重组杆状病毒表达的2株传染性支气管炎病毒S1蛋白的免疫原性评价

利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统构建了2株重组杆状病毒rAcJS9503S1和rAcSD9701S1，分别表达了2株致病性不同的传染性支气管炎病毒的S1基因。用感染重组杆状病毒的昆虫细胞裂解液对2周龄的伊莎公雏进行免疫，根据鸡免疫后的抗体水平动态变化和攻毒后鸡肾脏和气管的保护力判定它们的免疫原性。结果显示，重组杆状病毒表达的IBVS1蛋白可以诱导抗体产生和免疫保护反应，2毒株间也存在着一定程度的交叉免疫保护反应。     

表达传染性支气管炎病毒S1基因重组鸡痘病毒的构建

将鸡传染性支气管炎病毒S1基因插入到鸡痘病毒转移载体pSY681中，获得重组转移载体pSY681。将pSY681-IBVS1转染已感染亲本鸡痘病毒S-FPV-017株的鸡胚成纤维细胞，使其在鸡胚成纤维细胞内与鸡痘病毒基因组发生同源重组，产生表达鸡IBVS1蛋白的重组鸡痘病毒rFPV-IBVS1。在含有X-gal的营养琼脂培养基上进行蓝斑筛选且进一步纯化14代。S1基因的PCR检测表明，获得的含传染性支气管炎病毒S1基因的重组鸡痘病毒能够稳定遗传，间接免疫荧光和Western blot等试验证实该重组病毒在CEF内真实地表达了分子量约为90Ku的具有免疫学活性的IBV S1糖蛋白。     

表达鸡传染性支气管炎病毒S1基因重组腺病毒的构建

为构建表达鸡传染性支气管炎病毒(IBV)主要免疫原S1蛋白的重组腺病毒,本研究以复制缺陷型人5型腺病毒为载体,以IBVCK/CH/LHLJ/04V株S1基因为外源插入靶基因,通过细菌内同源重组法构建了一株稳定表达IBVS1蛋白(90ku)的重组腺病毒,命名为rAdV-S1。通过PCR鉴定、间接免疫荧光及western blot检测证实S1蛋白在重组腺病毒中获得表达。对构建的重组腺病毒和亲本腺病毒的生长动力学分析表明,该重组病毒的毒价为108.25TCID50/mL,并且两者在生长动力学方面无显著差异。本研究为动物试验和该重组腺病毒免疫特性的研究奠定基础。     

鸡传染性支气管炎病毒S1基因免疫对鸡的保护作用

将鸡传染性支气管炎病毒肾型 Ｔ 株 Ｓ１ 基因ｃ Ｄ Ｎ Ａ 连接于ｐｃ Ｄ Ｎ Ａ３ 的 Ｈｉｎｄ Ｉ Ｉ Ｉ与 Ｂａ ｍ Ｈ Ｉ位点之间构建含有 Ｃ Ｍ Ｖ 启动子及 Ｂ Ｇ Ｈｐｏｌｙ Ａ 信号序列的鸡传染性支气管炎病毒 Ｓ１ 蛋白真核表达质粒。实验证明, Ｓ Ｐ Ｆ 鸡肌注免疫后血清 Ｉｇ Ｇ 抗体逐渐升高,至第３５ 日龄左右达到高峰,攻毒后血清 Ｉｇ Ｇ 抗体先下降而后升高,血清 Ｉｇ Ｇ 抗体升高幅度不及 Ｉ Ｂ 油苗免疫组。质粒 Ｄ Ｎ Ａ 免疫鸡攻毒后有４０ ％ 的鸡可耐过强毒的攻击,说明 Ｓ１ 基因在体内获得了表达并使鸡产生了一定的免疫力。     

鸡传染性支气管炎病毒S1基因在昆虫细胞中的高效表达

将鸡传染性支气管炎病毒（ Ｉ Ｂ Ｖ） Ｓ１ 基因 ｃ Ｄ Ｎ Ａ 克隆至含有起始密码 Ａ Ｔ Ｇ 的转移载体 ｐ Ｓ Ｘ Ｉ Ｖ Ｖ Ｉ＋ Ｘ３／４,构建成重组转移质粒 ｐ Ｓ Ｘ Ｉ Ｖ Ｖ Ｉ＋ Ｘ３／４ Ｓ１． Ｈｏｌｔｅ,再与粉纹夜蛾核型多角体病毒 Ｔｎ Ｎ Ｐ Ｖ Ｓ Ｖ Ｉ－ Ｇ Ｄ Ｎ Ａ（ Ｏ Ｃ Ｃ－ , ｇａｌ＋ ）共转染 草地夜蛾（ Ｓｆ９） 细胞, 经空斑纯化得 到已插入 Ｓ１ 基 因并能形成多角体 的重组病毒 Ｔｎ Ｎ Ｐ Ｖ（ Ｘ３／４） Ｓ１． Ｈｏｌｔｅ Ｏ Ｃ Ｃ＋ 。以重组毒株感染 Ｔｎ５ Ｂ１ 细胞,在不同时间收取感染了病毒的细胞进行 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 与 Ｗ ｅｓｔｅｒｎ 印迹检测。 Ｔｎ Ｎ Ｐ Ｖ（ Ｘ３／４） Ｓ１． Ｈｏｌｔｅ Ｏ Ｃ Ｃ＋ 在感染的细胞中高效表达了 Ｓ１ 基因,表达产物为约 １００ ０００ 的融合蛋白,与预计的表达修饰后的产物大小相符,推测此蛋白已糖基化。 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ凝胶薄层色谱分析结果显示,感染病毒后 ４８、７２、９６ ｈ, Ｓ１ 蛋白分别占细胞内总蛋白量的 ２８７％ 、３５８％ 、３７１％ 。     

传染性支气管炎病毒DS10株S基因分析及其杆状病毒表达产物免疫原性鉴定

对肾型鸡传染性支气管炎病毒分离株Ck/Jiangsu/DS10/2008株(DS10株)S基因进行扩增、克隆和序列测定,并与GenBank中的其他25株参考株构建进化树进行比对分析,研究其遗传进化关系。另将S基因克隆至杆状病毒表达系统pFastBac 1载体并转染Sf9昆虫细胞进行表达,经间接免疫荧光鉴定其表达,用琼扩试验验证表达产物的反应性。S基因序列分析表明,S基因高变区域主要集中在157～230位、349～433位、787～886位之间,裂解位点序列为SHRRRRμSI。遗传进化分析表明,DS10与Vic株处于同一分支,而与H120等常用疫苗株相距较远。经间接免疫荧光检测表明,S蛋白在Sf9细胞中得到表达,琼扩试验验证表达产物具有良好的反应性,表明所表达的S蛋白具有良好的生物学活性。本研究表达的S蛋白可为传染性支气管炎诊断抗原的研制、新型疫苗的开发等提供基础材料。     

表达鸡传染性支气管炎病毒S基因的重组新城疫病毒构建

为构建以新城疫病毒(NDV)为活毒载体表达鸡传染性支气管炎病毒(IBV)S基因的重组病毒,本研究利用RT-PCR技术,以IBV的Massachusetts41株RNA为模板,通过RT-PCR扩增得到IBV S基因(3534bp),将其插入到NDV感染性克隆pBRN-FL中,构建了含有IBV S基因的重组NDV cDNA克隆pBRN-FL-IBVS。利用磷酸钙转染法,在辅助质粒pBS-NP、pBS-P和pBS-L的共同作用下,将pBRN-FL-IBVS转染表达T7聚合酶重组痘病毒感染的BSR细胞,救获重组NDV(rL-IBVS)。采用RT-PCR检测接种重组病毒的鸡胚尿囊液,结果表明rL-IBVS中含有相应外源基因。IFA试验表明,rL-IBVS可与鸡抗IBV的高免血清发生特异性反应,证明S蛋白在感染的BSR细胞中得到表达。其鸡胚平均致死时间、脑内致病指数和静脉内致病指数等指标显示rL-IBVS保持了亲本疫苗株高滴度的鸡胚生长特性和低致病力特性。本研究采用反向遗传操作技术构建了表达IBV S蛋白的重组NDV,为进一步研制IBV和NDV的重组基因工程活载体疫苗奠定了基础。     

鸡传染性支气管炎病毒GX-YL5株S蛋白在昆虫杆状病毒表达系统的表达及其免疫原性

为了对鸡传染性支气管炎病毒(avian infectious bronchitis virus,IBV)广西优势血清型代表株GX-YL5的S蛋白进行真核表达并研究其免疫原性,设计GX-YL5毒株S基因特异引物,扩增出目的片段后,构建重组表达载体pFastBacTM/HBM-TOPO-S,转化DH10Bac细胞获得重组杆...     

鸡传染性支气管炎病毒QX基因型S1蛋白重组乳酸菌的构建及小鼠免疫应答

为探究鸡传染性支气管炎病毒(IBV)S1蛋白重组乳酸菌对小鼠免疫应答情况,本研究将IBV CH/LN/2019毒株的S1基因进行密码子优化,构建重组质粒pNZ8149-S1,电转至乳酸乳球菌NZ3900中,应用Western blot及间接免疫荧光试验评价重组乳酸乳球菌表达水平,免疫SPF小鼠,通过间接ELISA方法分析小鼠特异性抗体、CD4⁺、CD8⁺和细胞因子(IL-4和IFN-γ)分泌情况;结果显示,成功构建重组乳酸乳球菌pNZ8149-S1/NZ3900并表达目的蛋白;小鼠免疫试验结果显示,免疫组小鼠IgG抗体水平均高于pNZ8149/NZ3900、NZ3900和PBS组(P<0.05);特异性sIgA抗体水平显著高于对照组(P<0.01);此外,重组乳酸乳球菌能诱导小鼠产生较高水平的IL-4和IFN-γ(P<0.05)。结果表明,重组乳酸乳球菌pNZ8149-S1/NZ3900可以有效刺激小鼠机体产生体液免疫和细胞免疫,为IBV新型口服疫苗的研制提供了理论参考。     

鸡传染性支气管炎病毒S1基因在昆虫细胞中的表达

将含有传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）广东地方分离株Ｄ４１的Ｓ１基因ｃＤＮＡ（从ＡＴＧ到Ｓ前体蛋白裂解位点）的片段克隆到具有多角体启动子（ＰＸＩＶ）和人工合成启动子（Ｐｓｙｎ）的杆状病毒转移载体质粒ｐＳＸ－ＩＶＶＩ＋Ｘ３中，构建了重组转基因载体质粒ｐＳＸＩＶＶＩ＋Ｘ３－Ｓ１．Ｄ４１。用该重组转移质粒与无包涵体的粉纹夜蛾核型多角体病毒ＴｎＮＰＶ－ＳＶＩ－ＧＤＮＡ（ｏｃｃ－，ｇａｌ＋）共转染草地夜蛾（Ｓｆ９）细胞，筛选并纯化出既能表达Ｓ１基因又能形成多角体的重组病毒ＴｎＮＰＶ－ＩＢＶＳ１－ｏｃｃ＋（ｏｃｃ＋，ｇａｌ－）。通过间接ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ等方法在感染了重组病毒的Ｓｆ９细胞中成功地检测到分子量约６２０００的Ｓ１基因表达产物。虽然该重组Ｓ１糖蛋白可能由于Ｎ－糖基化不完全而分子量小于天然蛋白，但它可以像正常病毒粒子一样，被鸡抗ＩＢＶＤ４１株血清特异识别。     

表达鸡传染性支气管炎病毒S1基因重组鸡痘病毒对SPF鸡的免疫保护作用

将表达鸡传染性支气管炎病毒(IBV)S1基因的重组鸡痘病毒(rFPV-IBVS1)以5×106PFU剂量翅皮下注射接种4周龄的SPF鸡。血清抗体检测表明,该重组鸡痘病毒能刺激鸡体产生特异性抗体,外周血液中CD4 、TCRγδ T淋巴细胞比例显著高于对照组,而CD8 T淋巴细胞比例低于对照组。免疫后4周用1×103.0EID50的传染性支气管炎病毒LX4株进行攻毒,结果表明,重组鸡痘病毒免疫组与IB弱毒疫苗免疫保护率分别为12/16和13/16;攻毒后喉拭子IBV分离结果表明,IB弱毒疫苗和重组鸡痘病毒免疫组的IBV气管排毒时间比对照组缩短了2 d,病毒的分离率显著低于对照组;肾脏、气管、肺脏、腺胃、脾和肝脏的病理损伤也较对照组轻,而且病变持续时间缩短。     

鸡传染性支气管炎病毒DB株核蛋白基因的克隆及在杆状病毒系统中的表达

利用PT－PCR方法扩增鸡传染性支气管炎病毒（IBV）DB株的核蛋白基因，并对其序列进行了测定，DB株IBV的核蛋白基因长度为1230bp，编码蛋白由409个氨基酸残基组成。与已发表的参考毒株进行核苷酸同源性比较，发现DB株与澳大利亚群毒株的亲缘关系最为密切。同时构建了杆状病毒重组转移载体pBlue-DB-N，将其与线性化的杆状病毒DNA共转染Sf9昆虫细胞，经过3轮蚀斑纯化和聚合酶链式反应（PCR）鉴定，获得重组杆状病毒rBac-DB－N。SDS－PAGE分析和Western blot检测的结果表明DB株IBV核蛋白基因基因在重组杆状病毒感染原Sf9昆虫细胞内获得表达，融合蛋白最大表达量占细胞蛋白总量的19．4％左右。     

表达鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白重组腺病毒的构建及免疫原性的初步分析

拟构建表达鸡传染性支气管炎病毒(IBV)QS10株S1蛋白的重组复制缺陷型人5型腺病毒,并在本动物上进行初步的免疫学试验。通过RT-PCR获得S1基因,插入腺病毒表达系统穿梭质粒,构建重组穿梭质粒pac-Ad5CMV-S1,转染293AD细胞获得表达S1蛋白的重组腺病毒。PCR检测显示,S1基因已重组到腺病毒基因组;间接免疫荧光和Western blot检测证明该重组病毒在293AD细胞中真实表达了具有免疫反应性的IBV S1糖蛋白。重组病毒培养滴度可达到107 TCID50.mL-1。免疫接种SPF鸡后,通过ELISA检测,免疫鸡产生了针对IBV的特异性抗体。作者成功构建了表达IBV S1蛋白的重组腺病毒,该重组病毒可在SPF鸡体内诱导产生IBV特异性抗体。     

SPF级实验动物房的设计与建设

SPF级实验动物是生命科学研究中广泛认可的标准实验动物,生物医学的进步发展有赖于高品质的实验动物,而实验动物房及设施的规范建设和健康运行,则是提供SPF级实验动物的前提条件。初步制定西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室SPF级实验动物房的设计与建设规划,旨在通过科学合理的设计、设施完善的建设和严格规范的管理,确保SPF级实验动物房建成后的正常运行,为科学研究提供高质量的实验动物,满足各项科研工作的需求。     

鸡肾型传染性支气管炎病毒分离及鉴定

青岛地区暴发主要以侵害鸡肾脏的疾病,引起肾脏肿大、苍白,肾小管和输尿管有白色尿酸盐沉积,伴有下痢。产蛋鸡产蛋下降,雏鸡的死亡率达25%-90%。从感染鸡分离到1株疑为鸡肾型传染性支气管炎病毒,接种鸡胚,鸡胚出现侏儒化、蜷曲等特征性病变,暂定名为NIBV-AH111     

鸡肾型传染性支气管炎病毒的分离鉴定

鸡肾型传染性支气管炎是由传染性支气管炎病毒(IBV)所致的一种急性、高度接触性传染病,其病理特征是肾脏肿大、输尿管扩张,不同日龄、品种的鸡均有易感性.幼鸡感染发病后表现为高发病率和高死亡率.鸡IBV血清型众多,仅引起肾脏病变的毒株就至少有16个不同血清型,国内不同地区分离、鉴定的肾型IBV也明显存在着毒力和血清型的差异.     

鸡肾型传染性支气管炎病毒分离及鉴定

某鸡场暴发主要以侵害鸡肾脏的疾病,引起肾脏肿大、苍白,肾小管和输尿管有白色尿酸盐沉积,伴有下痢。产蛋鸡产蛋下降,雏鸡的死亡率达25%～90%。从感染鸡分离到1株疑为鸡肾型传染性支气管炎病毒,接种鸡胚,鸡胚出现侏儒化、卷曲等特征性病变。     

Construction and Immunogenicity of Recombinant Lactococcus lactis Expressing S1 Protein of Porcine Epidemic Diarrhea Virus(PEDV)

To evaluate the specific immune responses induced by recombinant Lactococcus lactis(L.lactis) which expresses porcine epidemic diarrhea virus(PEDV) S1 protein through oral administration,the spike gene fragment of PEDV was amplified from PEDV SDLY strain to construct p MG36 e-S1 recombinant plasmid.The recombinant plasmid was then electro-transferred into competent cells of L.lactis MG1363,to prepare the recombinant L.lactis expressing S1 protein of PEDV.The expression of target protein was identified by SDS-PAGE and Western-blot.New Zealand white rabbits were orally administered with the recombinant strain;the antibody titer in intestinal mucosa and serum was detected by neutralizing test;and the specific Ig G in serum was evaluated by indirect ELISA.The results showed that the recombinant L.lactis could effectively induce high level of Ig G in serum and high level of mucosal immune antibody.The recombinant L.lactis is qualified to be a potential oral vaccine because it could successfully stimulate both humoral and mucosal immune responses against PEDV.     

与鸡传染性支气管炎病毒混合感染状况下鸭源鸡杆菌在鸡体内的分布

为研究鸭源鸡杆菌(Gallibacterium anatis)在鸡体内的动态分布及鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)对其的影响,将鸭源鸡杆菌和鸡传染性支气管炎病毒分别或同时人工接种SPF蛋鸡,分别于接种后12、24、48、72、96 h对鸡进行剖检,无菌采集鸡的10种组织样品(上腭裂、气管、肺脏、心脏、脾脏、卵巢、肾脏、肝脏、十二指肠和输卵管),利用SYBR Green I定量PCR(Quantitative PCR,qPCR)方法检测鸭源鸡杆菌组、混合感染组在不同时间点、不同器官中的鸭源鸡杆菌DNA含量.结果显示:鸭源鸡杆菌单独感染时,12 h时即可侵袭到气管、心脏、脾脏、卵巢和肾脏,24 h时便可感染肝脏、十二指肠和输卵管,48 h时可传播到肺脏,72 h时感染上腭裂.混合感染组结果表明,鸭源鸡杆菌12h到达卵巢,24 h时即可出现在所有器官.混合感染组各器官的总体qPCR检出率为37.1％,显著高于鸭源鸡杆菌组的25.3％.鸭源鸡杆菌组和混合感染组qPCR检测结果均显示,鸭源鸡杆菌DNA在气管中的检出率最高,在卵巢中达到最高含量.鸭源鸡杆菌能够造成试验鸡的全身感染,该菌主要对鸡的呼吸系统和生殖系统有致病性,气管和卵巢是其主要的致病器官;2种病原同时接种加重了全身感染,IBV促进了鸭源鸡杆菌在鸡体内的传播,尤其促进了其在十二指肠中的增殖,增强了鸭源鸡杆菌对消化系统的致病性,导致鸡腹泻的发生.     

传染性支气管炎病毒(IBV)S1基因的真核表达及免疫原性检测

为了探讨S1基因在DNA免疫防制传染性支气管炎(IB)中的免疫原性，将IBV Z株S1基因插入到真核表达栽体pcDNA3．1／V5-His-TOPO中，构建了真核表达质粒pcDNAIBVZS。在脂质体作用下将pcDNAIBVZS转染CEF细胞，用间接免疫荧光试验检测，在CEF细胞中可见有大量S1蛋白表达。将重组质粒以100μg／只的剂量肌注免疫SPF雏鸡，经问接ELISA试验检测二免前后的血清，结果显示，pcDNAIBVZS基因可在SPF鸡体内诱导相应抗体的产生，具有特定的免疫原性。