c DNA,采用实时荧光定量PCR方法检测EDN3对两种细胞内EDNRB、NRas及TYR在m RNA水平相对表达量的影响,总蛋白通过Western blot方法检测EDN3对两种细胞内EDNRB、NRas及TYR在蛋白水平的表达量是否发生变化,结果均使用SPSS19.0软件进行差异显著性分析。【结果】MTT法测得EDN3对黑白两种来源的黑色素细胞的增殖均产生促进作用,实时荧光定量PCR结果显示添加EDN3的白色来源细胞内EDNRB m RNA的相对表达量是正常细胞组的1.7992倍,NRas是正常细胞组的1.8536倍差异极显著(P0.01),但TYR m RNA的相对表达量未发生明显变化;添加EDN3的黑色来源细胞内EDNRB m RNA的相对表达量是正常细胞组的2.2512倍,NRas是正常细胞组的1.3859倍,TYR是正常细胞组的15.5710倍差异极显著(P0.01);Western blot结果显示添加EDN3的白色来源细胞内EDNRB蛋白表达量是正常细胞组的3.0827倍差异极显著(P0.01),NRas是正常细胞组的1.2936倍差异显著(P0.05),TYR蛋白表达量未发生明显变化;添加EDN3的黑色来源细胞内EDNRB蛋白表达量是正常细胞组的3.9800倍差异极显著(P0.01),NRas是正常细胞组的1.3658倍差异显著(P0.05),TYR是正常细胞组的1.8498倍差异显著(P0.05)。【结论】EDN3促进白色来源的黑色素细胞增殖但对色素合成的限速酶TYR未产生促进作用;EDN3促进黑色来源的黑色素细胞增殖并可能促进黑色素生成。     

PK-15细胞中与CSFV感染相关的microRNAs筛选及miR-214的功能研究

【目的】利用制作的猪的miRNA表达谱芯片筛选猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)感染PK-15细胞后表达有差异的miRNA,并进一步探讨其中表达差异较明显的miRNA的作用和功能,从miRNA的角度探究CSFV的致病机制,为猪瘟(classical swine fever,CSF)的防控提供新依据。【方法】为了研究CSFV感染PK-15细胞后miRNA表达的变化情况,根据miRBase version 19.0数据库中326条猪的miRNA合成探针,采用原位合成技术制作表达谱芯片,筛选得到CSFV感染PK-15细胞后表达有差异的miRNA。挑选CSFV感染PK-15细胞后表达差异最明显的miR-214作为进一步研究对象,研究miR-214在CSFV感染过程中的功能和作用。CSFV感染PK-15细胞后,用荧光定量PCR检测miR-214的mRNA表达水平。为了进一步研究miR-214对CSFV感染的影响,合成miR-214模拟物及抑制物,并分别转染PK-15细胞,转染后24 h感染CSFV,感染后48h用荧光定量PCR检测CSFV的基因拷贝数,用间接免疫荧光方法检测CSFV的病毒滴度。为了进一步探究miR-214参与调控CSFV复制的机制,通过生物信息学软件预测miR-214参与调控CSFV复制的靶蛋白,并用荧光素酶报告基因系统进一步确证miR-214能够靶向作用于凋亡通路中重要分子TNFR1相关的死亡区域蛋白(TNF Receptor-Associated Death Domain,TRADD),因此猜测miR-214通过影响靶蛋白TRADD的表达水平从而影响PK-15细胞凋亡,将miR-214模拟物及抑制物分别转染PK-15细胞,转染后24 h感染CSFV,同步设立不感染CSFV的细胞对照,感染后48 h用荧光定量PCR和Western blot分别检测TRADD的mRNA和蛋白表达量的变化,同时用流式细胞术检测miR-214对CSFV感染的PK-15细胞凋亡的影响。【结果】CSFV感染PK-15细胞后,通过表达谱芯片技术筛选得到69条表达有差异的miRNA,其中miR-214表达量上调且差异最明显。qRT-PCR结果显示,CSFV感染PK-15细胞后miR-214的mRNA表达量上调,验证了表达谱芯片的结果。将miR-214模拟物转染PK-15细胞后再感染CSFV, CSFV的基因拷贝数及病毒滴度均显著下降;转染miR-214抑制物后再感染CSFV,CSFV的基因拷贝数及病毒滴度均显著上升,表明miR-214促进了CSFV的复制。为了进一步探究miR-214促进CSFV复制的机制,用生物信息学软件预测TRADD为miR-214的靶蛋白,荧光素酶报告基因系统验证了miR-214能够靶向作用于TRADD。转染miR-214模拟物后,PK-15细胞中TRADD的mRNA和蛋白表达量均显著上升,而转染miR-214抑制物后,PK-15细胞中TRADD的mRNA和蛋白表达量均显著下降,表明miR-214抑制TRADD的表达。通过流式细胞术,验证了CSFV感染PK-15抑制细胞凋亡,miR-214抑制CSFV感染的PK-15细胞凋亡。【结论】CSFV感染PK-15后,上调细胞内miR-214的表达。miR-214能通过靶向抑制TRADD蛋白的表达,从而抑制PK-15细胞凋亡,促进CSFV在细胞内的复制。     

miR-663通过靶向TGF-β1调控羊驼黑色素细胞的黑色素生成

【目的】预测和验证羊驼TGF-β1是mi R-663的靶基因之一,并对mi R-663介导的TGF-β1在黑色素生成过程中的作用进行研究。【方法】利用Targetscan、RNAhybrid和RNA22在线预测mi R-663的靶基因,并对靶基因3′UTR区可能的mi R-663的作用位点进行分析。利用DNAMAN软件分析比对羊驼、人和牛等哺乳动物TGF-β1-3′UTR区的相似性。利用SacⅠ和XbaⅠ将羊驼TGF-β1基因的3′UTR区插入pmir GLO构建双荧光报告载体pmir GLO-TGF-β1-3′UTR并与mi R-663 mimic共转染293T细胞,通过测定荧光素酶活性来验证mi R-663的直接靶基因是TGF-β1。在羊驼黑色素细胞中通过转染mi R-663 mimic来过表达mi R-663,并利用q RT-PCR和Western blotting检测mi R-663过表达后细胞中TGF-β1、Smad3、Smad4、Smad7和β-catenin分别在m RNA和蛋白水平的变化及黑色素含量的变化。【结果】软件预测显示mi R-663有68个保守的靶基因,包含74个保守的靶位点和44个非保守靶位点。TGF-β1是mi R-663的靶基因之一,且已被证明与毛囊发育和黑色素生成相关。不同物种的TGF-β1基因的3′UTR区相似性较高且均存在多个保守的mi R-663靶位点。克隆了羊驼TGF-β1基因3′UTR区发现存在3个保守的mi R-663靶位点。成功构建包含3个mi R-663作用位点的pmir GLO-TGF-β1-3′UTR双荧光报告载体并与mi R-663 mimic共转染293T细胞。双荧光素酶报告基因检测结果显示:与对照组相比,试验组pmir GLO-TGF-β1-3′UTR+mi R-663 mimic荧光素酶活性下调31.01%,表明TGF-β1是mi R-663直接的靶基因。在羊驼黑色素细胞中转染mi R-663 mimic后:mi R-663表达量上调334倍,TGF-β1、β-catenin、Smad4基因的表达量分别下调89%、41%、34%;TGF-β1蛋白表达量下降了21%,β-catenin蛋白表达量无明显差异;黑色素细胞中的黑色素含量下降42%。【结论】TGF-β1是mi R-663的直接靶基因。mi R-663通过调控TGF-β1的表达而影响TGF-β/Smad和Wnt信号通路,进而影响羊驼黑色素细胞中的黑色素生成。     

藏绵羊不同毛色皮肤组织miRNA表达谱及靶基因分析

【目的】藏绵羊又称藏系绵羊,是中国三大粗毛羊品种之一,主要分布在西藏及其毗邻的高寒牧区,如青海、甘肃、四川、云南等地。藏绵羊由于其被毛纤维粗长,毛质细腻且保暖性好,是制造藏式地毯的上好原料。而毛色作为一种重要的经济性状,同时制约羊毛的经济价值。然而,目前对于绵羊毛色的分子调控机制尚不明确,以藏绵羊为研究对象,对其不同颜色皮肤组织（黑色和白色）进行转录组测序,旨在探讨miRNA在藏绵羊不同毛色皮肤组织转录后水平中发挥的作用及其可能参与的调控通路。【方法】选取2只具有黑白花毛色的健康藏绵羊,减去体侧被毛使皮肤完全裸露并用75%酒精消毒处理,屠宰后快速切取皮肤组织并保存在组织样品保存液中防止RNA降解,提取RNA后通过miRNA测序和生物信息学分析,获得藏绵羊不同毛色（黑色和白色）皮肤组织miRNA表达谱,筛选组织差异表达miRNA并预测相关靶基因。通过靶基因分析,获得与调控藏绵羊毛色性状可能相关的信号通路。【结果】黑色和白色皮肤组织共获得85.76兆条原始读长,经过滤后得到85.08兆条clean reads;共鉴定出334个已知的miRNA和59个新的miRNA;从中获得23个差异表达miRNA,其中14个差异表达miRNA在白色皮肤组织中表达显著上调,9个表达下调。miR-2284b和miR-744仅在藏绵羊白色皮肤中表达,而miR-23b、miR-411a-5p、miR-30c、miR-423-3p和miR-324-5p则仅在藏绵羊黑色皮肤中表达,但表达量相对较低。表达量最高的miRNA为miR-10a,而倍数差异最大的为miR-23b。其中,miR-10a可参与调节多种信号通路,其作用涉及增殖、分化、凋亡、细胞粘附等各个方面,目前并无调控绵羊毛色方面的相关报道,但其功能及作用机制的研究仍在不断扩展。miR-23b则与Wnt、Notch等信号通路有关,这些信号通路中的部分基因也和黑色素的生成有密切关系。结合倍数差异和miRNA表达量分析,miR-411a-5p、miR103和miR-200b可能也和毛色调控密切相关。本研究共预测出981个靶基因可能参与毛色调控,多数基因和WNT信号通路、MAPK通路、EDNRB信号通路及黑素原生成通路（melanogenesis pathway）相关,其中黑素原生成通路显示和WNT信号通路、KIT信号通路及EDNRB信号通路相互关联。黑素原生成通路显示藏绵羊不同毛色可能最终通过MITF基因调控下游的TYR基因（酪氨酸酶基因）影响黑色素的合成。同时,筛选7个差异表达miRNA进行定量验证,结果表明,5个miRNA在黑色皮肤组织中上调表达,2个miRNA在白色组织中上调表达,定量结果与测序结果一致。【结论】获得了藏绵羊皮肤组织miRNA表达谱,并通过生物信息学分析得到可能和调控毛色性状相关的miRNA和信号通路。这些结果表明,藏绵羊毛色性状可能受到多种miRNA的调控并涉及多个信号通路,这有助于更进一步了解毛色转录后水平的调控过程,并对进一步的功能验证奠定基础。     

POMC在不同毛色绵羊皮肤中的表达与定位

【目的】对不同毛色绵羊皮肤中的阿黑皮素原（proopiomelanocortin,POMC）进行定位和表达差异分析,确定POMC与毛色形成的关系,进一步丰富有关哺乳动物毛色形成机制的理论知识。【方法】选取年龄相近的雄性黑色和白色成年绵羊各3只,用取皮器分别在臀部采集皮肤组织3块,对其中一块制作石蜡切片后采用免疫组织化学法确定POMC在不同绵羊皮肤中的定位,另两块置于液氮中冻存后分别提取皮肤总RNA和总蛋白,总RNA经反转录成cDNA后,经NCBI分析比对后设计POMC特异性PCR引物,采用QRT-PCR方法检测POMC基因在mRNA水平的表达差异;总蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳后,采用Western blotting方法加入POMC多克隆抗体检测POMC在蛋白水平的表达差异,得出的数据用SPSS19.0软件进行差异显著性分析,探讨POMC对毛色形成机制的调控作用。【结果】免疫组织化学结果显示POMC在黑色和白色绵羊皮肤中均有表达,且表达部位都位于毛囊根鞘周围和表皮的皮肤角质形成层细胞内;QRT-PCR结果显示POMC在黑色绵羊皮肤中mRNA的相对表达量为2.5004±0.2577^**,而在白色绵羊皮肤中POMC的mRNA的相对表达量为1.0032±0.0350,黑色绵羊皮肤中POMC的mRNA的相对表达量为白色绵羊皮肤的2.5倍,二者表达差异极显著（P＜0.01）;Western boltting结果显示黑色绵羊皮肤POMC蛋白水平相对表达量为1.5253±0.0426^*,而白色皮肤中POMC蛋白水平相对表达量为1.0005±0.0180,黑色皮肤POMC蛋白表达量是白色皮肤的1.55倍（P＜0.05）,两者差异显著。【结论】试验表明POMC可在黑色和白色绵羊皮肤中正常表达,且其表达位置一致,但POMC在不同毛色绵羊皮肤组织中mRNA和蛋白的表达水平存在一定的差异,表明POMC的表达量变化会在一定程度上影响毛色的生成。