茶树炭疽病菌拮抗链霉菌的筛选及其抑菌特性研究

茶炭疽病菌刺盘孢菌（Colletotrichum camelliae）是引起茶树炭疽病的重要致病菌,为获得对C.camelliae具有拮抗作用的链霉菌,采用稀释涂布法和平板对峙法从茶园生境中分离筛选出对其具有明显拮抗作用的链霉菌菌株,并结合形态学观察、生理生化特征和16 SrRNA基因序列分析对其进行种属鉴定;开展基于链霉菌菌株的抗菌谱测定、茶炭疽病菌菌丝生长抑制试验和孢子萌发抑制试验;通过菌丝生长速率法测定其无菌发酵滤液对茶炭疽病菌的抑菌活性及其抑菌活性稳定性,并测定其产胞外降解酶能力、抗菌物质合成基因、挥发性与非挥发性代谢物抑菌活性。结果表明,筛选获得一株对茶炭疽病菌C.camelliae具有良好抑菌效果的菌株XS-4,对茶炭疽病菌的平板抑制效果为76.42%;结合形态学观察、生理生化特征,以及16 SrRNA基因序列分析,将菌株XS-4鉴定为多产色链霉菌（Streptomyces polychromogenes）;菌株XS-4对其他8种植物病原菌均具有较好的抑菌效果,抗菌性能具有广谱性。扫描电镜结果表明,菌株XS-4能抑制茶炭疽病菌菌丝生长。孢子萌发抑制试验发现,拮抗菌XS-4发...     

一株木薯拮抗内生细菌CEB33的鉴定及田间防效初步测定

以木薯细菌性萎蔫病病菌为靶标,从健康木薯组织中分离获得一株有较好抑菌作用的内生细菌。生理生化测定、形态观察及16S rDNA序列分析表明其为类芽孢杆菌属。拮抗试验表明该菌株对木薯细菌性萎蔫病菌、疫霉根腐病菌、棒孢霉叶斑病菌和胶孢炭疽病菌均有较强的抑制作用。田间防控试验表明该菌株对木薯细菌性萎蔫病有较好的防治效果,具有良好的开发前景。     

椰子林土壤放线菌的分离及其拮抗椰子泻血病菌的鉴定

从椰子林不同类型土样中分离到101株放线菌,采用PDA培养基和高氏一号培养基及甲壳素脱乙酰酶培养基进行筛选。结果表明,以椰子泻血病菌为指示菌,用对峙培养法选出抑菌带宽度达18 mm以上的菌株14株,菌株FSD-14拮抗效果最明显,其次是FSD-27。这两种菌株对椰子芽腐病菌、椰子果腐病菌等供试真菌均有良好抑菌效果,对各供试病原真菌的抑菌带宽度达18 mm以上,F1S1、F26S1、S40-2、F20M4能产生甲壳素脱乙酰酶。通过对FSD-14的培养特征、生理生化指标及16S rDNA序列分析,确定该菌株属于浅灰链霉菌（Streptomyces griseolus）中的一员。     

硫藤黄链霉菌St-79对水稻白叶枯病的防效和促生作用

【目的】水稻白叶枯病是水稻的主要细菌性病害之一，严重影响水稻生产。本研究获得一株有效防治水稻白叶枯病的放线菌菌株，探索其对白叶枯病的防效和促进水稻生长的作用，为生防菌的开发利用提供科学依据。【方法】利用梯度稀释涂布法、共培养法和牛津杯法筛选拮抗水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)的放线菌菌株；通过形态特征、生理生化反应、16S rDNA序列和系统发育树分析对其进行分类鉴定；利用共培养法分析目标菌株的抗菌谱；通过96孔板微量稀释法、扫描电子显微镜、微生物粘附碳氢化合物法等探究目标菌株的抑菌作用；通过发酵滤液浸种与菌液喷洒土壤的方法探究其对水稻生长的促进作用；利用盆栽试验探索目标菌株发酵滤液对水稻白叶枯病的防治效果。【结果】从不同生境土壤中分离出140株放线菌菌株，最终筛选得到一株对Xoo具有强拮抗活性的放线菌菌株St-79，其发酵滤液抑菌圈直径为64 mm，并鉴定其为硫藤黄链霉菌(Streptomyces thioluteus)。菌株St-79对水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola)、大豆细菌性斑疹病菌(Xanthomonas axonopodis pv. glycines)、油菜黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv. campestris)和番茄细菌性叶斑病菌(Pseudomonas syringae pv. tomato)均有拮抗作用。其乙酸乙酯粗提物具有良好的抑制Xoo生长的效果，粗提物对Xoo的最低抑菌浓度为8 μg/mL，最低杀灭浓度为32 μg/mL；扫描电镜观察结果显示，粗提物对Xoo细胞有很强的损伤作用；粗提物还能改变Xoo细胞内膜通透性，降低Xoo细胞的疏水性。促生试验结果显示，菌株St-79发酵滤液能够促进水稻幼苗的生长。盆栽试验结果显示，菌株St-79发酵滤液对水稻白叶枯病有良好的防治效果，在日本晴、甬优15、甬优1540上的相对防效为65.95%~87.23%，病斑抑制率为69.85%~95.8%，且预防效果优于治疗效果。【结论】获得一株有效防治水稻白叶枯病的放线菌，其对水稻白叶枯病菌有明显的抑制作用，并且可以促进水稻种子的萌发与幼苗的生长。     

茶炭疽病拮抗放线菌的分离筛选与鉴定

为获得对茶炭疽病有生防效果的拮抗放线菌,采用平板对峙法,从湖南茶园土壤分离筛选到1株对茶炭疽病菌具有显著拮抗效果的放线菌株F2,其中菌株对指示菌拮抗效果显著。经形态观察,培养性状,16S r DNA PCR扩增,初步鉴定F2菌株为链霉菌属。该研究结果为茶炭疽病的生物防治提供科学依据。     

一株拮抗椰子茎泻血病菌的链霉菌鉴定

从文昌椰子园土壤分离筛选到一株对椰子泻血病菌奇异长喙壳菌（Ceratocystis paradoxa）有良好抑制效果的放线菌FXJ-258，对该菌株进行了形态特征、培养特征、生理生化特征以及16S rDNA序列分析。结果表明：该菌孢子方形至长圆形，表面光滑，在高氏培养基上，气丝初期白色，随着时间渐变为浅灰色，基丝无鉴别色素，无可溶性色素；能利用L-阿拉伯糖，D-半乳糖， D-葡萄糖，D-甘露糖，D-木糖，D-核糖，L-鼠李糖等碳源，不能利用D-果糖，肌醇，蔗糖，水杨苷等。以16S rDNA序列为基础构建了菌株FXJ-258的系统发育树，其与模式链霉菌株的16S rDNA序列的同源性为99.64%，初步将该菌株鉴定为Streptomyces murinus。     

放线菌WZ1-5019的鉴定及其发酵液对香蕉黑星病的田间防治效果试验

放线菌WZ1-5019菌株是从海南五指山原始森林土壤中分离筛选得到的一株对香蕉黑星病菌具有强烈抑制作用的生防菌,其发酵液无菌滤液亦对香蕉黑星病菌具有较强抑菌活性。根据形态观察、培养特征、生理生化鉴定及16S rDNA序列分析,初步鉴定为链霉菌属中的Streptomyces costaricanus。香蕉黑星病是香蕉的重要病害之一,至今尚无生物农药用于香蕉黑星病的防治,本试验采用链霉菌WZ1-5019菌株发酵液进行香蕉黑星病田间防治试验,结果表明,施用链霉菌WZ1-5019菌株发酵液3次后,对香蕉黑星病的平均防治效果达81.68%,显著优于30%爱苗乳油1 500倍液防效(59.96%)和10%世高水分散粒剂1 500倍液防效(53.58%),具有开发成香蕉黑星病生物农药的前景。     

芒果炭疽病拮抗菌的筛选及防治效果研究

针对芒果炭疽病菌进行了拮抗菌的分离和筛选,并且采用有效菌株的发酵液进行了平板培养基抑菌试验以及采后芒果果实炭疽病防病试验。结果从24个菌株中筛选得到1株有效抑制炭疽病菌的芽孢杆菌M35,其抑菌圈大于13 mm,而且其发酵液对炭疽病菌也有明显的抑制作用;果实防病试验结果也显示,该菌株对于芒果采后炭疽病有显著的防治效果,且随着该拮抗菌菌悬液浓度的增加,防病效果提高,在浓度为l×l08 CFU/mL时,发病率为45%,病斑直径为14.1 mm。     

一株花生白绢病菌拮抗细菌的筛选、鉴定及发酵液中活性物质稳定性研究

为筛选对花生白绢病菌(Sclerotium rolfsii Sacc.)具有高效拮抗活性的细菌菌株,采用平板对峙法和菌丝生长速率法对4株细菌进行抑菌活性的测定,并对筛选的高效拮抗菌株进行鉴定和活性物质稳定性研究。结果表明,菌株WS3-1对花生白绢病菌的抑制作用最强,其发酵滤液对病菌的抑菌率达95.04%。通过细菌形态特征、生理生化特征及16S rDNA和gyrB序列分析,将菌株WS3-1鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。菌株WS3-1发酵液中活性物质在温度为40℃、60℃、80℃以及pH为8～10的条件下,抑菌活性稳定,抑菌率均在80%以上,同时活性物质具有较好的抗紫外线分解能力。以上结果说明解淀粉芽孢杆菌WS3-1是一株具有开发和应用潜力的花生白绢病生防菌株。     

玉米茎腐病拮抗放线菌的筛选及抑菌促生活性鉴定

以禾谷镰孢菌为靶标,采用稀释培养法和平板对峙法从采集的玉米连作土壤中分离筛选出具有拮抗活性的放线菌菌株,选取1株拮抗效果最佳的菌株进行形态学、生理生化特征和系统发育分析,并对其进行抑菌活性试验,挖掘对玉米茎腐病致病菌-禾谷镰孢（Fusarium graminearum）有较高拮抗效果的根际促生菌资源。结果表明,玉米连作土壤中分离得到5株禾谷镰孢菌拮抗菌株,其中菌株G1为高效拮抗菌株。经形态学、生理生化结合16S rDNA将菌株鉴定为公牛链霉菌（Streptomyces tauricus）。拮抗菌株G1发酵液对禾谷镰孢的菌丝生长和孢子萌发均有明显的抑制作用,具有分泌吲哚乙酸和异羟肟酸型铁载体的能力。公牛链霉菌G1在由禾谷镰孢病菌引起的玉米茎腐病防治中具有良好的应用开发潜力。     

13种苯丙烷代谢物对6种炭疽菌的抑菌活性研究

炭疽病是广泛影响热带、亚热带植物的真菌性病害。开发绿色农药是有效防治炭疽病的重要手段。热带牧草柱花草的转录组和代谢组研究表明,苯丙烷代谢通路在响应炭疽菌侵染过程中显著上调。为评价苯丙烷代谢物的抑菌活性,本研究采用体外抑菌试验,测定了13种苯丙烷代谢物对柱花草胶孢炭疽菌、橡胶胶孢炭疽菌、大薯胶孢炭疽菌、芒果胶孢炭疽菌、番木瓜胶孢炭疽菌和橡胶尖孢炭疽菌等6种炭疽菌的菌丝生长抑制作用;进一步测定了活性较好的代谢物及其两两组合对6种炭疽菌菌丝生长和5种炭疽菌孢子萌发的抑制作用。结果表明,13种代谢物对6种炭疽菌的抑制效果不同,在500 μmol/L和1000 μmol/L的浓度下,紫檀芪对6种炭疽菌菌丝生长的抑制效果最好,高浓度时平均抑制率可达47.47%~80.74%;在1000 μmol/L的浓度下,根皮素和香豆素对6种炭疽菌菌丝生长也有一定的抑制效果,而其他9种代谢物对6种炭疽菌抑制作用较弱或者无明显抑制作用。代谢物两两组合时,含紫檀芪的代谢物组合对6种炭疽菌菌丝生长有显著的抑制作用,平均抑制率为31.07%~89.05%;紫檀芪及含紫檀芪的代谢物组合对5种炭疽菌孢子萌发有显著的抑制作用,对柱花草胶孢炭疽菌、橡胶胶孢炭疽菌、橡胶尖孢炭疽菌、芒果胶孢炭疽菌和番木瓜胶孢炭疽菌毒力最强的代谢物或组合分别为紫檀芪+根皮素、紫檀芪+阿魏酸、紫檀芪+阿魏酸、紫檀芪+根皮素、紫檀芪,IC₅₀值分别为293.475、67.660、184.764、108.671、68.417 μmol/L。本文所发掘的代谢物及其组合可为进一步研究防治炭疽病的绿色农药提供理论基础。     

芒果胶孢炭疽病菌对土槿皮乙酸抗性突变菌株的诱导及其生物适合度分析

土槿皮乙酸（pseudolaric acid B, PAB）是一个结构独特的天然二萜酸,前期发现该化合物对芒果胶孢炭疽菌等多种植物病原真菌具有广谱的抑菌活性,但其杀菌作用机制未知。本研究以芒果胶孢炭疽菌菌株JB-Q为供试对象,采用药剂驯化、紫外照射和钴辐射等方法诱导产生抗PAB的突变体,并分析抗性菌株的生物适合度。结果表明,仅药剂驯化法得到了18株不同抗性水平且可稳定遗传的抗PAB的胶孢炭疽菌,抗性频率为1.69×10^-7。适合度研究表明,所有供试菌株在15~35℃范围内均能生长,且在25℃时菌丝生长速率达到最大值;而不同抗性水平的突变菌株的生长速率存在一定差异,其中低抗菌株>亲本菌株>中抗菌株>高抗菌株;渗透压测试结果表明,亲本菌株对0.02% 十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate, SDS）表现更为敏感,其抑制率高达70%;在金属离子（NaCl、KCl和CaCl₂）胁迫下,抗性突变菌株则表现更为敏感。因此,研究认为PAB不易导致胶孢炭疽菌的抗性产生,但诱导产生的抗性突变菌株的生存竞争力与敏感菌株相当。此外,交互抗性结果显示,土槿皮乙酸与吡唑醚菌酯、咪鲜胺和戊唑醇之间不存在交互抗性,但与苯并咪唑类杀菌剂多菌灵存在正交互抗性,其皮尔逊相关系数为0.7729（P<0.01）,这表明PAB可能与微管抑制剂多菌灵有相似的作用机制,但仍需开展进一步的研究验证。     

橡胶树多主棒孢拮抗细菌BACYitc8-7的分离鉴定及其挥发性抑菌物质组分分析

多主棒孢菌（Corynespora cassiicola）是为害橡胶叶片的一种重要病原真菌,目前生产上普遍使用化学农药防治该病害,给植胶区的生态环境带来很多负面影响,从橡胶树根际土壤中筛选对橡胶树多主棒孢菌具有高拮抗活性的细菌,可为橡胶树棒孢霉落叶病生防药剂的研发提供理论依据。本研究通过稀释涂布、平板对峙法从发病橡胶树根际土壤中分离筛选到1株对橡胶树多主棒孢菌具有高拮抗活性的细菌,抑菌带为(57.68±0.66)mm,且该菌株对9种重要的植物病原真菌均具有抑制作用;经过形态观察、生理生化检测及16S rRNA基因序列分析,结果发现其与铜绿假单孢菌基本相符,命名为BACYitc8-7;以LB、NA、高氏、金氏B和PDA为营养来源,评定不同营养条件下菌株BACYitc8-7挥发性物质对多主棒孢菌的抑制作用,发现菌株BACYitc8-7在金氏B和LB培养基上的拮抗作用最强,抑菌率达43.47%~48.69%;利用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱法（HS-SPME-GC-MS）收集并检测菌株BACYitc8-7挥发性物质的抑菌组分,获得包括胺类、醇类、烯类、酚类、酯类、吡嗪类等35种物质,其中含量前5的物质为胺、硼烷二甲硫醚络合物、异戊醇、1-十三烯和2-甲基-3-甲硫基呋喃。     

橡胶树胶孢炭疽菌组蛋白乙酰转移酶CgGCN5调控致病力功能研究

胶孢炭疽菌引起的炭疽病害是造成海南省橡胶减产的主要原因之一。研究该病原菌致病力的分子机制能够为新型防控策略的研发提供理论依据。在橡胶树胶孢炭疽菌中,存在1个编码组蛋白乙酰转移酶的基因CgGCN5。在本研究中,通过同源重组原理及原生质体转化法构建了橡胶树胶孢炭疽菌CgGCN5的敲除突变株和互补菌株,并对其生长、产孢及致病力等表型进行了初步分析。结果表明,与野生型菌株相比,CgGCN5敲除突变株的生长速率、产孢能力均显著下降;并且突变株对橡胶树叶片的致病力也显著下降;进一步分析表明,突变株丧失了对玻璃纸的穿透力。与此同时,互补菌株能够恢复突变株的相应表型。以上结果表明,CgGCN5在调控胶孢炭疽菌的生长及致病力中起重要作用。     

胶孢炭疽菌侵染橡胶树叶片染色方法的建立及显微观察

本研究建立了一种橡胶树叶片中胶孢炭疽菌的染色方法,通过显微观察明确胶孢炭疽菌在橡胶树叶片中的侵染结构,为橡胶树炭疽病的预测预报提供理论依据。在脱色剂（0.15%三氯乙酸乙醇溶液∶氯仿=5∶1）处理12 h,1%刚果红染色剂抽滤染色3 h的条件下,能清晰观察到胶孢炭疽菌在橡胶树叶片上的发育进程和侵染结构。结果表明,在28 ℃、100%相对湿度培养条件下,接种橡胶树淡绿期叶片2~6 h为分生孢子萌发高峰期,12 h后分生孢子萌发率大于85%;8~12 h为附着胞形成高峰期,接种12 h约75%的芽管顶端产生附着胞,少数附着胞中央部位开始形成侵染钉;24 h为侵染钉形成高峰期,同时分生孢子萌发形成多个芽管;36 h时附着胞顶端再次萌发产生次级附着胞,从而进一步侵染周围细胞,叶片出现零星病斑;48 h时芽管不断分支异化成菌丝并产生次级分生孢子,叶片出现大量典型的炭疽病病斑;72 h后菌丝在叶片表面纵横扩展,随机分支,逐步形成网状分布。随着菌丝的扩展,叶片组织发生一系列的病理变化,侵染部位组织出现褐色坏死病斑。本研究建立了一种着色效果好,简便易行,经济有效的橡胶树叶片中胶孢炭疽菌的染色方法,进一步明确了胶孢炭疽菌的侵染结构。     

海南白蚁共附生放线菌的分离鉴定及其抗热带作物病原真菌活性研究

白蚁（Isoptera）的筑巢和觅食活动主要在土壤及腐烂的木材上进行,所以白蚁极易受到来自环境病原微生物的侵害。因此,白蚁需要依赖共附生微生物菌群形成防御体系,放线菌是其中一个重要的类群,且放线菌能产生具有抗菌活性的次级代谢产物。但是白蚁共附生放线菌能否对热带作物的病原真菌有抑制活性有待研究。为了挖掘在热带农业绿色健康发展中具有应用潜力的海南特色农用放线菌资源,以海南白蚁共生放线菌为研究对象,利用平板分离法从采集的健康白蚁体内分离纯化放线菌,利用平板对峙法筛选生防菌株;通过分子生物学确定其分类地位;平板对峙法研究拮抗菌株的抗菌稳定性、持效性和广谱性;滤纸片法研究抑菌物质的热稳定性。结果从海南白蚁体内分离得到1株拮抗活性较好的放线菌菌株W7,系统发育树分析结果表明该放线菌与链霉菌属（Streptomyces）亲缘关系接近。菌株W7的抗菌活性持久性强,平板接种30 d后仍对植物病原真菌具有抑菌活性,抗菌稳定性好;菌株W7抑菌谱广,对16株植物病原真菌有不同程度的抑菌活性,其中对芒果胶孢霉（Colletotrichum gloeosporioides Penz.）、香蕉炭疽霉（Colletotrichum musae）、辣椒棒孢霉（Corynespora cassiicola）、豇豆瓜果腐霉[Pythium aphanidermatum (Edson) Fitzp]抑制作用较强,对芦笋拟茎点霉（Phomopsis asparagi）、荔枝疫霉（Peronophythora litchi）抑制作用较弱;菌株W7发酵粗提物有较好的热稳定性,但是抑菌率会随着水浴温度的增高而降低。本文首次对海南白蚁共附生放线菌进行了分离鉴定,并从中筛选得到1株具有抑制多种热带作物病原真菌活性的生防菌株,为高效生防菌剂的研发提供新资源。     

一株茶树根际细菌的鉴定与生防效果研究

炭疽病是茶树的重要病害之一,对茶叶的生长和产量造成严重的危害.目前该病的防治主要依靠化学药剂,开发生物防治产品是推广茶树绿色防控技术主要措施之一.用生理生化特征分析和分子生物学技术鉴定一株茶树根际生防菌JT68,评估其对茶炭疽病菌的抑菌效果以及菌液对菌丝生长和孢子萌发的影响.用对扣法检测该菌株的挥发性有机物对茶炭疽菌的...     

7株木霉菌对火龙果3种病原菌的拮抗作用

本研究利用对峙培养及发酵液、挥发性物质的抑菌活性测定,分析了7株木霉菌对火龙果溃疡病菌、煤烟病菌和白绢病菌的拮抗作用,并测定木霉菌几丁质酶活性。结果表明：通过对峙培养发现7株木霉菌对火龙果3种病原菌均有一定的抑制作用,其中木霉菌HL135、FJ069和2325-2分别对火龙果溃疡病菌、煤烟病菌和白绢病菌抑制率最大,其抑制率分别为(67.60±0.85)%、(84.85±5.25)%和(80.63±1.20)%。7株木霉菌的发酵液和挥发性物质对3种病原菌也有不同程度的抑制作用。通过对木霉菌几丁质酶活性测定,发现木霉菌SC012具有较高的几丁质酶活性。这些结果将为开发木霉菌复合制剂防治火龙果病害提供理论基础。