一种植物表达载体的构建及其金柑上的瞬时表达

以植物表达载体pCambial301的带内含子的GUS（iGUS）基因替换植物表达载体pBI121中的GUS基因，构建了以pBI121为基础载体并含有iGUS的植物表达载体pLZ13。农杆菌染色表明，pCamiba1301和pLZ13两载体中的iGUS基因均不会导致GUS染色反应。以金柑不同组织为材料，通过农杆菌介导开展瞬时表达研究，结果表明，pLZ13和pCambial301两载体的iGUS在CaMV 35S启动子调控下的表达没有差异，证明构建的pLZ13是一种同时适于瞬时表达和转基因研究的植物表达载体。     

韧皮部特异启动子驱动密码子优化的抗菌肽D基因的植物表达载体构建

根据177个GenBank中登录的柑橘编码蛋白密码子用法的分析结果,优化并重新设计和合成了含柑橘偏爱密码子、对柑橘黄龙病有杀灭作用的柞蚕抗菌肽D基因(命名为CAPD),克隆入pUC19克隆载体并经测序验证后,获得了含新抗病基因的重组质粒pUC19-CAPD。用限制性内切酶BamHI和SacI双酶切pUC19-CAPD克隆载体和pBI121植物表达载体的质粒DNA,回收pUC19-CAPD克隆载体中的CAPD基因小片段和pBI121植物表达载体中去掉GUS报告基因的大片段,经连接、转化和鉴定后,构建了由CaMV35S组成型启动子(35SP)驱动CAPD目的基因的新植物表达载体(命名为pHZ05);用限制性内切酶BamHI和HindIII双酶切含笋瓜韧皮部特异启动子(PSP)的pUCm-PSP克隆载体和pHZ05植物表达载体的质粒DNA,分别回收pUCm-PSP克隆载体中的PSP小片段和pHZ05植物表达载体中去掉CAPD目的基因上游35SP的大片段,经连接、转化和鉴定后,构建了由PSP驱动CAPD目的基因的新植物表达载体(命名为pHZ06)。利用细胞感受态法直接将2个由不同启动子驱动的含CAPD目的基因的新重组植物表达载体分别导入根癌农杆菌LBA4404、GV3101、EHA105和发根农杆菌Ri15834等4个农杆菌菌株中,为利用农杆菌介导的遗传转化技术培育抵抗由韧皮部传导的毁灭性和检疫性病害柑橘黄龙病的新种质奠定了基础。     

草莓果实外源基因瞬时表达系统的建立

将东北红豆杉紫杉烷13α-羟基化酶(Taxane13α-hydroxylase,13OH)基因全长cDNA正向插入到pCAMBI-A1304,构建其植物表达载体pCT13OH;将水稻小RNA169d(microRNA169d,miRNA169d)基因前体(precursor)全长DNA正向插入到pCAMBIA1305.1,构建其植物表达载体pCO169d。用电击法把它们导入根癌农杆菌GV3101,获得有关工程菌株。用1mL无菌注射器分别将这2种工程农杆菌悬浮液注射到草莓(Fragaria×ananassa)授粉后1周、2周、3周的果实中,发现授粉后2周果实适宜注射,可用于瞬时表达。对授粉后2周的果实进行不同注射部位、根癌农杆菌不同活化时期和根癌农杆菌悬浮液不同注射量试验,以蒂部注射、根癌农杆菌活化12h和0.5mL悬浮液注射量的效果最好,与结构基因13OH和调节基因miRNA169d相融合的GUS基因都得到表达,瞬时表达成功。     

甘蓝Ogura 细胞质雄性不育相关基因BoMF1启动子的克隆及功能分析

 通过TAIL-PCR 染色体步移技术,从甘蓝（Brassica oleracea L. var. capitata L.）基因组中克 隆到胞质雄性不育（OguCMS）相关基因BoMF1 翻译起始位点上游521 bp 的启动子序列。软件分析预测 表明,该启动子序列中存在多个顺式作用元件,包括TATA-box、CAAT-box、MYB 结合位点、植物激 素响应单元等。为了研究该启动子的表达特性,亚克隆了BoMF1 转录起始位点上游521 bp 序列,将其置 换pBI121 中的CaMV35S 启动子,驱动其下游的GUS 基因,构建植物表达载体pBI121-BoMF1P,以pBI121 空载体作为阳性对照,通过农杆菌（LBA4404）介导法转入拟南芥。结果表明,甘蓝BoMF1 启动子序列 能驱动GUS 基因在拟南芥花药发育晚期的花药和花粉中特异表达,表达具有组织特异性。     

GUS基因在农杆菌和甜瓜中的表达差异研究

以农杆茵和转化的甜瓜组织为试验材料,通过组织化学染色法,来研究GUS基因在农杆菌和甜瓜组织中的表达.结果表明,含有GUS基因的农杆茵和甜瓜愈伤组织都能被染成蓝色,而不含有GUS基因的农杆菌和甜瓜愈伤组织没有被染色,因此在检测转基因植株时,可以减少或避免假阳性的出现,为植物的转化奠定了坚实的基础.     

发根农杆菌介导西瓜转基因过表达体系的建立

【目的】建立发根农杆菌介导的西瓜转基因不定根过表达体系。【方法】探索利用野生型发根农杆菌K599侵染西瓜材料'Sugar Baby',诱导西瓜产生不定根的实验方法。借助该方法,将含有GUS基因和EGFP基因的过表达载体pCAMBIA3301和pCAMBIA1300-ProSuper导入发根农杆菌K599,侵染西瓜材料'Sugar Baby',通过常规PCR、qRTPCR、GUS染色和激光共聚焦显微镜检测,评价该过表达体系的效果。【结果】利用野生型和导入外源质粒的发根农杆菌均能成功诱导西瓜'Sugar Baby'产生不定根。PCR检测结果显示,携带pCAMBIA3301和pCAMBIA1300-ProSuper载体的发根农杆菌K599诱导产生的不定根阳性率达到100%。qRT-PCR、GUS染色和激光共聚焦显微镜检测均能成功检测到GUS基因和EGFP基因的过量表达。【结论】利用发根农杆菌K599诱导西瓜产生不定根介导基因过表达的方法,具有周期短,操作方便,转化率高的特点,可实现基因功能的快速验证,为西瓜根系相关基因的功能研究提供技术支持。     

结球甘蓝春化相关基因VIN3反义植物表达载体构建及转化

以pBI121植物表达载体和BoVIN3-1基因片段为基础,构建结球甘蓝春化相关基因VIN3反义植物表达载体。将BoVIN3-1基因片段反向插入355启动子与GUS基因之间的限制性酶切位点XbaⅠ和SmaⅠ中,构建含反义BoVIN3-1基因的工程质粒pBI35S-BoVIN3-1。通过花蕾微量注射法转化结球甘蓝,获得9株转化植株。PCR检测结果表明,其中5株为阳性植株,阳性株率55.6%。经春化处理的转反义基因植株与对照相比,春化一定程度被推迟。半定量RT-PCR检测结果表明,转化植株在进行低温处理后仍有该基因少量表达,并随春化处理时间的延长转录水平升高,在第50天时表达量达到最高。     

番茄果实特异性LYC-B 干扰载体的构建及在不同颜色果实中的表达特异性验证

为了研究番茄LYC-B 干扰对类胡萝卜素合成主要酶和主要代谢产物的影响，构建了果实特异性的番茄红素β- 环
化酶LYC-B 干扰载体，并验证了其在不同颜色番茄果实中的有效性。依据X13437.1 扩增番茄果实特异启动子E8，构建了果
实特异性载体E8-pBI121，其在粉色、红色、绿色和紫色的番茄果实中均能表达。依据X86452.1 扩增番茄LYC-B 从61～861
bp 间长度为801 bp 的片段LYC-B1 和从 480～781 bp 间长度为302 bp 的片段 LYC-B2，构建了以CaMV 35S 为启动子的LYC-B
干扰表达载体pBI121-B1B2，以E8 替换CaMV 35S，构建了果实特异性干扰载体E8-pBI121-B1B2。采用农杆菌注射法分别
侵染番茄叶片和果实，GUS 染色显示，pBI121-B1B2 在叶片、果实和种子中均表达，E8-pBI121-B1B2 只在果实和种子中表达。     

银杏查尔酮合成酶基因启动子（GbCHSP）调控元件及功能分析

通过染色体步移方法从银杏（Ginkgo biloba L.）基因组中克隆到查尔酮合成酶基因（CHS）翻译起始位点上游1 711 bp的启动子序列。生物信息学分析表明,该启动子片段中存在多个顺式作用元件,包括紫外/蓝光响应单元、植物激素响应单元、真菌诱导元件、MYB结合位点、TATA-box和CAAT-box等。亚克隆了CHS转录起始位点上游1 402 bp序列,将其与GUS基因构建融合表达载体pBI121 + CHSP,以pBI121-35S作为负对照,通过农杆菌（LBA4404）介导法分别转入烟草。结果表明,银杏CHS启动子序列能驱动GUS基因在烟草中的表达,表达具有组织特异性。GbCHSP的功能研究将有助于揭示银杏叶黄酮的积累与GbCHS基因表达的分子机理。     

香蕉凝集素基因双启动子表达

为了获得香蕉果实特异表达的强启动子,利用PCR方法将2个凝集素(BanLec)基因启动子串联在一起,置换植物表达载体pBI121上的35S启动子,构建BanLec基因双启动子携带gus植物表达载体pBIL3,用基因枪转化香蕉叶片、根系和果实薄片,瞬时表达结果显示BanLec基因串连的双启动子依然表现为果实特异性表达,而且表达量明显高于BanLec基因单启动子及35S启动子,证明该串连的双启动子是一个在香蕉果实中特异表达且表达量较高的强启动子。     

芜菁花青素合成关键酶DFR基因启动子的克隆及功能分析

在已经克隆的‘津田’芜菁和‘赤丸’芜菁二氢黄酮醇4–还原酶（DFR）基因的基础上,通过染色体步移法从两种芜菁基因组中克隆了BrDFR1和BrDFR2基因上游1 296和1 297 bp的启动子序列。生物信息学分析表明,启动子片段中包含TATA box、CAAT box、光调控元件、ABA应答元件、伤害应答元件、低温应答元件、防御与胁迫应答元件、MeJA应答元件等多个顺式作用元件。启动子BrDFR1P和BrDFR2P仅在15个核苷酸位点存在差异。将BrDFR1P和BrDFR2P分别连接到pCAMBIA1301植物表达载体上,构建Promoter::GUS载体,通过农杆菌介导遗传转化烟草。GUS组织化学染色检测表明,BrDFR1P和BrDFR2P均能驱动GUS基因表达。构建BrDFR1P和BrDFR2P的一系列缺失体,融合GUS基因后遗传转化烟草。染色结果表明,BrDFR1P和BrDFR2P缺失片段均具有相应的起始下游基因转录的活性特征。     

银杏GinNdly基因的植物表达载体构建

未知功能的植物基因一般需要通过转基因植物来研究和验证。银杏(Ginkgo biloba L．)是一种童期很长的古老植物，LEAFY基因是一个花分生组织特征基因，调控着植物开花的时间。用植物双元表达载体质粒pCAMBl-Al301构建了开花基因，LEAFY的银杏同源基因GinNdly的反义与正义植物表达载体。因pCAMBlAl301质粒的多克隆位点处没有启动子和终止子，将pB1121的35S启动子和nos终止子引入该质粒。通过PCR检测和酶切验证，证明质粒构建正确，为研究银杏花分生组织特征基因GinNdly奠定了基础。     

High GUS expression in protoplasts isolated from immature peach fruits

A protocol for transient expression analysis was developed using protoplast isolated from immature peach fruits. The uid A gene for β-glucuronidase (GUS) was introduced into the protoplast as a reporter gene to evaluate the protoplast activity. Protoplasts isolated from immature fruits at 28–32 days after full bloom (DAFB) showed high GUS activity under the cauliflower mosaic virus 35S promoter. The highest GUS activity was obtained from the protoplasts isolated at 32 DAFB, but it was difficult to isolate protoplasts showing high GUS activity from 34 DAFB. A comparison of the effect of promoter cassette on gene expression showed that the promoter containing the tobacco mosaic virus Ω sequence enhanced GUS activity by at least 10-fold in the peach protoplasts relative to the 35S promoter. The level of GUS activity under the 35S promoter in the peach protoplasts was 0.47-fold as that obtained from maize protoplasts isolated from young greening leaves, indicating that the GUS activity of immature peach protoplast is sufficient for gene expression analysis. Since stable transformation and evaluation of fruit traits in peach transformants are difficult, this transient expression system could be useful for the characterization of genes expressed in peach and other Rosaceae fruit species.     

甜瓜多聚半乳糖醛酸酶反义基因植物表达载体的构建及其转化烟草的研究

用限制性内切酶从目的基因供体质粒pBI-aPG上切下大小约2.3kb的目的基因,将它定向连接在受体质粒pCAMBIA2301载体上,构建成含有GUS基因和NPTⅡ基因的甜瓜多聚半乳糖醛酸酶反义基因植物表达载体pCB-aPG。采用直接转化法将pCB-aPG导入根癌农杆菌菌株LBA4404,采用该菌株对普通烟草进行了遗传转化研究。在Kanamycin选择压力下获得的烟草转化不定芽和完整植株,经过GUS基因组织化学法检测以及PCR方法鉴定,证实了该反义基因已导入烟草基因组中。此项研究为下一阶段用该反义基因转化甜瓜品种以改良甜瓜果实耐贮运性打下基础。     

柑橘CsTBL1启动子的克隆及其在转基因拟南芥中的活性分析

以奥林达夏橙[Citrus sinensis(L.)‘Olinda’]为材料,克隆了CsTBL1基因编码起始位点上游长度为2 361 bp的启动子序列。生物信息学预测表明,该启动子中含有多个与逆境应答相关的顺式作用元件。为进一步分析CsTBL1启动子的功能,构建了该基因启动子与GUS基因融合的植物表达载体,并用浸花法转化拟南芥,对T3代转基因拟南芥进行GUS活性染色。结果显示,CsTBL1启动子在1～3 d龄幼苗所有组织中的活性都非常强,在7～20 d龄幼苗的子叶和根中的活性仍然较强,但在下胚轴中基本检测不到活性。在50 d龄幼苗中,只在叶、茎的毛状体以及还在生长的根中检测到GUS活性。转基因植株的GUS表达受到1–氨基环丙烷–1–羧酸(乙烯合成前体,ACC)、脱落酸(ABA)、甲基茉莉酸(MeJA)和水杨酸(SA)诱导。上述结果表明CsTBL1可能在植物发育和抗外界逆境胁迫中起到非常重要的作用。     

农杆菌介导菊花双菌共转化法中部分影响因素的研究

用XhoI酶切质粒pCAMBIA1301自身环化后得到T-DNA区只含GUS基因的重组质粒pCAMBIA1301-GUS,通过液氮冻融法将质粒pCAMBIA1301-GUS,pCAMBIA1300转入农杆菌LBA4404和EHA105中,并对菊花进行叶盘共转化实验,根据共培养3d后叶片中GUS的瞬间表达及其稳定共转化率,测定了不同农杆菌菌株搭配及其不同浓度配比对共转化效率的影响,结果表明：在两种农杆菌菌液浓度比为1：1时,其中EHA105/pCAMBIA1300与EHA105/pCAMBIA1301-GUS组合,共转化效率要高于其它菌株的组合,而在EHA105/pCAMBIA1300与EHA105/pCAMBIA1301-GUS组合中,两种菌液浓度比为1：2时共转化效率最高.     

莴苣高效瞬时表达体系的建立

 以GUS基因作为报告基因, 利用农杆菌真空渗透法, 采取正交试验设计对莴苣(Lactuca sativa L. sp) 的瞬时表达条件进行研究, 建立了高表达水平的瞬时转化体系(乙酰丁香酮200 μmol /L、菌液密度OD₆₀₀值0.8、真空处理30 min、共培养6 d) 。应用结果表明: 优势组合的表达水平比对照的表达水平提高16.3倍。