泡泡刺高通量转录组鉴定及其黄酮类代谢途径初步分析

[目的]为了更好的了解泡泡刺黄酮类生物合成途径及其潜在的抗逆作用,[方法]应用高通量RNA-seq测序技术对泡泡刺当年生新叶进行了转录组测序及相关生物信息学分析。[结果]表明:泡泡刺当年生叶中获得了13 013 444 total reads,总核苷酸数为1 171 209 960 bp(1.09 Gb),组装拼接后得到48 921条unigene序列;Nr、Swiss-Prot、COG、GO、KEGG等数据库分析显示,有30 407个Nr注释,19 671个Swissprot注释,9 273个COG功能注释,46 153个GO功能注释,13 654个KEGG注释,并从KEGG通路中找到参与黄酮类化合物合成途径的关键基因片段186个。[结论]本研究获得了较好的泡泡刺转录组序列信息,并且其中富含黄酮类化合物代谢途径的相关基因,这为其抗逆机制、药用价值的研究及开发利用提供宝贵资源。     

半枫荷叶片转录组特征研究

半枫荷为特色木本药用植物,药用历史悠久,具有活血通络、祛风除湿、止血化瘀等功效。为探索半枫荷活性成分生物合成的分子基础,本文通过Illumina HiSeq 4000高通量测序技术对半枫荷叶片开展转录组测序分析,共获得了112 361条Contigs,进一步组装得到93 602条unigenes。对半枫荷叶片转录组unigenes进行Blast分析,得到47 798个CDS片段;与Swiss-Prot数据库相比较,得到29 778个蛋白同源序列;与COG数据库比对,有19 279条unigenes被COG功能注释;进行GO功能分类分析,有29 330条unigene注释到GO数据库中;进行KEGG功能注释,发现16 621个unigenes参与了131条代谢通路;通过生物信息学分析,发现多个萜类化合物生物合成途径关键基因。另外,转录组序列中共检测到21 819个SSR位点,其中二核苷酸所占比例最高,达到了47. 93%。研究结果不仅为进一步挖掘半枫荷次生代谢产物合成途径的关键基因提供了丰富的基因资源,同时为半枫荷遗传多样性研究奠定了分子基础。     

泡桐根系应答铅锌矿胁迫的转录组分析

【目的】白花泡桐Paulownia fortunei (Seem.) Hemsl.为中国南方重要的尾矿造林树种。为了揭示泡桐根系受重金属胁迫后的转录调控机制,明确泡桐根系响应重金属胁迫的相关基因和重要通路。【方法】以生长在铅锌矿、南方红壤的白花泡桐根为实验材料,进行高通量测序,将组装的基因序列在Nr、Nt、Pfam、KOG/COG、SwissProt、KEGG和GO数据库中进行基因功能注释,同时对在红壤、铅锌矿中差异表达的泡桐根部基因进行了分析。【结果】1)经过测序共得到366 701 960条reads序列,总碱基数为53.90 Gb,GC平均含量达44.58%。将测序所得reads再经Trinity软件组装后得到126 061条基因序列,其中96 133条序列获得了注释信息,占总数的76.25%。2)注释到Nr、Nt、Pfam、KOG/COG、Swiss-Prot、KEGG和GO数据库的基因序列数分别为63 938、64 685、68 840、29 886、66 433、28 747、68 840条。3)相对于红壤生长条件,铅锌矿胁迫时泡桐根部分别有154个基因上调和4 143个基因下调表达。4)差异表达基因的GO富集性分析发现,这些基因的功能主要集中于结合(Binding)、细胞器(Organelle)、细胞蛋白代谢(Cellular protein metabolic process)。将差异表达基因在KEGG数据库中比对发现,差异基因主要富集于核糖体、内质网蛋白加工、剪接体、胞吞作用、RNA转运、吞噬代谢、mRNA监测等7个代谢通路。其中,核糖体是最主要的代谢途径。q RT-PCR所检测的6个差异基因表达模式与RNA-seq结果保持一致,证实了RNA-seq结果的可靠性。【结论】本研究提供了泡桐根部在铅锌矿和红壤条件下的转录组信息,并分析了泡桐根部转录组变化情况,为寻找泡桐根部响应重金属胁迫的基因打好基础。     

云南干热河谷地区余甘子转录组分析

[目的]对云南干热河谷地区余甘子转录组特征进行描述,旨在为余甘子微卫星标记的开发和功能基因的挖掘提供较全面的背景信息。[方法]采用Illumina Hiseq 4000测序平台对余甘子叶片进行转录组测序,对原始数据进行过滤、de novo组装及聚类去冗余等处理后,再与公共数据库进行比对,对Unigenes进行基本功能注释、CDS预测、TF编码能力预测及R-Gene预测等分析。[结果]本研究共获得10. 52 Gb的Clean reads,Q20、Q30分别为98. 47%、95. 28%。组装并去冗余后获得76 881条Unigenes,平均长度、N50分别为713、1 257 nt。通过与NR、COG、KEGG和Swiss Prot数据库进行比对,44 768条Unigenes获得功能注释。余甘子转录组Unigenes根据COG功能注释信息大致分为25类;按GO功能注释信息划分为生物学过程、细胞组分和分子功能3大类47亚类;参考KEGG注释信息,可归为6大代谢通路、21类代谢途径,其中约3/5为代谢相关通路。根据以上注释结果共检测出42 953个CDS,其余未比对上的Unigenes用ESTScan预测后得到2 058个CDS。同时,预测到56个TF家族以及18种RGene。[结论]本研究获得的余甘子转录组Unigenes序列的组装质量较高、完整性较好、基因丰富、功能多样,极大地扩充了余甘子基因信息库,为今后余甘子乃至叶下珠属植物功能基因挖掘、抗性机理分析、分子标记开发、分子辅助育种等研究提供了重要的基础数据。     

牡丹花型基因的研究

为研究牡丹花型的分子机理,挖掘调控牡丹雌蕊瓣化的候选基因,揭示牡丹不同花型的分子机理,以牡丹‘黑海撒金’(tree peony ‘HEIHAISAJIN’)和‘璎珞宝珠’(‘YINGLUOBAOZHU’)为材料,采用Illumina Hiseq测序技术进行花瓣的转录组测序,通过序列的拼接、组装和过滤,得到牡丹的转录组;比较‘黑海撒金’和‘璎珞宝珠’中转录本特定基因的表达量,获得差异表达基因;将差异表达基因进行GO功能注释和KEGG代谢通路分类,获得与花发育相关的功能基因。通过de novo的拼接和组装,获得了49 191个unigenes;差异显著性分析得到2 735个差异表达基因(DEGs),其中1 082个为上调基因,1 653个差异表达基因下调。GO功能注释发现,DEGs主要分布在25个功能区,最显著富集的为90 S preribosome。KEGG代谢通路中显著富集的通路有13条,最显著富集的通路为Ribosome。对功能基因进行挖掘和比对,发现与开花相关的ABCDEF模型基因有3个,分别为agamous-like MADS-box protein 65(AGL65), floral homeotic protein APETALA 2(AP2)和EMBRYO SAC DEVELOPMENT ARREST 3(EDA3)。认为利用转录组测序技术,可以分析雌雄蕊发育正常和雌蕊瓣化的不同花型的牡丹花瓣的功能基因。3个ABCDEF模型基因中,AGL65和EDA3为首次在牡丹中发现的花器官发育基因。说明这3个基因很可能是调控牡丹雌蕊瓣化的关键基因,参与牡丹花型的发育。该研究系统地挖掘与花型相关的基因,并发现了新的可能调控牡丹花型基因的成员,不仅为调控牡丹花器官发育挖掘了新的重要功能基因,也为揭示牡丹花型发育的分子机理奠定了重要的基础。     

仁用杏花芽3个发育时期转录组表达谱研究

为给仁用杏分子育种提供理论依据,培育仁用杏晚花新品种,通过Illumina Hi SeqTM2000高通量测序——转录组测序(RNA-seq)技术,对采于花芽萌动前后3个发育时期的仁用杏花芽进行转录组测序。经组装分析获得43 469条unigenes;将所得到的unigenes与基因库数据进行比较,对unigenes进行功能注释,共22 874条unigenes获得功能注释,并预测出21 910条unigenes蛋白编码区;将3个发育时期仁用杏花芽的花转录组通过GO功能分类,将17 237条unigenes分别归类为46个GO Term;通过将所有unigenes与KOG数据库比对,共有8 379条unigenes与其它植物相似,归为26类,未知功能的unigenes有409条,预测这些基因为仁用杏的新基因;通过与KEGG数据库比对,共获得6 203条unigenes,参与259个代谢途径,其中与植物节律代谢通路相关的unigenes有33条。     

麻竹笋转录组测序及苦涩味物质合成基因差异表达分析

[目的]研究避光处理对麻竹笋苦涩味物质合成相关基因表达的影响。[方法]利用Illumina HiSeq~(TM)2500平台对自然生长(CK)和覆土处理(EP)2种类型的麻竹笋进行转录组测序,并对差异表达基因进行分析。[结果]转录组测序共获得36.45 Gb原始数据,经组装去冗余处理得到53 388个Unigene,将所得Unigene比对到Nr、Pfam、COG、Swissprot、GO和KEGG数据库中进行功能注释,发现共有31 462条Unigene与其它物种的基因具有同源性。对CK和EP处理所测得的Unigene进行表达量的比较分析,筛选出1 846个差异基因,其中,在EP处理中上调表达基因998个,下调表达基因848个。由KEGG代谢通路分析发现,差异基因显著地富集在32个代谢途径中,其中,包含与苦涩味物质合成相关的糖酵解途径、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸合成途径等。进一步研究发现,参与麻竹笋芳香族氨基酸、单宁合成的PFK、ENO、PPY-AT/HPP-AT、LAR等酶基因在EP处理中表达量下降,荧光定量PCR验证结果与测序结果基本一致。[结论]避光处理抑制了苯丙氨酸、酪氨酸、单宁生物合成关键酶基因的表达,可能最终影响麻竹笋苦涩味物质的合成。     

白蜡虫雄虫真蛹转录组分析

[目的]蛹期对于白蜡虫雄虫发育和交配具有重要意义,但目前缺乏对于白蜡虫真蛹基因转录情况的分析,本研究旨在获得白蜡虫真蛹转录组数据,了解其转录组特征。[方法]采用Illumina Hi Seq 2000进行高通量测序,并进行生物信息学分析;采用荧光定量PCR(qRT-PCR)检测3个热激蛋白基因(hsp)在不同虫态中的表达动态。[结果]共获得63 957条unigene、63 272个开放阅读框(ORF)、9 561个SSR分子标记,unigene平均长度674 bp,共有14 327条unigene获得了注释,Gene Ontology(GO)注释和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)注释分析表明,很多基因参与的功能与白蜡虫蛹期的生理特征吻合。[结论]该转录组数据为白蜡虫基因功能鉴定和蛋白组学分析研究奠定了数据基础。     

偏肿革裥菌在木质环境下转录组构建与相关基因表达分析

【目的】对白腐菌偏肿革裥菌在木质和非木质环境下的转录组进行测序,为白腐菌降解木材的机制研究提供支持。【方法】采用高通量测序技术对木屑和非木屑处理条件下的菌丝样本进行转录组测序。利用eggNOG、GO、KEGG等数据库对转录本进行注释和比较分析,预测和筛选出偏肿革裥菌与木材降解有关的基因。应用荧光定量PCR(qPCR)检测mnp2等11个与木质素降解相关的差异基因在木屑处理5天条件下的表达量,结合转录组数据对这些基因的表达量变化趋势进行分析。【结果】偏肿革裥菌转录组测序共得到38.9 Gb Clean Data,各样品Clean Data平均达到6.49 Gb,各样品的Reads与参考基因组的比对效率在71.23%~74.25%之间。使用edgeR软件进行差异表达分析,得到差异表达基因898个,其中上调351个、下调547个。差异基因被注释到GO数据库的有251个,注释到KEGG数据库的有223个,注释到eggNOG数据库的有704个。eggNOG分析表明,差异基因表达多聚集在能量产生和转换、转录后修饰、蛋白质代谢、伴侣关系、次生代谢物的生物合成、碳水化合物的运输和分解代谢等功能分类下。GO分析表明,显著性富集与频率较高的生物过程是丙酮酸代谢过程、类异戊二烯生物合成过程、天冬氨酸家族氨基酸代谢过程和木质素分解过程。在KEGG通路分析中,差异基因分布到86个不同的生物途径,差异基因显著富集的代谢通路主要为:碳代谢、柠檬酸循环、芳香化合物降解、乙醛酸代谢。qPCR结果表明在木屑处理条件下基因mnp2、mnp3、lip9、lip2、laccase1和nadp的表达量明显上调;mnp10 s、mrp、cyp450-1、GroES1和GroES2的表达量明显下调,qPCR与转录组测序结果在表达量差异倍数上存在较小偏差,但整体趋势一致,可以证明转录组测序结果是正确可靠的。【结论】偏肿革裥菌降解木材与碳代谢、芳香化合物降解等通路密切相关;与木质素分解等生物过程密切相关。根据基因功能注释的结果得到11个与白腐菌降解木质素相关的重要差异表达基因。     

无瓣海桑根响应盐胁迫的转录组分析

[目的]初步探究无瓣海桑的耐盐分子机制,筛选出无瓣海桑抗盐候选基因,为后续功能验证实验及林木抗盐性遗传育种奠定分子基础。[方法]以1年生无瓣海桑幼苗为材料,用500 mmol·L^-1 NaCl分别处理0 d(对照组)和10 d(处理组),取不同条件下的根部组织进行转录组测序,并结合三代全长转录组数据进行后续生物信息学分析。[结果](1)与对照组相比,NaCl处理10 d后,无瓣海桑幼苗根系中共有14 401个差异表达基因,其中,7 153个上调,7 248个下调。(2)GO分析发现,共有11 068个差异基因在47个GO条目得到注释。(3)在KEGG富集分析中,共有6 189个差异基因富集到134条通路,其中,共有14条通路显著富集(P值<0.01,Q值<0.05)。(4)通过进一步对差异基因进行功能注释分析,共筛选出抗盐候选基因89个,其中,抗氧化基因24个,渗透调节物质基因22个,植物激素基因19个,蛋白激酶基因10个,转录因子基因14个。[结论]活性氧清除、渗透调节、植物激素、蛋白激酶及转录因子相关基因参与调控无瓣海桑盐逆境适应过程。     

蕨类植物芒萁幼孢子体转录组高通量测序及特征分析

[目的]采用高通量测序技术Illumina Mi Seq250获得蕨类植物芒萁的孢子体转录组数据,以期为芒萁的生长、发育、代谢调控、微进化机制分析等提供重要的分子信息。[方法]应用生物信息学方法对测序获得的大量单基因簇(Unigene)进行基因功能注释、代谢途径及微卫星分析等。[结果]本研究共获得18 463 296条序列读取片段(reads),总碱基数为4.62Gbp序列信息,经序列组装最终得到63 169个Unigene,平均单条Unigene长度为863 bp,N50为1 587 bp,其中分布在200 500 bp长度区间Unigene占总数的55.4%。数据库中的序列同源性比较表明,26 826个Unigene与其他物种的已知基因具有不同程度的同源性。芒萁转录组中的Unigene根据GO功能大致可分为细胞组成、分子功能和生物学过程3大类47个分支,其中有大量的Unigene与细胞进程、绑定活性、代谢过程和催化活性相关。将Unigene与COG数据库进行比对,根据其功能大致可分为26类。以KEGG数据库作为参考,依据代谢途径可将Unigene定位到257个代谢途径分支。此外,利用MISA软件检索2 6碱基微卫星,共找到13 286个SSR。在不同长度微卫星中,三核苷重复数量最多,占总数的40.41%。在各重复基序类型中出现频率最高的为AG/CT(14.45%)与AAG/CTT(12.39%)。利用重复基序开发的多态性SSR标记,可应用于芒萁不同个体的基因型分型鉴定。[结论]本研究获得了较高质量的芒萁转录组数据库,揭示了芒萁孢子体生长发育过程中表达基因的功能总体特征,可为芒萁进一步的功能基因挖掘和分子标记规模化开发奠定基础。     

基于马尾松干旱转录组的抗旱功能SSR位点分析

[目的]了解马尾松干旱胁迫转录组序列的功能分布和SSR位点分布特征,并探索与干旱关联的SSR位点。[方法]对马尾松幼苗进行持续干旱胁迫,选取干旱10、15、25 d及正常供水对照的马尾松针叶样品,通过总RNA提取、Illumina测序、raw reads去冗、Trinity拼接获得unigenes。利用Blast比对,对Unigene序列进行GO、KOG、KEGG功能注释及分类;利用Misa软件进行SSR位点批量搜寻,primer 3. 0软件进行规模化SSR引物设计;利用GOSeq(1. 10. 0)、KOBAS(v2. 0. 12)软件对差异表达的含SSR位点Unigene进行GO、KEGG显著性富集分析。[结果]马尾松转录组194 821个Unigene中,101 806个Unigene获得注释,包含64 943个GO功能注释、35 880个KOG功能注释及30 882个KEGG注释。搜寻到6 728个SSR位点,分布于6 367个Unigene中,SSR出现频率为3. 45%;重复类型以单、三、二核苷酸为主,分别占总SSR的35. 82%、33. 03%和25. 22%;重复基序以A/T、AT/AT、AG/CT、AGC/CTG、AAG/CTT为主;基序长度以10 20 bp的短序列SSR为主;基序重复次数以5～10次重复占优势;批量设计13 338对SSR引物。422个含SSR位点Unigene具有差异表达; KEGG富集分析发现,有11个含SSR位点的差异Unigene参与了光合作用、植物激素信号传导及类胡萝卜素合成等3个与干旱响应相关的代谢途径。[结论]从较高质量的马尾松转录组中获得101 806个具有注释的Unigene;从6 367个Unigene中挖掘出6 728个SSR位点; 422个含SSR位点的差异表达Unigene中筛选出11个与干旱关联的SSR功能位点,为抗旱功能基因定位及马尾松抗旱分子机制研究奠定基础。     

星天牛转录组及三大解毒酶家族相关基因系统发育分析

【目的】研究星天牛转录组信息及体内细胞色素P450单加氧酶(cytochrome P450 monooxygenase,CYP)、羧酸酯酶(carboxylesterase,CarE)和谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)三大解毒酶系的表达谱情况,通过构建系统进化树,探析其这3种酶系基因家族的类别及其系统演化关系,为星天牛对多寄主种类的适应性与杀虫剂的抗药性机制研究提供依据。【方法】采用新一代高通量测序技术Illumina HiSeq TM 2500 对星天牛进行转录组测序与数据分析,通过数据筛选并进一步与鞘翅目近缘物种的解毒酶同源蛋白进行系统发育分析。【结果】经测序、序列拼接得到55 260条unigenes,将其与公共数据库进行同源比对,注释了32 247条unigenes,在Swiss-Prot数据库注释的unigenes的数量最多(99.11%);注释到Nr数据库时与赤拟谷盗的unigenes同源性最高(60.25%);在GO数据库中,共有8 083个unigenes被成功注释,根据其功能大致可分为3 类47 亚类;在KEGG数据库中,4 600 条unigenes与162个预测路径可以匹配。通过基因注释发现248条解毒酶系基因在星天牛体内表达,包括139条CYP基因、72条CarE基因、37条GST基因。系统发育分析发现,星天牛的大部分CYP基因都至少与一种鞘翅目近缘物种的CYP基因聚类在一起,P450基因中的CYP6家族数量与其他近缘物种(鞘翅目)类似,包含的基因数量最多;CarE解毒酶蛋白基因主要为β-酯酶、神经趋化蛋白、外源性代谢酶、未知等4种类型,分别可能参与星天牛的一些激素以及信息素的加工、神经和发育过程、消化与解毒等生理过程;星天牛的GST基因聚类主要包含Microsomal GST、Sigma GST、Omega GST、Delta GST、Theta GST等亚家族,具有保护生物大分子免受氧化损伤、催化活力等功能。【结论】本研究获得星天牛的转录组信息,初步探明星天牛体内三大解毒酶系的表达谱及分化情况,可为星天牛对多寄主种类的适应性与杀虫剂抗药性的产生及遗传机制研究提供基础数据和参考。     

Red pine harvest debris as a potential source of inoculum of Diplodia shoot blight pathogens

A high incidence of Diplodia shoot blight (site means ranging 85-100%) was observed on recently planted red pine (Pinus resinosa) seedlings where mature red pine stands previously had been clearcut. An investigation of the potential of harvest debris as a source of inoculum of Diplodia pathogens then was conducted. Cones, bark, needles, stems from shoots bearing needles, and stems from shoots not bearing needles (both suspended above the soil and in soil contact) were collected from harvest debris left at sites where clearcutting occurred. Conidia were quantified, and their germination rate was assessed, and Diplodia species were identified using PCR. Conidia of Diplodia species were found at all study sites and conidia counts increased from samples collected from 6 to 18 months after harvest. Germinable conidia were obtained from debris collected 6 months to 5 years after harvest. Fewer conidia were obtained from debris collected at intervals of up to 4-5 years after harvest and the percentage of germinable conidia was lower after longer intervals following harvest. More conidia were obtained and a greater percentage germinated from debris collected above the soil than from debris in soil contact. The host substrate also influenced the number of conidia and the percentage that germinated. Planting red pine seedlings next to debris infested with Diplodia pathogens could provide a persistent source of inoculum. Results should prompt further consideration by land managers and researchers of the potential forest health risks, in addition to benefits, that may be associated with harvest debris.