鸡白细胞介素15真核表达质粒构建及其体外表达

应用反转录一聚合酶链式反应(RT-PCR)技术AkConA刺激20 h的白菜航鸡脾脏T淋巴细胞中扩增出鸡白细胞介素15(ChIL-15)全基因片段.将其连接到克隆载体pMD18-T中得到重组克隆质粒pMD18-T-ChIL-15.阳性克隆质粒经鉴定正确后将ChIL-15亚克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,得到重组阳性表达质粒pcDNA3.1(+)-ChIL-15.阳性表达质粒经鉴定正确后应用磷酸钙法体外转柒293T细胞,通过间接免疫荧光试验(IFA)检测到了ChIL-15蛋白在293T细胞中的表达.     

pCDNA3-PTH真核表达载体构建及其在细胞内表达

以鸡甲状旁腺组织中总RNA为模板,采用RT-PCR法获得甲状旁腺素(PTH)cDNA。将该基因克隆至pCDNA3载体中,构建真核细胞表达载体pCDNA3-PTH,DNA测序证明获得了PTH基因,其序列与GenBank报道序列比较,核苷酸同源性为99.4%,在第159位处存在C→A的有意义突变。将测序正确的PTH基因在多聚乙肽亚胺(PEI)介导下转染COS-1细胞,通过间接免疫荧光试验(IFA)检测到了PTH在COS-1中的表达。PTH基因克隆和表达均获得成功,为进一步探讨该基因在改善蛋壳质量中的应用奠定了基础。     

鸡白细胞介素18成熟蛋白基因真核表达质粒的构建及其在鸡胚成纤维细胞中的表达

通过PCR方法自含鸡白细胞介素18（Chicken interleukin-18，ChlL-18）成熟蛋白（mature ChIL-18，mChIL18）基因的克隆质粒中扩增mChlL-18基因，并将其克隆到真核表达载体pcDNA3．1／V5-His-TOPO中。阳性克隆鉴定后，在脂质体作用下转染鸡胚成纤维细胞（CEF），通过问接免疫荧光试验（IFA）检测到了mChIL-18在CEF中的表达。     

鸡白细胞介素15的研究进展

白细胞介素 1 5(IL -1 5)是 1 994年发现的一种能促进细胞生长和分化的细胞因子 ,主要由天然免疫细胞产生。鸡 IL-1 5是一种新发现的且与 IL-2活性相似的细胞因子 ,它作为疫苗佐剂研究的重要候选细胞因子有巨大潜力。文章主要围绕鸡 IL-1 5的发现、基因及蛋白结构、受体及生物学特性等作了综述。     

猪白细胞介素18全基因的克隆、真核表达质粒的构建及其在猪肾细胞中的表达

通过RT-PCR方法自猪脾脏淋巴细胞中扩增mpIL-18基因.序列测定表明,pIL-18全基因核苷酸长度为579bp,编码192个氨基酸.将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1中,构建重组质粒pcDNA-IL18m,所获重组质粒经过酶切、测序鉴定,证实含有目的片段,且连接、构建正确.阳性克隆鉴定后,在脂质体作用下转染猪肾细胞(PK15),通过提取RNA检测到了mpIL-18在PK15细胞中的表达.     

鸡白细胞介素-15基因克隆、序列分析及表达

根据GenBank上发表的鸡IL-15基因序列设计两对引物,以从鸡脾脏中提取的基因组RNA为模板,采用RT-PCR扩增出鸡白细胞介素-15基因并进行了序列分析。序列分析结果表明,鸡白细胞介素-15基因序列全长580bp,开放阅读框架内564个核苷酸共编码188个氨基酸。所扩增的序列与已报道的序列同源性为99.9%(563/564)。将扩增序列插入大肠杆菌载体pBV220中进行表达,SDS-PAGE显示目的蛋白约为21ku,表达产物经免疫荧光鉴定为阳性。     

鸡降钙素基因克隆及其真核表达质粒的构建

采集200日龄新扬州产蛋鸡腮后腺组织,直接提取总RNA,进行反转录-聚合酶链反应(RT-PCR),扩增产物进行克隆、测序,获得新扬州鸡降钙素(CT)基因序列。测序表明,CT基因核苷酸长度为417bp,编码139个氨基酸。与GenBank上发表序列相比较,核苷酸同源性为99.8%,在第135位处存在G→C的有义突变。与从GenBank下载读取的红点鲑、大马哈鱼、河豚、斑马鱼、人、家鼠、绵羊、犬8个物种序列进行比较分析,核苷酸同源性分别为74.0%、63.3%、59.5%、55.6%、52.8%、50.6%、48%及42.2%。将该基因片段克隆到真核表达载体pCEP4,构建重组质粒pCEP4-CT,所获重组质粒经过酶切、测序鉴定,证实含有目的片段且连接、构建正确,为利用pCEP4-CT调控机体骨钙代谢、防治蛋鸡骨质疏松症的研究和应用奠定了基础。     

传染性支气管炎病毒S1基因真核表达质粒的构建及其在CEF中的转染

传染性支气管炎病毒(IBV)为冠状病毒的代表种，其S蛋白是IBV在免疫学上最重要的蛋白，与该病毒的致病性和抗原性有密切关系。该蛋白合成后在病毒成熟过程中被水解为S1、S2两个片段。S1片段由520～538个氨基酸残基构成，能诱发产生病毒中和抗体和血凝抑制抗体，并且还是免疫保护的主要诱导物。本研究通过将IBV S1基因插入真核表达载体pcDNA3．1／V5-His—TOPO，阳性克隆鉴定后，在脂质体作用下转染CEF细胞，用间接免疫荧光试验检测证明S1蛋白可大量表达，为下一步进行生物学活性研究及核酸疫苗的研制奠定基础。     

人白细胞介素-15的高效表达

采用限制性核酸内切酶酶切鉴定含IL-15基因的重组质粒,SDS-PAGE检测不同条件下IL-15基因的表达情况,并对表达条件进行优化。经酶切鉴定和核苷酸序列测定证实重组质粒pET28c（＋）-IL-15含有IL-15基因且阅读框架正确,以IPTG诱导IL-15基因表达的优化条件是：培养基pH7．0,培养温度37℃,IPTG浓度1．0mmol／L,茵体生长密度0D600达到1．0时加入IPTG,诱导时间3h,IL-15蛋白表达量为28％,为IL-15的生产工艺研究提供了可靠的试验数据。     

粤黄鸡IL-15基因真核表达及其多克隆抗体的制备

本研究参照GenBank登录的鸡白细胞介素15(ChIL-15)基因序列自行设计一对特异性引物,以RT-PCR、基因克隆,重组真核表达质粒构建、表达及试验兔免疫等技术,成功获得粤黄鸡IL-15基因:全长564 bp,编码187个氨基酸,与GenBank上已发表的其它品种鸡IL-15基因序列及其推导的氨基酸序列相似性为99.1％～100％;成功构建鸡IL-15基因重组真核表达质粒pcDNA-ChIL-15；成功制备兔抗鸡IL-15多克隆抗体.为进一步研究粤黄鸡IL-15的生物学功能,试验pcDNA-ChIL-15作鸡的各种新型DNA疫苗的分子免疫佐剂等奠定基础.     

鸡CaBP-D28k基因克隆、序列测定及其真核表达质粒的构建

采集200日龄产蛋新扬州鸡小肠组织直接提取总RNA进行反转录聚合酶链式反应（RT—PCR）扩增,扩增产物进行克隆、测序,获得了新扬州鸡CaBP—D28k基因序列。序列测定表明,CaBP—D28k基因核苷酸长度为789bp,编码262个氨基酸。与GenBank上发表序列（NM_205513．1）比较,核苷酸同源性为99．9%,在760bp处存在G→T的错义突变。与从GenBank下载的马、人、小家鼠、蟾蜍序列进行比较分析,核苷酸同源性分别为79．3％、79．1％、77．4％、77．3％。将该基因片段克隆到真核表达载体pCEP4,构建重组质粒pCEP4-CaBP—D28k,所获重组质粒经过酶切、测序鉴定,证实含有目的片段,且连接、构建正确,为利用pCEP4-CaBP—D28k调控蛋禽钙代谢、改善蛋壳质量的研究应用奠定了基础。     

鸡RORα真核表达载体的构建及其在MSB1细胞中的表达

为构建鸡维甲酸相关孤核受体α（retinoid acid receptor related orphan receptor α,RORα）的真核表达载体,并检测其在MSB1细胞中的表达效果,本研究参照GenBank中鸡RORα基因序列（登录号：NM_001289887.1）设计特异性引物,从鸡肝脏组织中提取总RNA,经反转录合成cDNA,以此为模板进行PCR扩增,将扩增的特异性RORα基因片段连接pMD18-T载体,构建克隆载体pMD18-T-RORα,再用Sal Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切克隆载体pMD18-T-RORα和真核表达载体pEGFP-N1,将酶切回收的RORα与pEGFP-N1片段进行连接,构建重组真核表达载体pEGFP-N1-RORα,经PCR、酶切和测序验证准确性后,将其转染MSB1细胞,于转染后48 h荧光显微镜下观察EGFP的表达情况,并采用实时荧光定量PCR检测鸡RORα在MSB1细胞中的表达水平。结果显示,从构建的重组质粒pEGFP-N1-RORα中可扩增出大小约1 600 bp的特异性片段,用Sal Ⅰ和BamH Ⅰ可切出大小约4 700和1 600 bp的两条带。实时荧光定量PCR结果显示,转染MSB1细胞48 h后,与对照组相比,重组真核表达载体转染组中鸡RORα基因mRNA水平显著增加（P<0.05）。表明本试验成功构建了鸡RORα的真核表达载体,该载体可在MSB1细胞中表达鸡RORα,为进一步研究鸡RORα对MSB1细胞增殖的影响奠定基础。     

重组绵羊pEGFP-PRNP质粒构建及真核细胞转染

构建了携带绵羊朊蛋白基因（PRNP）的重组真核转染质粒,通过脂质体转染试剂将其转染至神经胶质瘤细胞（C6）,以期为进一步研究绵羊朊蛋白的生理功能和从细胞水平研究朊蛋白疾病的发病机制奠定基础。采用PCR扩增目的基因序列,纯化后将其克隆到带有增强型绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因的真核表达载体pEGFP-N1中,对重组质粒pEGFP-PRNP做酶切鉴定。而后采用阳离子脂质体转染法将重组质粒转染到C6细胞,荧光显微镜观察。经鉴定,绵羊PRNP基因已克隆到真核表达载体pEGFP-N1中,成功地构建了重组pEGFP-PRNP质粒,并可稳定地在C6细胞中表达。本研究为外源朊蛋白在细胞中表达提供了平台,为进一步在细胞水平研究朊病毒疾病奠定了基础。     

猪带绦虫dUTPase基因真核载体的构建及其在BHK细胞中的表达

采用PCR技术从重组克隆载体pGEM-dUTPase中扩增出猪带绦虫六钩蚴dUTPase基因,与表达载体pGFP-C1相连接,构建重组表达质粒pGFP-C1-dUTPase,转化大肠埃希菌DH5α,经测序证实,基因序列完全正确.用脂质体法转染BHK细胞,采用荧光显微镜实时观察和RT-PCR技术确定目的蛋白的表达情况.结果表明,在转染重组质粒48 h后能观察到绿色荧光,表明在BHK细胞中成功地表达了猪带绦虫dUTPase与pGFP-C1的融合蛋白,为下一步重组dUTPase酶活性的研究奠定了基础.     

重组人白细胞介素6表达载体的构建及其在大肠杆菌中的高效表达

本研究合成了两个成熟人IL-6cDNA引物.采用PCR法扩增出了成熟人IL-6基因片段,并在其5’端加入了一个Eeo RI部位和ATG,3’端加入了一个Bam HI部位和TAA.利用pBV220质粒构建成功了pBV220 IL-6表达载体.将该重组质粒导入E.coli DH5α中,经30℃扩增和42℃诱导,表达出了分子量为21000的预期蛋白.经SDS-PAGE分析与薄层扫描测定,重组IL-6的含量约占全菌体总蛋白的27％以上.菌体裂解液用7TD_1细胞测定,证明具有明显的IL-6活性.实验还对工程菌的IL-6表达动态和包涵体提取进行了研究,从而为工程菌发酵与IL-6纯化提供了工作基础.     

猪白细胞介素18基因的克隆及真核表达重组质粒的构建

为获得表达猪白细胞介素18（interleukin-18,IL-18）的真核表达重组质粒,试验通过RT-PCR从猪脾脏、肺脏和淋巴结组织中扩增猪IL-18全基因并定向克隆到真核表达载体pZJ-1,测序分析和酶切鉴定正确后,转染至293T细胞中,并通过实时荧光定量PCR和Western blotting分别在基因和蛋白水平检测IL-18的表达。结果表明,试验成功构建了真核表达重组质粒pZJ-IL-18,且可以在293T细胞中表达IL-18基因。Western blotting试验证实,猪IL-18多克隆抗体能与约17 ku的表达产物发生特异性反应,表明IL-18能正确表达且具有反应原性。本试验构建了表达猪IL-18基因的真核表达质粒,并在293T细胞中瞬时表达,为进一步研究IL-18的功能奠定基础。