猪附红细胞体实时荧光定量PCR检测方法的建立

参照猪附红细胞体16S rRNA基因序列设计了1对引物，分别以标准株和分离株的基因组DNA为模板，采用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法检测猪附红细胞体，确定特异性产物的Tm值，同时做普通PCR。试验结果表明，特异性产物的Tm值为88．5℃，最低能检测到含0．036fg／μL阳性质粒的标准品。以阳性质粒标准品10倍倍比稀释的模板进行实时荧光定量PCR，通过对反应体系和反应条件进行筛选和优化，建立了检测猪附红细胞体的标准曲线。建立的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法显示了较好的特异性、敏感性和广谱性，为猪附红细胞体病的临床检测和流行情况调查提供了新的技术手段。     

猪博卡病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank公布的猪博卡病毒(PBoV)序列,通过VP1/2基因设计引物和Taq Man探针建立实时荧光定量PCR检测方法。建立的方法与PPV、PRRSV及PCV均无交叉反应,具有较高特异性,在107 copies/mL～101 copies/mL模板范围内具有良好的线性关系,所制作的标准曲线相关系数为0.997,最低可检测到101copies/mL的阳性质粒。说明所建立的PBoV实时荧光定量PCR检测方法具有灵敏度高、特异性好和精确性高等优点。     

弓形虫Real-time PCR检测方法的建立和初步应用

根据已发表的弓形虫529 bp高拷贝序列,设计特异性引物和探针,建立TaqMan探针法的实时荧光定量PCR检测方法。将该方法用于360份临床样本的检测,并与常规PCR和环介导等温扩增(LAMP)技术进行对比分析。结果表明:Real-time PCR检测的阳性率(11.11%)高于LAMP(7.5%)和常规PCR(3.61%)。采用本实验室建立的Real-time PCR,对收集于不同地区4种动物的750份临床样本检测发现,不同种类动物血液样本中均可检测到弓形虫感染,其中羊的感染率最高(17.8%),猪次之(4.22%),牛较低(1.98%),犬最低(1.37%)。     

PCR检测猪弓形虫病方法的建立

为了探索以p30基因的部分序列作为模板进行猪弓形虫病PCR检测的最佳条件,根据弓形虫p30基因序列设计引物进行PCR扩增,结果出现预期的扩增片段484bp,该PCR方法最低能检测到5个弓形虫速殖子的DNA,且与相关的2种寄生虫无交叉反应,具有高度的敏感性和特异性。     

弓形虫荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

根据Gen Bank中龚地弓形虫529 bp重复序列设计引物,以弓形虫RH株基因组DNA为模板,常规PCR扩增出长度212 bp的特异性保守序列,将其克隆到p GEM-T Easy载体中构建重组质粒标准品;以10倍倍比稀释的质粒标准品为模板,进行SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立弓形虫荧光定量PCR检测方法。将该方法用于临床病死猪的弓形虫检测。结果表明:用重组质粒制作的标准曲线循环阈值与模板浓度有良好的线性关系,溶解曲线特异相关系数0.997,平均试验间变异系数2.30%,能检出约0.05个速殖子;检测弓形虫YZ-1株与YZ-2株均为阳性,而检测水牛梭形肉孢子虫、犬等孢球虫、柔嫩艾美耳球虫基因组DNA均为阴性;检测24头病死猪,弓形虫阳性率为70.8%,略高于常规PCR方法的检出率(66.7%),但检测的69个组织样品中,荧光定量PCR方法的检出率(50.7%)明显高于常规PCR方法的检出率(34.8%)。     

猪德尔塔冠状病毒荧光定量PCR检测方法的建立与应用

猪德尔塔冠状病毒(porcine delta coronavirus,PDCoV)是2012年中国香港首次发现的冠状病毒,能引起感染仔猪水样腹泻,最终脱水死亡。研究根据PDCoV保守的衣壳蛋白基因(N)序列设计特异性引物,建立荧光定量PCR检测方法。结果表明,该方法在6.31×10~6～6.31×10~1copies/μL,Ct与模板浓度之间具有良好的线性关系,斜率为-4.90,相关系数为0.999。所有标准品模板出现唯一熔解峰,敏感性下限为6.31×10~(1 )copies/μL,PEDV和TGEV等均没有检测信号。对60份临床样品检测,PDCoV阳性率为5.0%,表明本研究建立的方法可以快速灵敏地检测PDCoV,从而为PDCoV的预防和疫苗研制奠定基础。     

猪戊型肝炎病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

根据GenBank中注册的AJ272108等序列,参考有关文献,利用引物设计相关软件在HEV ORF2片段的保守区设计并合成1对引物及探针,采用TaqMan探针建立了荧光定量PCR法。以鉴定正确的质粒为模板建立标准曲线,Ct值线性范围为14.89~27.02,相关系数为0.996。本试验建立的猪戊型肝炎病毒ORF2片段基因实时荧光定量PCR方法扩增效率高、线性范围广,为快速检测猪戊型肝炎病毒的绝对定量分析奠定了基础。     

猪弓形虫病特异PCR诊断方法的建立

以核糖体DNA第一内转录间隔区(ITS1)序列作为弓形虫种特异的遗传标记．建立了猪弓形虫病特异PCR诊断方法。应用人工感染的方法建立了猪弓形虫病动物模型．摸索出猪弓形虫病PCR检测的最佳条件。敏感性和特异性试验结果显示，该PCR方法最低能检测到10个弓形虫速殖子的DNA，且与相关的8种原虫和线虫均无交叉反应，证明该PCR方法具有高度的敏感性和特异性。动物感染试验结果证明．在试验猪出现明显临床症状时(感染后第5d)．对取材的8个组织样品用该PCR方法检测，有6个组织样品为阳性，其中检出率最高的组织为肺门淋巴结。     

猪A组轮状病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

本试验旨在建立一种检测猪A组轮状病毒的SYBR Green I实时荧光定量PCR方法.参考GenBank上登录的猪轮状病毒OSU株的VP6基因序列保守区设计一对特异性引物,通过RT-PCR方法克隆目的基因,并将其连入pMD 19-T Vector,制备阳性标准品,优化反应条件.建立的方法在1.0×102～1.0×109拷贝/μL范围内线性关系良好,反应扩增效率大于90％,扩增相关系数大于0.98.对猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪传染性胃肠炎病毒及猪圆环病毒2型均检测不到荧光信号,表明该方法特异性强.该方法批内和批间变异系数均小于2％,重复性好.结果表明,建立的SYBR Green I实时荧光定量PCR方法可为A组猪轮状病毒早期感染的诊断及病毒定量分析提供技术支持.     

实时荧光定量PCR检测猪细小病毒

根据已报道的猪细小病毒基因组序列,设计并合成了引物和探针,从猪细小病毒(PPV)感染的细胞中提取DNA,经PCR扩增,产物纯化后与pGEM-T-easy连接,转化大肠杆菌JM109,筛选后得到重组标准品质粒,对重组标准品质粒进行PCR和测序鉴定,表明目的片段已经成功克隆.将104～108拷贝反应的重组标准品质粒进行荧光定量PCR,系统自动分析软件显示Ct值与标准品浓度的对数之间存在良好的线性关系.动力学曲线分析表明,在该反应体系和反应条件下,标准曲线的灵敏度为102拷贝.本方法的建立为猪细小病毒感染的早期诊断奠定了基础.     

猪弓形虫特异性PCR诊断方法的建立及应用

以猪弓形虫核糖体DNA第一内转录间隔区(ITS1)序列为模板自行设计引物,建立了猪弓形虫病特异PCR诊断方法,并从弓形虫国际标准强毒株RH速殖子和疑似T.gondii感染猪全血及肺脏组织样品基因组DNA中扩增出了预期长度273bp的目的DNA片段。敏感性和特异性试验结果显示,该PCR方法能检测到的最低DNA量为0.001ng,且与相关的9种对照寄生虫、细菌和病毒无交叉反应。用建立的PCR诊断方法对临床30份猪弓形虫疑似病料和60份健康猪抗凝全血样品进行检测,结果30份病料中有24份呈现阳性;60份健康猪血中有5份为阳性;随机取两个临床样品的阳性PCR扩增片段进行克隆测序表明,二者序列与Gen-Bank中已登录的猪弓形虫ITS1基因相应部分序列完全相同。以上表明所建立的PCR方法具有高度的敏感性和特异性;本研究为猪弓形虫病的快速诊断提供了一种新方法。     

弓形虫PCR检测试剂盒的组装和初步应用

研制弓形虫PCR检测试剂盒,观察临床应用效果。根据GenBank公布的弓形虫MIC3基因序列,设计合成1对特异性引物,对PCR反应条件进行优化,分别对试剂盒的特异性、敏感性、重复性、稳定性和保存期进行研究,之后进行临床试验。该诊断试剂盒能扩增出弓形虫特异性基因MIC3片段,与猪球虫、贾第虫、猪旋毛虫和隐孢子虫无交叉反应;该检测方法最低能够检测到10个弓形虫速殖子的DNA,不同批次的试剂盒对同一样品检测和同一批次对不同样品检测,有较高的重复性和稳定性,且常温下可保存1年以上,临床应用效果显著。该检测试剂盒对弓形虫病早期诊断、流行病学调查和卫生检疫提供了检测手段。     

犬圆环病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

犬圆环病毒(DogCV)是圆环病毒科新发现的圆环病毒,旨在建立犬圆环病毒实时荧光定量PCR检测方法。试验用PCR方法克隆犬圆环病毒ORF2基因保守区域,构建标准阳性质粒pClon007-ORF2。以标准阳性质粒pClon007-ORF2为模板对荧光定量PCR反应体系进行优化。结果表明,所建立的方法 Ct值与标准品在4.67×10~9 copies/μL~4.67×10~3 copies/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.998,斜率为-3.445。该方法检测灵敏度为4.67×10~1copies/μL。该方法对狂犬病病毒、犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒2型等犬常见病原的检测均无交叉反应;所有稀释度标准品模板均在83.35℃出现窄的特异性熔解峰。临床样品检测表明,所建立的实时荧光定量PCR对犬圆环病毒的阳性检测率为12.50%(4/32)。     

一种弓形虫单管套式PCR检测方法的建立及其在奶山羊应用

根据GenBank上发表的弓形虫RH虫株529bp重复序列,设计内、外2对特异性引物,建立一种弓形虫单管套式PCR检测方法,并进行特异性试验、敏感性试验及奶山羊临床样品的检测试验。结果表明,该方法能够扩增出基因片段大小为216bp,与GenBank收录的相关序列同源,而与山羊泰勒虫、微小隐孢子虫、蓝氏贾第虫基因组无交叉反应,该方法能够检测出DNA的最小量为1fg。使用该方法对137份奶山羊血液样品进行了检测,发现有38份为阳性。本研究所建立的方法具有特异性强、敏感性高的特点,可用于奶山羊弓形虫病的诊断,有较高的临床应用价值。     

猪细小病毒7型Taqman实时荧光PCR检测方法的建立与应用

猪细小病毒7型(Porcine parvovirus 7,PPV-7)是近年新发现的一种细小病毒亚型。为建立PPV-7快速准确的检测方法,以PPV-7病毒全基因组为模板,设计合成1对引物和1条Taqman探针,建立了PPV-7Taqman实时荧光定量PCR检测方法。本方法的标准曲线分析显示,其常数为0.999 2,敏感性可以达到46个病毒拷贝/μL,批内和批间重复性试验的变异系数均小于2%。用猪圆环病毒2型、3型,猪细小病毒1型,猪伪狂犬病病毒等病原进行特异性试验,证实本方法不能从这些病毒中检测出特异性条带,表明本研究建立的PPV-7实时荧光PCR方法具有特异性强、敏感性高、重复性好的特点。用临床样品对该方法进行了应用性评价,从96份样品中检出52份PPV-7阳性样品,证实了本方法在生产实际应用的可行性。     

Development of Real-time PCR Method for Rapid Detection of Vibrio parahaemolyticus

To establish a rapid assay for detection of Vibrio parahaemolyticus(VP), Real-time PCR method was developed targeting to toxR gene of Vibrio parahaemolyticus.The results showed that the test for 15 bacteria strains using the Real-time PCR method, only Vibrio parahaemolyticus test was positive, indicating that the method had high specificity.In addition, the sensitivity of Real-time PCR was 4.9 CFU/mL.Furthermore, a total of 3 positive samples for Vibrio parahaemolyticus were detected from 150 clinical samples by the Real-time method, which was in accordance with the testing result by GB 4789.7-2013 standard detection protocol.Therefore, the Real-time method provided a novel rapid and sensitive detection method with good practicality for Vibrio parahaemolyticus infection.     

马梨形虫病病原双重荧光PCR快速检测方法的建立与应用

在序列比对分析的基础上,设计2对引物和2条MGB探针,经体系优化建立了可快速鉴别检测两种马梨形虫病病原（马泰勒虫和驽巴贝斯虫）的双重荧光PCR检测方法。该方法可分别检出22和31基因拷贝的虫体DNA,且不与其他马病病原发生交叉反应。应用建立的荧光PCR检测方法,对采自进出口马匹的10份马全血和20份马血清进行检测,结果从马全血中检出2份马泰勒虫阳性样品。使用一对马泰勒虫EMA1全基因扩增引物,从2份阳性样品中扩增了EMA1基因。克隆测序后,对该基因全序列进行分析,证实其为马泰勒虫特异基因序列;2份样品的基因序列相似性为98.9%,存在6个氨基酸变异;2个样品中的EMA1基因不完全一致,表明2个感染样品中的虫体可能为不同的马泰勒虫虫株。     

副溶血弧菌实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

为建立检测副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)的快速检测方法,本研究以VP toxR基因为靶基因设计合成引物及TaqMan探针,建立了实时荧光定量PCR快速检测VP的方法。结果显示,对15株试验菌株进行实时荧光定量PCR检测,只有VP检测为阳性,表明该检测方法特异性强;该方法的灵敏度为4.9 CFU/mL,利用该检测方法对采集的150份样品进行检测,共计检出3份VP阳性样品,与国标法(GB 4789.7-2013)检测结果一致,显示了良好的实用性。该检测方法灵敏度高、特异性强,具有良好的实用性。     

猪圆环病毒2型和弓形虫双重PCR检测方法的建立及应用

为建立一种同时检测猪圆环病毒2型（PCV2）和弓形虫（Toxoplasma gondii）的双重PCR方法,根据GenBank上已登录的PCV2和弓形虫基因的保守序列,设计了2对特异性引物,并对反应体系及条件进行了优化。首先对单一PCR检测条件进行摸索,确定其最佳检测条件和灵敏性;进而建立两种病原的双重PCR检测方法,通过对退火温度、灵敏性和特异性进行测试,最终确定该方法的反应体系及条件。结果显示：双重PCR方法对PCV2和弓形虫的最低检出限分别为78.16和29.19 μg/mL;对伪狂犬病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）和猪瘟病毒（CSFV）等均无扩增,特异性良好。利用该方法对来自川渝地区部分猪场的63份临床样本进行检测,并与单一PCR检测结果进行比对,两种方法的符合率为100%。以上结果说明,本试验建立的双重PCR方法灵敏度高、特异性强、结果可靠、方便经济,可用于PCV2和弓形虫的实验室快速检测。