实时荧光定量PCR方法检测猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒

根据GenBank发表的猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的保守区域的序列分别设计了2对特异性引物。建立了一种快速检测CSFV和PRRSV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,并用该方法检测采集的临床疑似病料。结果表明,建立的CSFV、PRRSV-SYBR GreenⅠPCR有较好的特异性,敏感性和重复性,可以用于CSFV和PRRSV的检测。     

种公猪精液携带猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒调查

为了对种公猪精液中猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒带毒情况进行调查,我们对昆明周边地区的部分猪场进行了猪繁殖与呼吸障碍综合征病原调查。从猪场采集了182份样品送往实验室进行RNA提取及PCR扩增,再经琼脂糖凝胶电泳鉴定,其中有64份精液样品中猪繁殖与呼吸障碍综合征病原鉴定为阳性,阳性率为35.16%,提示精液中带毒。该调查为我们后期预防和控制猪场的猪繁殖与呼吸障碍综合征病原提供了一定的基础数据及研究方向。     

双重RT-PGR方法检测猪流感病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒

为建立特异、敏感的猪流感病毒(SIV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的双重RT-PCR检测方法,本研究根据GenBank登录的SIV M基因保守序列和PRRSV美洲型毒株的N基因保守序列,设计合成了2对特异引物,通过对扩增条件的优化,建立检测SIV和PRRSV的双重RT-PCR方法.检测结果显示:该方法可同时扩增出SIV(345 bp)和PRRSv(520 bp)的特异性片段;而猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型及阴性鸡胚尿囊液核酸扩增结果均为阴性;对SIV和PRRSV 2种病毒混合液的最小检出量分别为102 EID50/0.1 mL和103TCID50/0.1 mL.应用双重RT-PCR和病毒分离法对12份临床疑似样品进行对比检测,结果表明:除双重RT-PCR检测到双阳性的3份混合感染病料中1份未分离到PRRSV外,其余2份均分离出病毒.证明该方法具有良好的特异性、敏感性,可以用于临床样品的早期快速检测.     

双重RT-PCR方法检测猪流感病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒

为建立特异、敏感的猪流感病毒(SIV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的双重RT-PCR检测方法,本研究根据GenBank登录的SIVM基因保守序列和PRRSV美洲型毒株的N基因保守序列,设计合成了2对特异引物,通过对扩增条件的优化,建立检测SIV和PRRSV的双重RT-PCR方法。检测结果显示:该方法可同时扩增出SIV(345bp)和PRRSV(520bp)的特异性片段;而猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型及阴性鸡胚尿囊液核酸扩增结果均为阴性;对SIV和PRRSV2种病毒混合液的最小检出量分别为102EID50/0.1mL和103TCID50/0.1mL。应用双重RT-PCR和病毒分离法对12份临床疑似样品进行对比检测,结果表明:除双重RT-PCR检测到双阳性的3份混合感染病料中1份未分离到PRRSV外,其余2份均分离出病毒。证明该方法具有良好的特异性、敏感性,可以用于临床样品的早期快速检测。     

用PCR法检测猪繁殖-呼吸综合征病毒和猪圆环病毒混合感染病例研究

根据已发表的猪繁殖-呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)的核苷酸序列设计特异性引物，应用PCR方法对从福清市某养猪场病猪采集的淋巴结、肺、脾等器官组织病料进行检测，发现该猪场病猪病料的检测结果PRRSV和PCV-2同时为阳性，从而证实了PRRSV和PCV-2在该病猪体内混合感染。     

斑点杂交法检测猪繁殖与呼吸综合征病毒

斑点杂交技术是一种快速、稳定、高通量的检测方法,在动物疫病的诊断和流行病学调查中发挥着重要作用。在本研究中,通过RT-PCR扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)SD1株ORF7基因,并以其为模板,制备地高辛标记cDNA探针,并进行了特异性和敏感性检测。利用该探针对50份临床病料进行PRRSV检测,并与RT-PCR进行了比较,结果显示,斑点杂交结果与RT-PCR结果完全一致,探针敏感性和特异性亦较高,说明本研究建立的斑点杂交方法可用于PRRSV临床检测与免疫监测。     

用微量IFA法检测猪繁殖呼吸综合征

用微量培养板作载体，建立了检测猪繁殖呼吸综合征的微量间接荧光抗体法（ＩＦＡ）。比较试验证明，微量ＩＦＡ与美国“室玻片ＩＦＡ”有相同的敏感性和特异性。     

多重PCR检测猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪流感病毒

应用Primer3.0和Omega2.0,根据猪伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪流感病毒(SIV)保守基因设计了3对多重PCR引物,建立PRRSV,SIV和PRV单项PCR检测方法,并在优化单项PCR反应条件(引物浓度、Mg2 浓度、退火温度等)基础上,初步建立了PRRSV-PRV-SIV多重PCR检测方法,并分别用多重PCR和单项PCR/RT-PCR检测10份临床病料,两者符合率为96.6%,表明该多重PCR检测方法有较高的敏感度,可以用于临床病料的检测。     

Real-time PCR方法和PCR方法检测虾白斑综合征病毒

由白斑综合征病毒引起的虾白斑综合征是国际兽医局（OIE）规定的必须上报的水生动物二类疫病。本研究首先通过设计新的PCR引物，提高了PCR检测白斑综合征病毒的阳性检出率。为进一步提高白斑综合征病毒检测的灵敏度，本研究采用TaqMan探针技术建立了快速检测白斑综合征病毒的real-time PCR方法，通过与常规PCR方法比较，证实其检测灵敏度显著提高。     

猪繁殖与呼吸综合征的公猪感染情况和检测研究进展

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)因其传播途径多,传播范围广并具有高度变异性,可通过抑制宿主免疫系统,造成混合感染,从而造成养猪业每年损失惨重。同时PRRSV能在公猪的精液中检测到,并影响公猪精液的质量,能通过配种途径感染母猪感染并产下带毒仔猪,仔猪自身排毒污染环境引起连锁反应,造成巨大的经济损失。该病检测方法很多,其中荧光定量PCR(RT-FQ-PCR)具有敏感性高,重复性好,特异性强的特点,并能准确的检测出精液中的病毒含量,可作为PRRSV的主要检测方法。     

用免疫金技术检测猪繁殖与呼吸综合征病毒

用胶体金标记提纯后的兔抗猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)IgG ,建立了一种以微孔滤膜为固相载体 ,以红色胶体金为标记物的检测PRRSV的斑点免疫金渗滤法 (DIGFA)。特异性阻断试验与交叉试验证明DIGFA检测PRRSV有较高的特异性。检测 1 5份临床样本 ,其中 3份DIG FA及细胞培养均为阳性 ,电镜观察亦可见符合PRRSV特征的病毒粒子     

四种核酸染料对用LAMP方法检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的影响

本研究旨在建立一种基于颜色变化的北美洲型猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)RT-LAMP检测方法及结果判定方法,方便LAMP技术的现场检测应用。根据Gen Bank中美洲型PRRSV的保守序列设计一套LAMP引物,对反应进行优化后建立了PRRSV LAMP检测方法。对比Dye63、钙黄绿素(Calcein)、SYBR Green I和Picogreen 4种核酸染料对于LAMP反应的适用性。结果显示,只有Calcein、Dye63适于LAMP反应前加入,但对扩增效率均产生一定抑制,造成反应时间延迟:Calcein的延迟作用更强(约10min),Dye63延迟作用较小(约5min)。加入Dye63的LAMP反应灵敏度为2×101拷贝,而加入Calcein的灵敏度要低10倍。经多功能酶标仪对荧光强度的检测,含Dye63的反应阴阳性差异明显,可用于LAMP反应结果的判定。据此建立的基于新型核酸染料Dye63的PRRSV RT-LAMP检测方法操作简单、方便、直观,可大大减少环境污染造成的假阳性。Dye63有望成为继Calcein之后,可用于LAMP反应前加入,反应后闭管判定的一种新核酸染料,方便LAMP检测技术现场应用。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪鼻支原体双重PCR检测方法的建立

为建立一种快速同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪鼻支原体(Mhr)的方法,根据GenBank中已登录的PRRSV ORF 7基因序列和Mhr P37基因序列,设计2对特异性引物,通过对扩增条件进行优化,建立了能够同时检测PRRSV和Mhr的双重PCR方法。该方法可以同时扩增出PRRSV的234 bp和Mhr的737 bp特异性片段,该方法特异性好,不与其他常见猪病病原体发生交叉反应,对PRRSV和Mhr重组质粒标准品的最低检出量分别为420拷贝/μL和180拷贝/μL。用85份临床病料对本试验双重PCR技术和单项PCR技术进行对比验证,结果显示,两者的总符合率为100%。表明所建立的双重PCR特异性强,重复性好,敏感性高,为PRRSV和Mhr的快速检测提供了有效的技术支持。     

不同引物RT-PCR方法检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的比较研究

用3对分别针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的ORF7、ORF5和ORF5的PCR引物N1/N2、AdGP5.1/AdGP5.2和RFLP5.1/RFLP5.2进行RT-PCR,检测PRRSV,从其敏感性、特异性和临床样品检出率等方面进行比较,在此基础上进一步建立一步法RT-PCR检测方法。结果显示:3对引物对PRRSV均有很高的特异性;应用N1/N2引物病毒最低检测量为7.9 TC ID50,而AdGP5.1/AdGP5.2引物和RFLP5.1/RFLP5.2引物PCR最低检测量为79 TC ID50;运用N1/N2、AdGP5.1/AdGP5.2和RFLP5.1/RFLP5.2引物分别进行RT-PCR扩增检测临床样品,PRRSV检出率分别为28/48、27/48和25/48,且用AdGP5.1/AdGP5.2和RFLP5.1/RFLP5.2引物检测的阳性样品,用N1/N2引物检测也都呈阳性。运用N1/N2引物,通过一步法RT-PCR成功地从PRRSV S1株中扩增出374 bp的目的基因片段。结果表明,用N1/N2引物扩增PRRSV目的基因,其敏感性和临床样品检出率更高,更适合临床样品PRRSV的检测。     

应用PCR检测猪圆环病毒2型和猪繁殖呼吸综合征混合感染

猪圆环病毒病自1991年加拿大首次报道以来，包括我国在内的世界上许多国家和地区都报道有该病发生。近年来，该病发生呈上升趋势，给世界的养猪业造成了相当大的经济损失。目前猪圆环病毒在猪场中的感染率是很高的，它主要侵害断奶后2-3周的仔猪，发病率为20％。60％，死亡率为5％-35％。已成为阻碍当今养猪业发展的重要病原之一。     

重庆地区猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒感染检测

近年来,我国南方的猪病,特别是传染性疾病对养猪业的危害越演越烈,种类在增加,复杂程度在加剧.随着养猪业集约化程度的发展,疾病成为阻碍猪场生产发展的致命障碍.生产上,猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪瘟病毒(CSFV)野毒混合感染较为严重[1],是危害猪群健康的主要疾病,并导致多种新的病毒病和细菌病的暴发与流行.     

实时荧光定量PCR技术检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的研究进展

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染引起的一种高度接触性传染病,尤其是对母猪,该病毒严重影响其繁殖性能。实时荧光定量PCR以其快速、可靠的诊断技术,为检测和诊断PRRSV开辟了新方法。文内对国内外实时荧光定量PCR技术在PRRSV研究中的应用作了综述。     

猪繁殖和呼吸综合征病毒分子生物学研究进展

猪繁殖和呼吸综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）是引起母猪流产和仔猪呼吸道症状及死亡的一种新的重要病原。该病毒于１９９１年７月首先由荷兰分离获得（当时,称之为Ｌｅｌｙｓｔａｄ病毒,ＬＶ）,接着,德国、美国、比利时、英国、苏格兰、法国、西班牙、日本、韩国及台湾等很...     

猪瘟和猪繁殖与呼吸综合征病毒混合感染的PCR诊断

对一例临床中疑似猪瘟病毒(CSFV)或猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染病例进行了实验室PCR诊断,确诊为CSFV和PRRSV混合感染。