橡胶树PR107和CATAS8-79中胶乳蛋白的差异分析及磷酸化蛋白的鉴定

橡胶树是合成天然橡胶的重要植物。PR107和CATAS8-79是具有不同产排胶性状的2个无性系。在以往的研究中,胶乳中蛋白表达差异被认为是影响天然橡胶合成的关键因子之一。然而,这2个无性系之间与胶乳产量相关的蛋白质图谱尚未明确。本研究采用蛋白质组学方法对这些蛋白质进行鉴定,有助于探讨巴西橡胶树胶乳合成机理。经双向凝胶电泳和质谱鉴定分析,共获得65个差异表达蛋白信息。通过磷酸化蛋白质组分析,在PR107胶乳中鉴定出31个磷酸化蛋白质,含有74个磷酸化氨基酸残基,在CATAS8-79胶乳中鉴定出80个磷酸化蛋白质,含有166个磷酸化氨基酸残基。橡胶延伸因子/小橡胶粒子蛋白（REF/SRPP）家族成员被鉴定为差异表达蛋白和磷酸化修饰蛋白,这些蛋白在调节天然橡胶合成中起着重要作用。pro-hevein和hevamine也表现出不同的磷酸化修饰水平,它们主要在天然橡胶排胶过程中起作用。一种丝氨酸-苏氨酸蛋白磷酸酶激酶的磷酸化和去磷酸化修饰可能在天然橡胶合成中起调节作用。这些结果为天然橡胶生物合成调控机制的研究提供了新的理论依据。     

强割对不同排胶特性的橡胶树品系胶乳生理生化参数的影响

以不同排胶特性的巴西橡胶树 PR107 和 CATAS 8-79 无性系的成龄树为材料，研究强割处理对胶乳中橡胶生 物合成相关生理参数和基因表达的影响。结果表明，强割处理的 PR107 和 CATAS 8-79 品系的胶乳中，HblMYC1 基因 表达量均呈现先上升后降低的模式，且在强割第 3~4 刀时达最大值，后期的 HblMYC1 基因表达量低于初始水平。胶乳 干胶含量的变化趋势与 HblMYC1 基因表达量的趋势一致，而排胶时间、胶乳产量和干胶产量这 3 个生理参数也呈现先 上升后降低的趋势，但在强割的第 5~6 刀时达才到最大值，后期恢复到初始水平。对强割处理胶乳中的各项生理参数 及 HblMYC1 基因表达量进行相关性分析，发现 PR107 品系的胶乳产量、干胶含量与干胶产量三者间均呈极显著正相关， 干胶含量与 HblMYC1 基因表达呈极显著正相关；CATAS 8-79 品系的排胶时间与胶乳产量呈极显著正相关，排胶时间、 胶乳产量、干胶含量三者与干胶产量呈极显著正相关。研究结果表明，在强割条件下的胶乳生理参数和 HblMYC1 基因 表达量之间存在相关性，且能够更快速反映出橡胶树品系的橡胶生物合成特性，为利用分子生物学技术指导制定适宜 的橡胶树割胶制度提供理论依据。     

橡胶树产排胶相关基因在死皮和健康橡胶树中表达模式分析

橡胶树死皮(Tapping Panel Dryness,TPD)是天然橡胶单产提高的主要限制因子之一,给中国橡胶种植业带来巨大经济损失。本文利用RT-PCR技术分析14个产排胶相关基因在死皮和健康橡胶树树皮中表达模式。研究结果表明,有8个基因在健康橡胶树树皮中上调表达,其分别是法尼基焦磷酸合酶、小橡胶粒子蛋白、橡胶素、蔗糖转运蛋白5、橡胶延伸因子、几丁质酶、HMG辅酶A还原酶和HMG辅酶A合成酶,有4个基因在死皮橡胶树树皮中上调表达,他们分别是橡胶转移酶、牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶、蔗糖转运蛋白2a和β-1,3-葡聚糖酶;另外,蔗糖转运蛋白2b和蔗糖转运蛋白1表达模式没有发生变化。此结果为深入揭示橡胶树死皮发生分子机制提供新观点。     

巴西橡胶树HbCCoAOMT基因克隆及其表达分析

木质素是植物细胞壁的成分之一,其含量高低影响到细胞壁的弹性。橡胶树乳管膨压是割胶后胶乳排出的初动力,乳管细胞壁的物理性能可能是影响乳管膨压的因素之一。本研究采用QRT-PCR和RACE技术,从巴西橡胶树无性系CATAS7-33-97的乳管细胞中克隆到一个木质素合成关键酶CCo AOMT基因的同源基因,命名为HbCCoAOMT。该基因的开放阅读框为741 bp,编码1个由246个氨基酸残基组成的蛋白质。该蛋白质分子量为27.76 ku,理论等电点为5.255。实时荧光定量PCR结果表明,割胶和乙烯利处理均下调HbCCoAOMT基因在胶乳中的表达。该基因的表达量以及内层树皮的木质素含量在两个橡胶树品种(CATAS8-79和PR107)间存在显著差异。HbCCoAOMT差异表达可能影响到乳管细胞木质素含量和乳管细胞壁的物理性能。     

巴西橡胶树次生乳管分化能力早期预测的相关基因初步研究

目前通过常规的试割测产进行橡胶树产量育种的方法,周期长且效率低,亟须改进。橡胶树次生乳管分化能 力是决定橡胶产量的关键因子之一,因此,次生乳管分化能力的早期预测对缩短橡胶树产量育种周期具有重要意义。 本研究采用分子生物学技术,割胶处理不同次生乳管分化能力等级的橡胶树种质的杂交后代,对水囊皮组织中的茉莉 酸生物合成关键酶基因、茉莉酸途径关键环节基因和橡胶生物合成关键酶基因等 20 个基因的表达模式进行分析,并将 基因表达与橡胶树种质次生乳管分化能力等级进行相关性分析。结果发现：茉莉酸生物合成关键酶基因 HbAOCa 和橡 胶生物学合成关键酶基因 HbHevb7 在割胶处理后上调表达,且与橡胶树种质的次生乳管分化能力等级相关性较好。该 方法可用于区分橡胶树种质间次生乳管分化能力的差异。研究结果不仅可以夯实橡胶树种质的乳管分化能力的早期预 测方法,而且可为开发次生乳管分化能力的相关分子标记提供理论基础。     

渗透胁迫与植物激素等对巴西橡胶树HbMT2a基因表达的影响

采用荧光定量PCR技术分析HbMT2a基因在不同环境因子诱导下,不同部位和不同无性系间的表达模式。结果表明,不同环境条件下,表达模式有一定差异,但PEG、ABA、6-BA和IAA均上调橡胶树无性系热研7-33-97叶片和树皮中的HbMT2a基因表达;在不同器官中,HbMT2a基因的表达量在根中最高、茎中次之、叶中最低,但是,在PEG诱导条件下,HbMT2a基因上调表达的幅度在叶中最大;降低温度可上调叶片中的HbMT2a基因表达;PEG诱导2 h,HbMT2a基因在抗寒橡胶树品种云研77-4叶片中的上调表达量显著高于不抗寒橡胶树品种热垦501。HbMT2a基因的表达容易受环境因子的影响,而且在抗寒性不同的橡胶树品种间的表达模式存在明显差异,有望作为橡胶树抗性育种的一个分子标记。     

天然橡胶生物合成相关基因表达与橡胶产量的相关性

胶乳被认为是橡胶树的一种与伤害应答相关联的保护物质。割胶可以显著促进橡胶生物合成,且此促进作用与激活乳管细胞中橡胶生物合成相关基因的表达相关,但相关性大小尚不清楚。本文通过qPCR分析了正常割胶条件下,6个橡胶生物合成相关基因HbHRT2、HbSRPP、HbREF、HbHMGR1、HbHRT1、HbGAPDH在5个橡胶树魏克汉种质和5个1981°IRRDB种质胶乳中的表达情况。结果显示：这6个基因在魏克汉种质中的表达水平显著高于1981°IRRDB种质,分别是后者的1.05~14.62、0.97~4.26、1.46~12.56、0.83~2.99、0.43~7.54、1.92~11.31倍,平均值是后者的7.54、2.55、5.69、1.71、2.71、4.91倍。相关性分析表明,这些基因的表达与橡胶树干胶产量呈正相关,其中,HbREF和HbGAPDH的表达水平与干胶产量之间的相关性最高,有望作为橡胶树产量育种的分子指标。     

橡胶树树皮中ACC氧化酶基因（HbACO7）的表达特性及功能探究

天然橡胶是重要的工业原材料,主要来自橡胶树树皮中的乳管。乙烯能促进橡胶树乳管产胶和排胶,在树皮上施用乙烯利（一种乙烯释放剂）或乙烯可显著提高胶乳产量。基于本课题组前期获得的橡胶树基因组和转录组数据,克隆橡胶树中乙烯合成通路关键酶——1-氨基环丙烷基-1-羧酸（ACC）氧化酶基因家族（HbACOs）的全部8个家族基因,研究其组织表达模式。结果表明：在分析的7种组织中,尽管HbACO基因存在不同程度的冗余表达,但每种基因的组织表达模式具有明显的特异性,其中HbACO7是树皮中表达量最高的家族基因。HbACO7基因的表达在割胶季节的不同月份发生明显变化,其中在8月的表达量最高。成功构建了HbACO7基因的原核表达载体,实现其在大肠杆菌BL21中的诱导表达。纯化后的HbACO7重组蛋白具有明显的ACO酶催化活性,成功地催化了乙烯的体外合成。该结果将为后续橡胶树树皮中的乙烯生物合成调控机制研究提供参考。     

茶树咖啡碱生物合成相关酶基因表达研究

用半定量PCR法,分别研究了4个月幼龄茶树嫩叶、成熟叶片、茎、根以及愈伤组织中咖啡碱合成酶（TCSl）、次黄嘌呤苷-5,-单酸磷酸脱氢酶（TIDH）、s-腺苷甲硫氨合成酶（sAMS）等咖啡碱生物合成相关酶基因的差异表达。研究表明,茶树嫩叶中TCS1基因表达量高于其他部位,TIDH基因叶内表达量多于茎和根中,但sAMS表达量在茶树各个部位差异不大;在茶树愈伤组织中,幼嫩组织TCS1基因表达量也远高于老化组织。这些结果支持前人酶学与代谢学研究中咖啡碱主要在嫩叶中合成的结论,可以推测嫩叶中咖啡碱的生物合成取决于咖啡碱合成酶的较强表达。     

转基因水稻株系的纹枯病抗性分析

对通过基因枪转化获得的41个转水稻碱性几丁质酶和苜蓿β-1,3-葡聚糖酶基因（RC24和β-1,3-Glu）的高世代纯合株系进行纹枯病抗性接菌鉴定,结果表明不同转基因系间抗性存在极显著差异,聚类分析可分为抗、中抗、中感、感病四种类型,但其中92.1%的株系属中抗或中感类型;选择不同抗感类型的代表性株系,测定其几丁质酶活力,结果显示中抗、中感、感病类型转基因株系表达的几丁质酶活力与其纹枯病抗性表现呈现一致性,而抗病类型表达目标基因编码的酶活力低于中抗类型;接菌诱导后,在不同时间或同一植株的不同部位检测,转基因系的几丁质酶活力因其组成性表达而无明显差异,而未转基因的对照品种在诱导后不同时间其几丁质酶活力表达呈“峰”式曲线分布,同一植株不同空间位置的酶活力却无明显差异。     

橡胶树热研7-33-97不同杂交组合子代早期鉴定研究

橡胶树(Hevea brasiliensis）优良品种热研7-33-97具有生长速度快、抗性强、产胶潜力大和干胶理化性能好等优点。为研究热研7-33-97作为杂交亲本选育优良新品种的潜力，分别对热研2-73×热研7-33-97、热研5-11×热研7-33-97、热研7-33-97×海垦1的人工杂交授粉子代进行生长量和产量早期鉴定。结果表明：不同杂交组合子代的茎围生长和产量均有显著差异，热研7-33-97作为父本或者母本均能较好地遗传其速生、高产性状。子代性状的正态分析表明，从热研2-73×热研7-33-97杂交组合子代中选育出胶木兼优品种的可能性较大，从热研5-11×热研7-33-97杂交组合子代中选育出高产品种的可能性较大，从热研7-33-97×海垦1杂交组合子代中有选育出抗风高产品种的可能性。     

橡胶树无性系产胶能力株间一致性分析

橡胶树无性系株间产量存在明显差异是导致产量育种选择周期长的主要原因之一。橡胶树的产量主要取决于产胶能力和排胶能力2个因素。树干树皮中的次生乳管数量及乳管细胞内的天然橡胶生物合成效率与产胶能力直接相关。从次生乳管分化和橡胶合成关键因子基因表达2个层面对无性系株间产胶能力的一致性进行分析。结果表明:树皮最内石细胞群以内次生乳管列数与次生韧皮部厚度的比值具有品系特征;在同一品系中,该比值的株间差异小,表现出良好的一致性。8 a割龄大树该比值的株间一致性较3 a幼树差,而在3 a幼树中,树高40 cm处该比值的株间一致性比树高100 cm处更好。因此,以3 a幼树树高40 cm处的该比值作为产量育种早期筛选标记较合适。胶乳中MYC1、HRT2基因的表达量在割胶后上调,并且具有品系特征,但这2个基因的表达量在株间的一致性较差,故在产量育种早期筛选中只能起到辅助作用。     

橡胶树 HMGS 编码基因的分离鉴定

羟甲基戊二酸单酰辅酶 A 合成酶（HMGS）将乙酰辅酶 A 转化为羟甲基戊二酸单酰辅酶 A,是甲羟戊酸代谢 途径的限速酶之一。本研究从橡胶树热研 879 和热研 7-33-97 品系的胶乳中分离出 HbHMGS1 和 HbHMGS2 基因。相比 HbHMGS1 基因在胶乳和树皮中的共表达模式,胶乳中高丰度表达的 HbHMGS2 基因可能是乳管细胞中参与天然橡胶合 成的主效基因,而 HbHMGS1 是功能冗余基因。HbHMGS2 基因在橡胶树高产品系热研 879 胶乳中的表达量亦高于测序 品系热研 7-33-97,表明 HbHMGS2 基因的高水平表达可能有助于橡胶的合成。其上游启动子的顺式作用元件差异可能 与该基因在热研 879 和热研 7-33-97 的差异表达有关。HbHMGS2 基因的转录亦受茉莉酸诱导,可能参与了茉莉酸信号 调控天然橡胶的合成过程。HbHMGS2 基因在大肠杆菌中成功表达为后续研究该基因的功能、利用该基因生产活性物质 提供新的基因资源。     

南亚橡胶种质圃部分橡胶品系幼树2007/2008年的寒害调查与分析

对南亚热带作物研究所橡胶繁育圃2007/2008年低温寒害后的不同橡胶树品系的受害情况进行调查。橡胶品系随苗龄的增长其抗寒性逐步提高;湛试系列橡胶品系抗寒性总体较好;用抗寒品系作亲本与高产品系常规杂交有选育出抗寒高产新品系的可选择性。     

巴西橡胶树生长素响应HbJAR1基因克隆与表达分析

JAR1基因是植物生长素响应基因,具有维持植物体内生长素浓度动态平衡和增强植物抗逆性的功能。为了阐明巴西橡胶树中JAR1基因的结构与功能,本研究利用Q-PCR技术在橡胶树CATAS7-33-97叶片中扩增了JAR1基因,其推导氨基酸含有JAR1蛋白特征性的GH3 superfamily结构域,无信号肽,无跨膜区域,定位在细胞质中,命名为HbJAR1。表达分析结果表明:该基因在橡胶树叶片中的表达量受光照强度、机械伤害和白粉菌侵染显著上调,吲哚乙酸(IAA)、茉莉酸(JA)、乙烯利(ET)、脱落酸(ABA)和赤霉素(GA3)对HbJAR1在橡胶树中的表达也起到不同程度的上调作用。表明HbJAR1基因属于植物JAR1家族,与橡胶树对光照、伤害等逆境响应有关。     

茉莉酸刺激的橡胶树胶乳cDNA消减文库的构建及其序列分析

采用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术,构建了外源茉莉酸刺激条件下橡胶树胶乳与未处理橡胶树胶乳差异表达的cDNA消减文库,经蓝白斑筛选共得到121个含有插入片段的阳性克隆。通过菌落PCR的方法分别对阳性克隆的插入片段进行扩增,结果表明,95％左右阳性克隆插入片段的大小在200-600 bp之间。随机选取25个克隆进行测序,并对所得的25条表达序列标签(EST)序列用Blastn(基本局域联配搜寻工具)检索基因文库(genbank),其中10条EST片断可找到碱基序列相似性大于80％以上的同源基因序列,其余15条EST为没有任何功能线索的未知序列。外源茉莉酸刺激条件下橡胶树胶乳cDNA消减文库的构建和在此基础上克隆橡胶树胶乳中JA信号的候选应激基因,将为开展茉莉酸调控橡胶树胶乳代谢和橡胶生物合成的分子机理研究打下基础。     

橡胶树COP9家族基因的克隆及表达分析

COP9信号小体（CSN）是进化上保守的蛋白复合体,在茉莉酸信号途径中起着重要的作用。橡胶树的乳管是一种特化的细胞器,是天然橡胶合成和储存的场所。现有的证据表明橡胶的生物合成可能受到茉莉酸信号途径的调控,但是对于茉莉酸信号途径调控天然橡胶的生物合成还了解的不够。本研究采用RACE技术结合RT-PCR从胶乳中克隆了8个CSN基因的全长cDNA序列,根据与拟南芥的相似性,分别命名为HbCSN1~HbCSN8。荧光定量PCR结果显示,8个CSN基因均能在树皮、不同发育时期的叶片、胶乳、雄花和雌花中表达,其中HbCSN5在胶乳中的表达量最高,其他成员在叶片中的表达量最高。而且,部分HbCSNs基因在胶乳中的表达受到割胶和茉莉酸甲酯处理的上调表达。因此,推测这些上调表达的成员可能参与胶乳的茉莉酸信号途径。