拟南芥叶绿体血红素加氧酶AtHO1基因的克隆和多克隆抗血清制备

为研究叶绿体血红素加氧酶HO1的生物学功能和分子作用机制,构建了拟南芥血红素加氧酶基因AtHO1的重组融合蛋白表达载体pET28a-AtHO1,质粒转化到Escherichia coli BL21(DE3)中诱导表达重组蛋白。经SDS-PAGE电泳检测,AtHO1的重组融合蛋白获得了高效表达,分子质量为28～36ku,且为可溶蛋白。重组蛋白经Ni-NTA亲和层析法纯化后,得到纯度较高的蛋白。纯化产物免疫新西兰大耳兔获得了专一识别重组蛋白6×His-AtHO1的抗血清,进一步提取拟南芥和水稻叶片总蛋白,蛋白质印迹检测显示,在分子质量28～36ku之间出现特异性条带,证明用重组蛋白6×His-AtHO1制备的多克隆抗血清可以与拟南芥和水稻HO1蛋白特异性结合,说明拟南芥HO1的抗血清能够用于水稻HO1的功能分析和应用研究。     

稻瘟菌激发子对油菜光合作用及菌核病抗性的影响

以甘蓝型油菜中双9号为试验材料,研究了稻瘟菌激发子溶液对油菜叶片光合作用、菌核病抗性以及叶片 蛋白质表达的影响.研究结果表明:用稻瘟菌激发子喷施油菜叶片能提高油菜的光合速率、增强油菜叶片对油菜菌 核病的抗性.该激发子的使用可诱导油菜叶片中至少5种蛋白质表达量的显著增加.经鉴定,5种蛋白分别为过氧 化物酶、核酮糖1,5 二磷酸羧化酶/加氧酶大亚基、黑芥子酶、苹果酸脱氢酶和一个可能与分子伴侣10功能近似 的蛋白.     

稻瘟菌糖蛋白激发子CSBⅠ纯化过程的优化

利用蛋白纯化系统AKTA Purifier 100对来源于稻瘟菌(Magnaporthe grisea)ZC13菌株97-151a菌丝细胞壁的糖蛋白激发子CSBⅠ进行纯化过程的优化。离子交换层析条件的选择结果表明:弱阴离子柱DE-AE-Sepharose FF和Tris-HCl缓冲体系的洗脱效果较好。新的步骤是:选用YM30膜超滤,省略ConA-Sepha-rose 4B亲和层析,粗激发子过凝胶柱Sephacryl S-100,阴离子柱DEAE-Sepharose FF,获得的活性峰D3,即为纯化的CSBⅠ。随着激发子的逐步纯化,其诱导不同水稻品系叶片中的POD比活相应显著升高(P<0.01),CSBⅠ的诱导活性最高。该纯化方法简便,重现性稳定,提高了纯化效率。     

水稻VDAC3蛋白的可溶性外源表达及纯化

[目的]获得外源表达的可溶性水稻VDAC3蛋白.[方法]将osvdac3基因克隆到含有GST标签的pGEX-4T-1原核表达载体中,转化入BL21表达菌株,经IPTG诱导,并使用SDS-PAGE和Western Blot检测分析表达产物,通过Glutathione Resin亲和层析系统纯化获得较纯的目的蛋白.[结果]试验成功构建了pGEX-4T-1-osvdac3原核表达载体并转化大肠杆菌.通过SDS-PAGE和Western Blot试验证实56 kD处的蛋白条带是具有可溶性表达的VDAC3蛋白.[结论]经Glutathione Resin亲和层析系统纯化得到可溶性带GST标签的VDAC3蛋白.该研究结果为水稻VDAC蛋白的功能研究进一步奠定了基础.     

OsCtBP-A基因过量表达和RNAi沉默对水稻根系生长和抗性的影响

为了阐明己克隆的水稻C端结合蛋白家族基因OsCtBP-A的功能,构建了该基因的过量表达和RNAi沉默载体,通过农杆菌介导转化水稻品种日本晴愈伤组织,分别获得了45个过量表达和75个RNAi 沉默T0代转基因植株,并进行了PCR和GUS染色鉴定。T1代过量表达株OsCtBP-A基因表达量明显增加,苗期根系生长增加,对水稻白叶枯病抗性无明显变化;而基因沉默株OsCtBP-A基因表达量显著下降,苗期根系发育迟缓,抗旱性明显降低,抗病性减弱。表明OsCtBP-A基因的表达可能对水稻苗期根系发育、抗旱性和抗病性具有不同程度的调控作用。     

极细链格孢菌蛋白激发子PeaT1在酵母双杂交系统中转录激活活性的检测

2000年笔者从植物病原真菌中提取获得一类新型蛋白激发子,它能提高植物自身免疫力,促进植物生长,提高作物产量和产品品质。并在研究该类蛋白的过程中,从极细链格孢菌中分离纯化到1种能诱导植物产生系统抗性、促进植物生长的蛋白,并进一步克隆了编码该蛋白的基因peaT1(Genbank登     

使用TEV-LIC克隆与表达系统对蛋白激发子PebC1的纯化

PebC1是来自于灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）的蛋白激发子,具有提高植物综合抗逆性的功能,可以开发为生物农药。由于该蛋白自身性质原因,如结合杂蛋白、形成二聚体等,难于得到纯蛋白,不利于进行进一步的研究。将该蛋白的编码基因克隆到TEV-LIC表达载体系统,并对该蛋白进行了表达,使用His标签和MBP标签...     

水稻蛋白OsOlel在大肠杆菌中的诱导表达

[目的]在大肠杆菌中诱导表达水稻蛋白OsOle1。[方法]RT-PCR克隆水稻基因OsOle1,构建原核表达载体pGEX-2T-OsOle1-GST,在大肠杆菌BL21中诱导表达该蛋白,并采用GST凝胶亲和层析进行纯化。[结果]水稻蛋白OsOle1具有典型的Olee1蛋白家族的保守域,N端1～24位氨基酸为预测的信号肽序列。成功地将水稻蛋白OsOle1在大肠杆菌中进行了诱导表达,并用GST亲和层析进行了纯化。[结论]该研究为以后进一步研究水稻蛋白OsOle1的生理功能奠定了基础。     

海州香薷金属硫蛋白(EhMT1)的原核表达和纯化及其多克隆抗体的制备

为研究耐铜植物海州香薷的金属硫蛋白(EhMT1)的结构与功能,运用分子生物学方法构建了pGEX-2T-EhMT1重组表达载体,经转化大肠杆菌BL21(DE3)后表达得到大小为33×103左右的融合蛋白GST-EhMT1,与预期结果一致.对融合蛋白诱导表达的温度、时间、IPTG诱导浓度等条件进行了优化,成功构建了能大量表达可溶性GST-EhMT1的优良原核表达体系.诱导表达的融合蛋白经GST-Sepharose亲和层析纯化后,每升菌液获得的可溶性融合蛋白高达70 mg.用纯化的融合蛋白免疫新西兰雄兔,制备的抗血清经间接ELISA检测到较高的多克隆抗体效价.蛋白质印迹结果显示,纯化的蛋白质与兔抗血清可以特异性结合.     

斑马鱼Tph1a蛋白表达、纯化及对脂代谢基因的影响

对斑马鱼色氨酸羟化酶1a(Tph1a)进行原核表达、纯化,探究其在斑马鱼脂代谢中的作用.根据大肠埃希菌的偏爱密码序列,优化斑马鱼tph1a编码区,插入原核表达载体pET-28a,构建融合蛋白表达质粒,并诱导表达、纯化和复性后,腹腔注射斑马鱼,检测其对脂代谢基因表达的影响.结果表明:重组蛋白Tph1a表达形式为包涵体;纯化和复性后的蛋白质具有57 ku的特异性条带;腹腔注射复性蛋白后,高脂组斑马鱼acc、pgc1a基因等表达上调,lpl基因表达下调,且pgc1a基因的表达丰度远高于其他脂代谢基因.这一研究成功构建了原核表达载体pET-28a-tph1a,获得体外高效表达;该蛋白质不仅诱导肥胖斑马鱼的长链脂肪酸合成阻滞,更促进脂肪酸氧化与分解,为探究Tph1a在鱼类脂代谢调控中的功能奠定了基础.     

水稻OsRFP1基因的原核表达与蛋白纯化

以推导的氨基酸序列分析,水稻OsRFP1基因编码一分子量为34.24kDa锌指蛋白。将OsRFP1基因编码区cDNA序列插入到pGEX4T-3载体中构建OsRFP1-gst融合基因的表达载体,并将质粒转化宿主菌大肠杆菌BL21DE3。经IPTG诱导,融合蛋白在BL21DE3细胞中获得表达。利用亲和层析的方法对融合蛋白进行了纯化,SDS-PAGE蛋白电泳显示获得一60kDa的唯一蛋白条带,即OsRFP1-GST融合蛋白。     

一个水稻DEAD盒RNA解旋酶基因OsBIRH1的克隆鉴定及其蛋白纯化

克隆鉴定了一个水稻DEAD盒RNA解旋酶基因OsBIRH1。OsBIRH1基因全长cDNA由2 167个核苷酸组成,包含1个长1 926个核苷酸的开放阅读框,编码1个由641个氨基酸组成的蛋白,预测分子量为70.8kD。OsBIRH1基因位于水稻第3号染色体上,由8个外显子和7个内含子组成。预测的OsBIRH1蛋白包含DEAD盒解旋酶所特有的保守DEAD和HELICc结构域以及保守模体结构。系统进化树分析表明,OsBIRH1与拟南芥和人DEAD盒解旋酶有较高的同源性,氨基酸序列同一性为47%~54%。原核表达了OsBIRH1基因,纯化获得重组OsBIRH1融合蛋白,为OsBIRH1生化与生物学功能研究提供科学依据。     

超表达OsPR1A增强了Xa21介导的水稻对白叶枯病的抗性反应

【背景】前期研究发现,水稻病程相关蛋白质OsPR1A的表达受上游抗病基因Xa21调控,接菌后早期启动Xa21介导的OsPR1A较高水平表达对水稻抵抗白叶枯病菌至关重要。同时OsPR1A也受到水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae,Xoo）的诱导表达。对于OsPR1A的研究绝大部分是作为抗性反应发生的标志基因佐证其他基因或途径在抗性中的作用,缺乏直接的证据证实OsPR1A本身的生物学功能。【目的】通过获得OsPR1a-OX超表达转基因植株,调查其表型及农艺性状,并明确OsPR1A蛋白质表达与抗性的关系,为鉴定OsPR1A功能提供依据。【方法】通过农杆菌介导法,将构建的OsPR1a-OX转化载体转入到水稻受体4021中,利用PCR和免疫印迹（western blot,WB）技术分别在基因水平和蛋白质水平上筛选并鉴定OsPR1A超表达阳性纯合株系。在成熟期,调查OsPR1A超表达转基因植株的表型及农艺性状（株高、穗长、分蘖数、结实率和籽粒大小等）。在31℃条件下,将生长2周的水稻幼苗TP309、4021和OsPR1A超表达转基因植株接种水稻白叶枯病菌,并在接菌0、2、4、6、8、10和12 d时测量病斑长度。在接菌0、4和6 d时,收集TP309、4021和OsPR1A超表达转基因植株的水稻叶片,提取蛋白质,利用WB技术检测OsPR1A的表达特征。【结果】构建了OsPR1a-OX转化载体,并转入到受体4021中,筛选并鉴定到2个OsPR1A超表达转基因纯合株系（#704和#709）。调查了OsPR1A超表达转基因植株在成熟期的表型及农艺性状,与对照4021相比,#704和#709的株高较矮、穗长较短、分蘖数减少、结实率降低,但籽粒稍大,可能与结实率低有关。在31℃条件下,OsPR1A超表达转基因植株的病斑长度与对照4021相比明显缩短,结果具有显著性差异（P<0.05）。在接菌0、4和6 d的材料中,超表达转基因植株#704和#709中OsPR1A始终有较高水平的表达丰度,从而提高了对白叶枯病菌的抗性。【结论】采用农杆菌介导法,获得OsPR1A超表达转基因植株;超表达OsPR1A影响到水稻的正常发育过程;超表达OsPR1A后增强了Xa21介导的水稻对白叶枯病的抗性。     

Agrobacterium-mediated Transformation of Rice (Oryza sativa L.) with Atrazine Chlorohydrolase Gene (atzA)

Atrazine chlorohydrolase gene (atzA) was cloned from Arthrobacter sp. AD1. A plant expression plasmid was constructed under the control of CaMV35s promoter and was used in rice transformation. The target gene was successfully introduced into mature embryos of a japonica rice cultivar Jindao 107 by Agrobacterium- mediated transformation and hundreds of transgenic plants were obtained. The exogenous atzA gene in the transgenic plants that expressed atrazine resistance was confirmed by Southern blot hybridization. The resistance experiments by spraying transgenic rice plants with 0.133% atrazine shown that most of the transgenic rice plants exhibited the resistance to herbicide atrazine. The segregation of exogenous atzA gene in T1 progeny corresponded to the Mendelian ratio.     

水稻MAPK基因OsMPK4的克隆鉴定、蛋白表达和转基因载体构建

克隆鉴定了一个水稻促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPK)基因OsMPK4.OsMPK4基因cDNA全长1483 bp,包含一个1131 bp的开放阅读框,编码一个由376个氨基酸组成的蛋白,预测分子量为42.8 kD.OsMPK4基因位于水稻第10号染色体上,由6个外显子和5个内含子组成.OsMPK4蛋白具有MAPK的11个保守结构域及磷酸化位点TEY模体.系统进化树分析表明,OsMPK4属于B组MAPK成员,与已知水稻MAPK蛋白有56%～74%的一致性.原核表达了OsMPK4基因,纯化获得重组OsMPK4融合蛋白,并构建OsMPK4的转基因双元载体,用于OsMPK4的生化功能及其生物学功能研究.     

转苋色藜NDR1基因水稻的获得及对白叶枯病抗性的初步研究

NDR1(non-race-specific disease resistance)基因能介导植物广谱抗病,在植物的防御反应中发挥重要作用。以特色抗病植物苋色藜为材料,克隆并鉴定了NDR1的同源基因Ca NDR1a和Ca NDR1b。在此基础上,利用该基因分别构建植物表达载体,农杆菌介导转化法获得转基因水稻,经PCR和Southern杂交证明外源基因已整合到水稻基因组中。选取部分株系进行水稻白叶枯病抗性鉴定,记录接种后3 d、5 d、10 d的叶片病斑长度,结果表明:转Ca NDR1a、Ca NDR1b基因水稻对白叶枯病具有一定的抗性,可延迟发病。外源基因在转基因水稻植株中均有较高水平表达,但抗病性较好株系Ca NDR1基因的表达量并非最高。农艺性状调查结果显示多数转基因植株株高较对照组矮,但结实率、千粒重等农艺性状与对照组相比并无显著差异。