拮抗灰霉病菌的芽孢杆菌筛选、鉴定及其代谢产物抑菌效果研究

筛选获得对灰霉病菌具有抑制活性的芽孢杆菌菌株,明确其胞外抑菌物质的活性及稳定性,为灰霉病提供安全、高效、易行的生物防治方式,并为其后续生防制剂的研发提供科学依据。采集我国云南、黑龙江、新疆、河北等地蔬菜种植土壤样品129个,采用稀释涂平板法分离获得芽孢杆菌4 200株,采用平板对峙法获得191株具有灰葡萄孢菌拮抗性能的菌株,其中菌株KA4的抑菌能力最强,对灰霉病菌的抑菌率为65.34%。采用形态学、生理生化特征以及16S rDNA和gyrB基因序列分析相结合的鉴定方法进行了KA4菌株的鉴定,将其鉴定为解淀粉芽孢杆菌,命名为BA-KA4。BA-KA4的无菌发酵液具有较强的抑菌活性,稀释10,20,40倍的无菌发酵液对灰葡萄孢菌的抑菌率分别为78.83%,65.19%,45.38%。通过单因素法测定了不同处理温度、pH值和紫外照射时间对BA-KA4无菌发酵液抑菌活性的影响,该菌株的无菌发酵液具有良好的温度、pH和紫外线稳定性。综上,解淀粉芽孢杆菌BA-KA4能够抑制灰霉病菌生长、胞外抑菌物质活性稳定,可作为灰霉病生物防治的优良微生物资源,具有良好的开发前景。     

土壤放线菌X1的筛选及其抑菌活性初探

筛选具有抑菌活性的放线菌是开发农用活性抗生素的基础。本文采用生长速率法和孢子萌发法,测定了从土壤中分离出的6株拮抗放线菌的抑菌活性,并对抑菌活性较好的放线菌X1菌株进行初步研究。生长速率法试验表明,放线菌X1菌株发酵液对供试12种植物病原菌菌丝生长均有不同程度的抑制作用,发酵液对苹果腐烂病菌、苹果轮纹病菌和葡萄白腐病菌菌丝的抑制率均为100%。孢子萌发试验表明,放线菌X1菌株发酵液对黄瓜枯萎病菌孢子萌发的抑制率为100%。在浓度为1 mg/mL时,放线菌X1菌株发酵液乙酸乙酯萃取物对苹果腐烂病菌、苹果轮纹病菌和葡萄白腐病菌菌丝的抑菌率均大于90%。放线菌X1菌株抑菌谱较广,对植物病菌的防治有很大的研究开发潜力。     

黄瓜枯萎病生防芽孢杆菌的定向筛选及其抑菌活性物质特性分析

研究拟从北京郊区黄瓜根际土壤中定向筛选黄瓜枯萎病菌生防芽孢杆菌,并研究其抑菌活性物质的基本特性。采用热处理和形态观察结合平板对峙法定向筛选黄瓜枯萎病菌拮抗菌。从北京郊区黄瓜根际土壤中定向分离到63株产芽胞的菌株,从中筛选到2株对黄瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporium f.sp.cucumarinum Owen.）具有较好拮抗作用的菌株,命名为j-28和j-50。拮抗菌j-28对黄瓜枯萎病菌的抑菌带达到11.0 mm。此外,拮抗菌j-28有较广的抑菌谱,对黄瓜灰霉病菌（Botrytis cinerea）、马铃薯干腐病菌（Fusarium sulphureum）和茄子黄萎病菌（Verticilllium albo-atrum）等具有很强的拮抗作用。经过形态观察、理化分析和分子鉴定,j-28和j-50鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。研究还发现拮抗菌j-28的发酵液经过高温和强酸碱处理后抑菌效果会明显减弱,说明拮抗菌j-28产生的主要抑菌活性物质可能是蛋白类。笔者定向筛选到针对北京郊区多发的黄瓜枯萎病菌拮抗菌枯草芽孢杆菌j-28,具有潜在的应用价值,为今后北京郊区黄瓜枯萎病菌的防治提供新的生物防治资源。     

抗香蕉枯萎病甲基营养型芽孢杆菌的鉴定及定殖

为系统评价分离自天然饼肥发酵液4-L-16菌株的抗真菌活性及定殖规律。以尖饱镰刀菌Race 4(Fusarium oxysporum f.sp.cubense Race 4)等9种病原菌为靶标菌株,采用平板对峙、含药介质法检测菌株抗真菌活性,并通过革兰氏染色、形态观察、生理生化特征和16S rDNA序列分析对其进行鉴定。结果表明:4-L-16菌株对9种植物病原菌具有广谱抗性,菌丝生长抑制率可达28.05%~76.07%,孢子萌发抑制率达24.44%~70.00%,其中对香蕉枯萎病菌的菌丝生长和孢子萌发抑制率分别为76.07%和70%,经鉴定该菌株为甲基营养型芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus。经抗生素标记,获得抗600μg/mL利福平的标记菌株,盆栽接种试验表明标记菌在香蕉根际土壤和植株体内具有良好定殖能力,接种第10天土壤中菌量达到最大值为6.67×10~6CFU/g,随时间延长,定殖数量逐渐降低,25天后数量趋于稳定,为2.05×10~6CFU/g。香蕉植株内定殖以根系最多,为4.38×10~3CFU/g。甲基营养型芽孢杆菌4-L-16菌株广谱抗真菌活性、良好的定殖能力,已成为香蕉枯萎病生物防治新的菌种资源。     

几种杀菌剂和拮抗菌对葡萄白腐病的室内防治试验

葡萄白腐病是国内葡萄生产上危害严重的病害之一,为了该病害的防治,采用平皿抑菌试验的方法测定了7种常用杀菌剂和7株拮抗菌对葡萄白腐病菌的抑制作用,并采用室内离体果穗人工接种的方法测定它们在离体果实上的药效。结果发现：7种杀菌剂和2株拮抗菌对葡萄白腐病均表现一定程度的防病效果,其中,杀菌剂百菌清和多菌灵对葡萄白腐病菌抑菌活性较强,拮抗菌解淀粉芽孢杆菌BJ-6和放线菌F2的发酵液也具有较强的抑菌活性。     

芽孢杆菌Pb-4菌株鉴定及其抑菌活性的研究

拮抗菌Pb-4是一株对多种植物病原菌有较强抑制作用的菌株。为了明确拮抗菌Pb-4的分类地位和抑菌机理,通过形态观察、生理生化特征和16S rRNA基因序列同源性比对及系统发育树分析,对Pb-4菌株进行鉴定。并采用平板对峙培养法测定Pb-4菌株的抑菌谱,显微观察其抑菌作用,采用硫酸铵沉淀和乙醚、苯提取得到抑菌活性物。通过加热处理,明确高温对Pb-4菌株抑菌活性的影响。结果表明,Pb-4菌株鉴定为解淀粉芽孢杆菌;Pb-4菌株对番茄枯萎病菌、黄瓜枯萎病菌、西瓜枯萎病菌、青椒枯萎病菌、辣椒疫霉病菌、苹果腐烂病菌均有抑制作用,其抑菌活性具有广谱性。该菌菌液能明显抑制枯萎病菌孢子的萌发,并对病菌菌丝有致畸作用;对番茄枯萎病菌的抑制生长率达93%,经100,121℃高温处理后的抑菌活性分别是未处理菌液的98.9%和80.1%。从菌液中提取的蛋白、酶、抗生素类活性物质对枯萎病菌的生长繁殖均有很强的抑制效果。为Pb-4菌株在病原菌防治中的广泛应用提供强有力的理论依据。     

一株拮抗放线菌NMG8-2的抑菌特性

为研究拮抗放线菌NMG8-2的抑菌活性,评价其在植物病害防治中的开发应用价值,对该菌株及其发酵液的抑菌活性、发酵液稳定性进行了研究。试验采用平板对峙法、抑制菌丝生长速率法和杯碟法测定拮抗放线菌NMG8-2菌株及其发酵液对18种植物病原真菌和6种细菌的抑制作用。结果表明:NMG8-2菌株及其发酵液对苜蓿茄镰孢根腐病菌、立枯丝核菌等16种植物病原真菌和胡萝卜软腐欧文氏菌、马铃薯环腐棒杆菌、青枯雷尔氏菌、蜡状芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌5种细菌具有较强的抑菌作用;发酵液能抑制苜蓿茄镰孢根腐病菌的分生孢子萌发和芽管伸长。不同条件下的稳定性测定结果表明:该菌株发酵液的抑菌作用对碱、紫外线、高温和蛋白酶均比较稳定,但在强酸条件下稳定性较差;连续传接10代,抑菌活性仍然稳定。     

烟草青枯病和黑胫病拮抗细菌的筛选、鉴定及防效研究

筛选对烟草青枯病和黑胫病具有良好防效的生防菌株,为烟草根茎类病害的有效防控提供生防资源。从发病烟株根际土壤中分离细菌,采用平板对峙法和滤纸片法测定分离菌株对烟草青枯病菌和黑胫病菌的抑制活性,基于盆栽验证法检测高活性菌株对烟草青枯病和黑胫病的防治效果,通过16S rDNA通用引物对高活性拮抗菌株进行分子生物学鉴定,同时选用9对特异性引物对高活性菌株的促生长和抑菌活性进行PCR检测。共筛选出2株对烟草青枯病和黑胫病均有防治效果的拮抗菌株LF-1和LF-2,经分子生物学鉴定LF-1为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis,LF-2为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens。室内活性试验结果表明,菌株LF-1、LF-2对烟草青枯病菌抑制率分别为31.16%、56.98%,对烟草黑胫病菌抑制率分别为64.44%、72.44%;盆栽试验结果表明,菌株LF-1对烟草青枯病和黑胫病的防效分别为69.54%和65.49%,菌株LF-2对烟草青枯病和黑胫病的防效分别为72.49%和68.32%。菌株LF-1和LF-2对烟草根茎类病害具有较好的生防效果,在烟草根茎类病害防控中应用前景广阔。     

棉花黄萎菌拮抗菌BDT-25的鉴定及抗菌蛋白产生条件研究

拮抗细菌BDT_25是从根际土壤中分离到的一株对棉花黄萎病菌具有强烈抑制作用的芽孢杆菌。经生理生化特征的鉴定,证明BDT_25菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。此外,该菌株还对棉花枯萎病菌、棉花立枯病菌等10种其他病原真菌的生长具有显著的抑制作用,为一株广谱拮抗细菌菌株。通过对BDT_25菌株培养条件的研究发现,采用NB液体培养基,28℃,170 r/min培养48 h所得发酵液对棉花黄萎病菌的抑制作用最强。其发酵液经硫酸铵沉淀粗提到对棉花黄萎病菌具有抑制作用的提取物,进一步实验表明,该拮抗物质对热和多种蛋白酶敏感,证实其为抗菌蛋白。     

生防菌株NJ-18的鉴定及其对几种植物病原真菌的拮抗作用研究

NJ-18是从油菜田土壤中分离筛选获得的一株具有抗真菌活性的细菌,本研究从形态和生理生化特征及16S rDNA序列分析,鉴定NJ-18菌株为枯草芽孢杆菌。经平板对峙试验表明,NJ-18发酵液对Sclerotinia sclerotiorum、Rhizoctonia solani、 Fusarium moniliforme、Magnaporthe grisea、F. graminearum、R. cerealis、 Alternaria solani、Botrytis cinerea and Fusarium oxysporum等九种植物病原真菌菌丝生长都具有良好的广谱抑菌活性;盆栽植株试验表明,NJ-18发酵液对小麦白粉病具有很好的保护和治疗作用,发酵原液的保护和治疗作用效果分别高达到96.1%和88.2%,发酵液稀释200倍后处理,对小麦白粉病的保护和治疗作用效果分别达到58.8%和51.4%。     

海岸盐沼湿地细菌抗真菌活性研究

为了开发对植物病原真菌生长有抑制作用的药源微生物,本实验采用平板稀释法从江苏大丰盐沼湿地土壤中分离微生物,并通过菌丝块法检测这些微生物代谢产物对5种植物病原真菌生长的抑制活性,进而利用柱层析分析其活性成分;结果共分离得到235株细菌,其中好氧细菌92株,厌氧细菌143株;体外活性测试结果显示有65株至少对1种测试植物病原真菌的抑制率在30%以上,其中好氧菌39株,厌氧菌26株。从好氧和厌氧菌株中分别选取3株和1株具有不同抗菌类型的菌株进行大批发酵,用不同的方法对发酵液吸附,分离和纯化,获得抗真菌活性组分。可见,海岸盐沼湿地土壤中蕴涵着大量的细菌种群,约有28%的细菌菌株能够产生抗真菌活性物质,其中Y6、Y156和Y96的抗真菌活性物质极性较大,值得进一步开发。     

芽孢杆菌BJ-6产抗菌物质发酵条件初探

芽孢杆菌（Bacillus sp.）BJ-6分离自北京市门头沟区杏树根围土壤,它能够产生对多种植物病原真菌有强烈拮抗作用的抗菌物质。采用单因素试验和正交试验进行了发酵条件的筛选,发现：芽孢杆菌BJ-6产生抗菌物质的最适液体培养基配方为麦芽糖20g,蛋白胨10g,麸皮10g,CaCO3 10g,Na2HPO3 2g,KH2PO3 1g 和水1000ml;最适发酵条件为：接种种龄10 h、接种量1%、发酵温度30℃~35℃、转速为210 r/min、培养时间60 h和起始pH为9。     

2株放线菌的抗菌活性及分类学地位

旨在对2株放线菌HD-103和HD-109的抗菌活性和发酵液稳定性进行比较分析,并明确2株菌的分类学地位。以13种植物病原真菌为靶标菌,利用琼脂柱法分析2株生防菌的抗菌谱;以尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporumf.sp.glycines)为指示菌,利用杯碟法检测2株生防菌发酵液的热稳定性、pH稳定性及紫外稳定性,并进行比较分析;在此基础上采用多相分类法对2株菌进行鉴定。研究结果显示：2株菌的抗真菌谱均较广,其中HD-103对禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearumf.sp.Glycines)的抑制效果最显著,抑菌圈直径达到23.7mm,HD-109对烟草赤星病菌(Alternariaalternate)抑制效果最好,抑菌圈直径达25.0mm;HD-103的抗菌活性物质较HD-109的活性物质更为稳定;分类学鉴定结果表明,菌株HD-103与HD-109为微白黄链霉菌(Streptomycesalbidoflavus)的2个菌株。菌株HD-103与HD-109能够抑制多种植物病原真菌,其发酵液具有较好的热稳定性和酸碱稳定性,具有开发为新型生物农药的潜力。     

Isolation and Characterization of Endophytic Bacillus methylotrophicus LH-L3 Antagonist of Cotton Verticillium Wilt

The aim of this study is to obtain endophytic Bacillus with control effect on cotton Verticillium wilt. [Method] The cotton tissue grinding liquid was heated at 80 ℃, and spread onto the Luria-Bertani ager medium. The strains with better inhibitory effects on Verticillium dahliae Vd084, a strain with strong pathogenicity, was identified by the morphology, physiological and biochemical traits as well as 16S rRNA, gyrB and rpoB sequences, and its control effect on cotton Verticillium wilt was determined by pot experiments. [Result] 61 similar Bacillus strains were isolated from cotton plants. Among them, 17 strains could inhibit Verticillium dahliae Vd084. A strain named LH-L3 with a relatively higher antagonistic activity and a broad inhibition spectrum was obtained in the second screening. LH-L3 was classified into Bacillus methylotrophicus. Compared with the control, the emergence rate, plant height, root length, fresh weight of aerial part and underground part of cotton with 106 mL^－1 LH-L3 suspension drenching for 3 times increased by 42.85%, 10.24%, 23.83%, 10.05% and 97.62%, respectively. And control effect on Verticillium wilt was 85.24%. [Conclusion] LH-L3 had good growth promotion and Verticillium wilt control effects and showed good potential for biological control.     

雷公藤内生真菌的抑菌活性研究

通过对雷公藤植物内生真菌进行分离,对内生真菌抑菌活性进行了研究。研究结果显示,从雷公藤不同器官中共分离出22株不同形态型的内生真菌,其广泛存在于植株的根、茎、叶中,其中植株枝中的分离数量高于根和叶。大多数内生真菌都具有抑菌活性,与菌丝体相比,内生真菌的发酵液提取物具有较强的抑菌活性。不同类型病源菌的比较结果表明,筛选的内生真菌对病源性真菌具有较好的抑制作用。     

PVA降解菌株的筛选鉴定及其固定化工艺研究

为了得到一株降解PVA的芽孢杆菌,并对其进行固定化研究。利用PVA碘-硼酸平板法初筛,降解率测定法进行复筛,并通过正交试验探索其固定化工艺。经初筛得到8株可降解PVA的细菌,复筛出1株具有较高降解率的菌株3-9,48 h降解率为86.56%。该菌株鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis subsp.subtilis)。该菌株的最佳固定化条件为：4%海藻酸钠,3%CaC1₂,包埋0.1 g的湿菌体,钙化时间4 h。结果表明固定化后的PVA降解菌比游离菌的降解性能提高了14.02%。本研究得到了一株高效降解聚乙烯醇的枯草芽孢杆菌,并确定其最佳的固定化条件,为PVA污水处理提供了菌种资源和理论基础。     

枯草芽孢杆菌ON-6菌株抑制荔枝炭疽菌活性物质的初步研究

为了探索枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）对广西重要的药食两用水果--荔枝采后病害的防治效果及其机制,本文在进行采集、分离、筛选和鉴定的基础上,对枯草芽孢杆菌ON-6菌株发酵液提取拮抗物质方法、拮抗物质的理化性质等方面进行了研究。对ON-6菌株发酵液采用浓盐酸沉淀法及硫酸铵沉淀法,得到的提取液均有抑菌活性,表明ON-6菌株能产生能蛋白类和脂肽类抗生物质。对该菌株的蛋白粗提液进行30~60℃处理30 min,其活性保持不变,121℃处理20 min,活性丧失不足原有的40%;作用活性pH值在5.0~8.0范围内;对胰蛋白酶不敏感,对蛋白酶K和胃蛋白酶部分敏感;对紫外线不敏感。     

土壤拮抗细菌的分离与筛选

为了获得高效广谱的原始拮抗细菌菌株用于油茶病害的防治,并探索其生物防治效果。从土样中分离到223株细菌,采用平板对峙培养法、发酵产物活性测定进行拮抗菌筛选。结果表明：以油茶炭疽病菌和根腐病菌为指示菌,通过平板对峙培养初步选出抑菌效果较好的菌株21株,其抑菌圈宽度在5.0~12.5 mm,占分离到的细菌总数的9.9%,其中菌株Z26抑菌效果最好;复筛表明21个菌株发酵液对供试6种植物病原菌有不同程度抑制作用,其中有8株对油茶炭疽病菌抑菌效果良好,有4株对油茶根腐病菌抑菌效果良好,其抑菌圈宽度≥10.0 mm,分别占被测菌的38.1%和19.0%,菌株Z26抑菌效果最好;发酵产物活性测定表明6个菌株的发酵液能完全抑制油茶炭疽病菌生长,效果明显,过滤液抑菌率为33.3%~58.3%,效果不明显,抑菌率超过50.0%的只有Z17、Z26 2个菌株。由此可知,菌株Z17和Z26对油茶病害有较好的抑菌效果,具有一定的生防潜力,可作为油茶病害的备选拮抗菌株开展深入研究。