致病疫霉对缬菌胺敏感基线的建立及抗性风险评估

为建立致病疫霉Phytophthora infestans (Mont.) de Bary对缬菌胺的敏感基线，采用菌丝生长速率法测定了从河北省、黑龙江省、内蒙古自治区、贵州省和四川省未使用过缬菌胺的地区采集分离的105个致病疫霉菌株对缬菌胺的敏感性；为明确致病疫霉对缬菌胺产生抗性突变体的难易程度，进行了紫外诱导和药剂驯化试验；为明确缬菌胺与常用药剂之间的交互抗性，测定了8个抗缬菌胺突变体及其6个亲本敏感菌株对6种常用杀菌剂的敏感性。结果表明:105株致病疫霉对缬菌胺的EC₅₀值范围为0.0594~0.159 mg/L，平均EC₅₀值为(0.102 ± 0.024) mg/L，不同敏感性菌株的频率呈连续单峰曲线分布，未发现敏感性下降的亚群体，因此可将缬菌胺对105株致病疫霉的平均EC₅₀值作为致病疫霉对缬菌胺的敏感基线；通过紫外诱变敏感菌株菌丝体获得了4个抗缬菌胺的突变体，其抗性水平介于 3.1~14.9倍之间，突变频率为0.54%，通过紫外照射敏感菌株孢子囊悬浮液获得了2个抗性水平分别为8.1倍和8.2倍的抗性突变体，突变频率为1.33 × 10?7；通过在含缬菌胺的黑麦蔗糖琼脂培养基上继代培养敏感菌株11代，获得2个抗性水平分别为3.1倍和9.4倍的抗性突变体。缬菌胺与烯酰吗啉和双炔酰菌胺存在交互抗性，与氟吡菌胺、嘧菌酯、甲霜灵和霜脲氰不存在交互抗性。初步推测致病疫霉对缬菌胺具有低到中等抗性风险，建议在生产上将缬菌胺与其他类型杀菌剂交替或混合使用，以延缓致病疫霉对缬菌胺抗性的产生。     

重庆地区辣椒疫霉对氟吡菌胺的敏感性及抗性突变体的生物学性状

为明确重庆地区辣椒疫霉对氟吡菌胺的抗性风险，采用菌丝生长速率法测定了采自重庆未使用过氟吡菌胺地区的110株辣椒疫霉菌株对氟吡菌胺的敏感性，并对辣椒疫霉抗氟吡菌胺突变体的诱导方法及抗性突变体的主要生物学性状进行了研究。结果表明:110株辣椒疫霉对氟吡菌胺的EC₅₀平均值为(0.32 ± 0.11) μg/mL，不同菌株的敏感性频率呈连续单峰曲线分布，未出现敏感性明显下降的亚群体，因此可将该EC₅₀平均值作为重庆地区辣椒疫霉对氟吡菌胺田间抗性监测的敏感基线。通过紫外诱导菌丝体的方法，共获得3株可稳定遗传的抗氟吡菌胺突变体，抗性倍数介于69.5~98.5之间，突变频率为0.86%；抗性突变体BS11-5-1与亲本菌株BS11-5在菌丝生长速率、温度适应性、产孢子囊能力及致病力方面均无显著差异，而抗性突变体JLP11-4-2和JLP11-4-3在菌丝生长速率、温度适应性、产孢子囊能力及致病力方面均显著低于亲本菌株JLP11-4；不同抗性突变体对渗透压的敏感性与亲本菌株之间均存在不同程度差异；3个抗性突变体对Biolog PM1中95种碳源的利用情况与亲本菌株基本相似。交互抗性测定表明，辣椒疫霉抗氟吡菌胺突变体对甲霜灵、霜脲氰、烯酰吗啉、丁吡吗啉及嘧菌酯之间均不存在交互抗性，建议可将氟吡菌胺与上述几种杀菌剂交替或混合使用。     

辣椒疫霉对双炔酰菌胺的敏感性测定及其 抗药突变体生物学性状研究

研究了辣椒疫霉对双炔酰菌胺的敏感性及其抗药性风险。采用菌丝生长速率法测定了分别采自河北定兴、藁城和山东寿光、青州等地的173株辣椒疫霉菌株对双炔酰菌胺的敏感性,结果表明,其EC50值介于0.002 7~0.049 9 μ g/mL之间,平均EC50值为0.021 9±0.010 2 μ g/mL,敏感性呈单峰曲线分布;采用紫外诱导+菌落角变和药剂驯化的方法分别处理10个供试菌株,各获得7株和1株突变体,其抗性倍数在41.50~394 437.77之间,突变频率分别为1.46%和1.43%。对突变体部分生物学性状的研究表明,抗性突变体与其亲本菌株在菌丝生长速率、致病性、产孢能力、适合度指数和竞争力方面均具有不同程度的差异;抗性突变体DX 2-3 20m和DX 2-3 F7的产孢量、适合度和竞争力均高于亲本菌株,有利于抗性群体的形成。研究表明,辣椒疫霉对双炔酰菌胺存在中等抗性风险。     

葡萄霜霉菌对仿生杀菌剂缬霉威的敏感基线及其抗性突变体生物学性状的研究

 本文对葡萄霜霉菌对缬霉威的抗性风险评估进行了研究。采集尚未使用过缬霉威的105个葡萄霜霉菌株,建立其对缬霉威的敏感基线。葡萄霜霉菌对缬霉威的有效抑制中浓度EC₅₀为0.04～0.60 μg·mL^-1,其敏感性频率符合正态分布,表明这105株葡萄霜霉菌对缬霉威均表现敏感。取其中10株敏感菌的孢子囊经紫外线(UV)诱导,获得4个缬霉威抗性突变体,突变频率为6.8×10^-7。将这10株葡萄霜霉菌孢子囊在叶片上进行缬霉威药剂驯化处理获得7个抗性突变体。11个抗性突变体的EC₅₀值为4.37～14.11 μg·mL^-1,抗性水平17.4～71.6。在未用药处理的健康葡萄叶片上继代培养10代后,这11个抗性突变体抗性水平保持在17.1～71.0。其中药剂驯化获得的7个抗性突变体和1个紫外诱导获得的抗性突变体的抗性水平均表现稳定遗传。但是,其余3个紫外诱导获得的抗性突变体抗性水平明显下降。与各亲本菌株进行比较,11个抗性突变体的潜育期、侵染率、病斑扩展速度和产孢能力都有显著不同。其中2个药剂驯化获得的抗性突变体和3个紫外诱导获得的抗性突变体表现潜育期变长,2个药剂驯化抗性突变体和1个紫外诱导抗性突变体表现侵染率下降。表明在一些情况下,葡萄霜霉菌抗性突变体的潜伏期和侵染率会发生改变。药剂驯化获得的抗性突变体产孢能力存在显著差异,但与抗性突变与否无关。缬霉威与嘧菌酯、甲霜灵、烯酰吗啉和霜脲氰之间无交互抗药性。推测:葡萄霜霉菌对缬霉威为中到高等抗性风险,今后应定期对葡萄霜霉菌对缬霉威的抗性发生动态进行监测。     

辣椒疫霉对双炔酰菌胺敏感性及对其它杀菌剂的交互抗性

采用菌丝生长速率法测定了不同地区115个辣椒疫霉菌株对双炔酰菌胺的敏感性,同时测定了紫外诱导和药剂驯化的10个抗性突变体及其4个亲本菌株对双炔酰菌胺、烯酰吗啉、甲霜灵、嘧菌酯和霜脲氰的敏感性。山东青州、寿光和河北定兴、藁城4地辣椒疫霉菌株均对双炔酰菌胺较敏感,且敏感性差异不显著。不同抗性水平菌株对5种药剂的敏感性测定和相关性分析结果显示,双炔酰菌胺与其它几类药剂之间均不存在交互抗性。10个抗性突变体继代培养11代后,8个抗性突变体抗药性不能稳定遗传;2个抗性突变体抗药性不仅能够稳定遗传,且EC₅₀值维持在很高水平,分别为1 429.524 μg/mL和6 872.476 μg/mL,因此,双炔酰菌胺的连续使用有利于抗药群体的发展。     

番茄叶霉病菌对嘧菌酯的抗性检测及抗性风险评估

利用孢子萌发法测定了从河北、浙江、江苏、山东、四川等省田间采集的97个番茄叶霉病菌菌株对嘧菌酯的敏感性。结果表明,田间番茄叶霉病菌已对嘧菌酯产生不同程度的抗药性。97个菌株可分为敏感菌株(EC50值50值5.4~54 μg/mL),中抗菌株(EC50值54~270 μg/mL)、高抗菌株(EC50值270~1 350 μg/mL)、特高抗菌株(EC50值>1 350 μg/mL) 5种类型,分别占55.67%、14.43%、11.34%、10.31%和8.25%。其中从未用过甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的27个菌株的EC50平均值为(0.544±0.349) μg/mL,可作为敏感基残;高抗和特高抗菌株集中在常施用甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的河北定州。通过紫外线诱导和药剂驯化的方法获得了番茄叶霉病菌5个抗嘧菌酯突变体,其抗药性不稳定,在不含药PDA平板上继代培养后抗药性水平下降,甚至恢复至敏感状态;除突变体cf 21M1的产孢量高于其亲本外,抗药性突变体的菌落生长速率、产孢量、孢子萌发率均显著低于其亲本菌株,所有抗嘧菌酯突变体及其亲本菌株接种于番茄离体叶片后,突变体病情指数与亲本菌株之间没有显著差异。嘧菌酯与多菌灵、苯醚甲环唑之间不存在交互抗药性。田间抗药性检测及室内抗药性风险评估结果表明,番茄叶霉病菌对嘧菌酯具有较高的抗药性风险。     

黄瓜霜霉病菌对双炔酰菌胺的敏感基线及其抗性突变体生物学性状研究

为建立黄瓜霜霉病菌对双炔酰菌胺的敏感基线及评估其抗性风险,采用叶盘漂浮法测定了采自河北、山东未使用过羧酸酰胺类(CAAs)药剂地区的69株黄瓜霜霉病菌(Pseudoperonospora cubensis)对双炔酰菌胺的敏感性,并对黄瓜霜霉病菌抗双炔酰菌胺突变体的获得方法及突变体的生物学性状进行了研究。结果表明:69株黄瓜霜霉病菌对双炔酰菌胺的平均EC50值为(0.358±0.144)μg/mL,不同敏感性菌株的频率呈连续单峰曲线分布,未发现敏感性下降的亚群体,因此可将其作为黄瓜霜霉病菌对双炔酰菌胺的敏感基线;通过药剂驯化的方法未获得黄瓜霜霉病菌抗双炔酰菌胺的突变体;而通过紫外诱导的方法获得了6个抗双炔酰菌胺的突变体,其抗性水平介于5.74~22.96倍之间,突变频率为1.09×10-7,适合度显著低于其亲本菌株,且抗药性不能稳定遗传;双炔酰菌胺与甲霜灵、嘧菌酯、霜脲氰、氟吡菌胺之间无交互抗性关系,与烯酰吗啉之间有交互抗性关系。据此推测黄瓜霜霉病菌对双炔酰菌胺的抗性风险为低到中等。     

江西省番茄绵疫病菌对嘧菌酯的敏感性检测及抗性风险分析

为明确番茄绵疫病菌对嘧菌酯的敏感性，采用菌丝生长速率法测定了2018—2019年从江西省番茄主产区采集分离得到的58株绵疫病菌Phytophthora capsici对嘧菌酯的敏感性，并以敏感菌株YD5为亲本，通过紫外线诱导获得了4株抗性突变体，研究了突变体的生物学性状；进而采用菌丝生长速率法测定了敏感菌株YD5及其4个抗性突变体对烯酰吗啉和甲霜灵的EC₅₀值，分析嘧菌酯与烯酰吗啉和甲霜灵是否存在交互抗性。结果表明:嘧菌酯对绵疫病菌菌丝生长有较强的抑制作用，其对58个绵疫病菌的EC₅₀值介于0.1867~1.6239 μg/mL之间，平均EC₅₀值为 (0.8606±0.3318) μg/mL，58个菌株对嘧菌酯的敏感性频率分布呈正态分布，表明番茄绵疫病菌对嘧菌酯仍然较为敏感。通过紫外线诱导获得4个抗性突变体，突变体的抗药性能够稳定遗传，且在致病力与游动孢子萌发率方面与亲本菌株无显著差异，产孢量较亲本菌株显著下降。嘧菌酯与烯酰吗啉和甲霜灵之间均不存在交互抗药性。研究表明，番茄绵疫病菌对嘧菌酯具有中等抗性风险，一旦田间出现抗性菌株，应立即采取措施控制菌群的转移扩散。同时，需加强番茄绵疫病菌对嘧菌酯的田间抗性监测，在生产过程中轮用或混用不同作用机制的药剂，以避免或延缓抗药性的发展。     

辣椒疫霉对烯酰吗啉的敏感性基线及室内抗药突变体研究

 采用菌丝生长速率法测定了125株采自河北、内蒙古、陕西、安徽和北京等地区的辣椒疫霉病菌对烯酰吗啉的敏感性,结果表明,其EC₅₀值分布于0.126~0.318μg/mL之间,最不敏感菌株是最敏感菌株的2.5倍,平均EC₅₀=(0.218±0.0368)μg/mL。125个菌株对烯酰吗啉的敏感性分布呈单峰曲线,未出现抗性的病原菌亚群体,可将该单峰曲线作为辣椒疫霉对烯酰吗啉的敏感性基线,将烯酰吗啉对该病原群体的平均EC₅₀值作为田间抗药性监测的参考标准。通过紫外诱变敏感菌株N-7的菌丝获得了12株抗烯酰吗啉的突变体,抗性指数在16.38~132.15之间;通过紫外诱变敏感菌株DZ-16的游动孢子获得1株抗性指数为680倍的高抗药水平的突变体。突变体的部分生物学性状研究表明,其致病力与敏感菌株相当;大部分突变体产生孢子囊的能力与亲本菌株相比均有不同程度的提高;离体条件下,突变体和亲本菌株释放游动孢子的能力相当;突变体的菌丝生长速率与亲本菌株相比具有不同程度的差异。测定了敏感亲本菌株和突变体的交配型,均为A1型菌株,经紫外诱变后交配型没有发生改变。综合分析表明,抗性突变体的产生有利于抗药性群体的发展。为避免和延缓抗药性的产生,生产上应将烯酰吗啉与其它无交互抗药性的杀菌剂交替使用。     

掘氏疫霉抗土菌灵突变体的诱导及其特性研究

掘氏疫霉Phytophthora drechsleri是引起黄瓜疫病的主要病原菌。采用紫外线诱导获得了20株掘氏疫霉抗土菌灵的突变体,并对其生物学特性进行了研究。结果表明,掘氏疫霉对土菌灵 的抗性突变频率高于对甲霜灵的抗性突变频率,但其抗性水平低于抗甲霜灵突变体,在1.3~4.3倍 之间;掘氏疫霉对土菌灵的抗性在继代培养和常温保存过程中稳定,突变体的生长速率与亲本敏感 菌株相比发生了不同程度的变化;此外,掘氏疫霉抗土菌灵突变体对甲霜灵和烯酰吗啉无交互抗性。     

马铃薯晚疫病菌对烯酰吗啉的敏感性基线及其室内抗药突变体的研究

 2003-2004年在内蒙古和黑龙江省共分离获得100株马铃薯晚疫病菌,并测定了这些菌株对烯酰吗啉和甲霜灵的敏感性。结果表明,不同地区、不同年份的马铃薯晚疫病菌对烯酰吗啉的敏感性无显著差异,其敏感性呈连续的单峰曲线分布,EC₅₀在0.0631-0.2206μg/mL之间,最不敏感菌株是最敏感菌株的3.1倍,平均为(0.1153±0.0308)μg/mL,未出现敏感性下降的抗药性亚群体,因此可作为马铃薯晚疫病菌对烯酰吗啉的敏感性基线;64%的供试菌株对甲霜灵的敏感性下降,甲霜灵与烯酰吗啉之间不存在交互抗药性。采用紫外线诱变菌丝的方法仅从3个菌株中的1个菌株获得了3%突变频率的抗烯酰吗啉突变体,抗性倍数为1.5-1.9,没有获得高抗药水平的突变体。这些突变体与氟吗啉之间具有正交互抗药性,而与霜脲氰或嘧菌酯之间无交互抗药性;与野生亲本菌株相比,抗药突变体的生长速率和产孢子囊能力显著下降,不利于抗药群体的发展。但由于马铃薯晚疫病菌被杀菌剂抗性行动委员会认为是高抗药性风险病原菌,建议生产上应将烯酰吗啉与其它无交互抗性的药剂交替使用或混合使用,以避免或延缓抗药性的产生。     

同宗配合的马铃薯晚疫病菌曾在中国被发现

 在1964年分离的84株菌中,有一株从甘肃岷县隆安洋芋马铃薯病薯上分离到的晚疫病菌,不经交配即能在纯培养上长出具有典型的围生雄器和藏卵器的卵孢子。经单孢子囊或单游动孢子分离都证明这一特性能保持下来,说明该菌是同宗配合交配型。致病性试验也证明是标准的晚疫病菌。由此可见,马铃薯晚疫病菌除异宗配合外还存在同宗配合形成卵孢子的这一条途径,虽不普遍但不应忽视。     

RxLR效应因子Avr3a、Avr4和IPI-O在中国致病疫霉菌株中的组成

 由致病疫霉(Phytophthora infestans)引起的马铃薯和番茄的晚疫病是一种世界范围内的重要病害。在致病疫霉与寄主的互作过程中,效应因子对于病原物能否成功入侵与定殖起到了关键作用。本研究检测了来自中国马铃薯主产区的37株致病疫霉菌中编码Avr3a, Avr4和IPI-O三种效应因子的基因组成,研究发现来自国内的所有供试菌株中只有1株分离自马铃薯的和2株分离自番茄的致病疫霉含有无毒基因Avr3a(编码Avr3a^KI),其余菌株均含有avr3a(编码Avr3a^EM);所有菌株中都仅含有编码截断蛋白的avr4;从37株国内菌株中共检测到了25种ipiO变异型,其中20种为新变异型,聚类分析的结果表明这些变异型仍属于已报道的三类ipiO,而且大部分ipiO变异型为无毒型,可以被抗性基因Rpi-blb1识别。该研究结果表明avr3a和avr4普遍存在于中国致病疫霉菌株中,推测大部分菌株可以克服R3a和R4抗性基因;而ipiO的无毒变异型仍然普遍存在于国内致病疫霉群体中,可以被马铃薯含有的抗性基因Rpi-blb1识别。     

RXLR类效应分子PITG_21645.2的基因序列分析及功能验证

 马铃薯晚疫病黑龙江菌株效应分子PITG_21645.2在本氏烟(Nicotiana benthamiana)上可以抑制由INF1引起的过敏性细胞坏死(Hypersensitive response, HR)。为验证其为致病疫霉致病的重要效应分子,克隆了10个致病疫霉菌株以及3个同属卵菌菌株中的PITG_21645.2同源基因,它们在氨基酸序列上相似度为93%~100%。与INF1共表达的结果显示,仅有PITG_21645.2^MP903丧失了抑制HR的功能。其中PITG_21645.2^MP903的第31位氨基酸存在特异性,编码丝氨酸,其余同源基因在该位点均编码天冬酰胺。PITG_21645.2^MP903回复突变体(S31N)能够恢复该基因抑制INF1引起HR的功能,说明第31位氨基酸是影响抑制功能的关键位点。另外,PITG_21645.2还能抑制BAX、大豆疫霉PsojNIP和效应分子Avh238在本氏烟上激发的HR,而PITG_21645.2^MP903都丧失抑制功能。本氏烟上表达PITG_21645.2能够促进致病疫霉在寄主上的定殖,从而提示PITG_21645.2在致病疫霉的侵染中发挥致病性功能。     

利用酵母双杂交筛选与致病疫霉菌效应蛋白PITG_07586互作的寄主蛋白

 致病疫霉是引起马铃薯晚疫病的病原菌,其分泌的效应蛋白是侵染寄主的重要毒力因子。本研究在致病疫霉转录组中筛选到一个侵染早期表达的效应蛋白基因PITG_07586(GenBank:XM_002904522.1)。该基因全长447 bp,其编码蛋白包含1个信号肽,1个核定位信号序列(RRRRKRRKKKK)。在本氏烟草中,瞬时表达该基因显著促进病原菌侵染。亚细胞定位表明GFP-PITG_07586定位在细胞核中。利用酵母双杂交技术并以PITG_07586为诱饵筛选马铃薯cDNA文库,最终获得3个靶标蛋白。经序列比对分析,这3个靶标蛋白分别是马铃薯POM30蛋白、电压依赖阴离子通道蛋白VDAC以及SRC2类蛋白。研究结果为致病疫霉菌效应蛋白PITG_07586及其靶标蛋白如何调控植物免疫提供重要依据。     

Sensitivity of Phytophthora infestans to flumorph: in vitro determination of baseline sensitivity and the risk of resistance

The sensitivity of 127 Phytophthora infestans isolates to flumorph was determined in 2003 and 2004. The isolates originated from two geographical regions and showed similar levels of sensitivity in both years. Baseline sensitivities were distributed as a unimodal curve with EC₅₀ values for growth of mycelia ranging from 0·1016 to 0·3228  µ g mL⁻¹, with a mean of 0·1813 (± 0·0405) µ g mL⁻¹. There was no cross-resistance between flumorph and metalaxyl. Laboratory studies were conducted to evaluate the risk of P. infestans developing resistance to flumorph. Mutants resistant to metalaxyl or flumorph were obtained by treating mycelium of wild-type isolates with ultraviolet radiation. Metalaxyl-resistant mutants were obtained with a high frequency and exhibited resistance factor values (EC₅₀ resistant/EC₅₀ sensitive phenotypes) of more than 100, while flumorph-resistant mutants were obtained at much lower frequencies and had very small resistance factors (1·5–3·2). There was cross-resistance between flumorph and dimethomorph, but not with azoxystrobin or cymoxanil. Most flumorph-resistant mutants showed decreases in hyphal growth in vitro and in sporulation both in vitro and on detached leaf tissues. These studies suggested that the risk of resistance developing was much lower for flumorph than metalaxyl. However, as P. infestans is a high-risk pathogen, appropriate precautions against resistance development should be taken.     

四倍体马铃薯SSR遗传图谱的构建及晚疫病抗性QTL初步定位

利用四倍体马铃薯栽培种‘大西洋'和‘陇薯6号'杂交得到的190个F_1株系为作图群体,构建了四倍体马铃薯的分子遗传图谱,采用区间作图法对马铃薯晚疫病抗性进行了QTL初步定位。结果显示:通过对190个F_1株系进行检测,共发现有7个与晚疫病抗性相关的QTL位点,分别分布在第5、6、7、10和11连锁群上;各位点的LOD值在2.70~10.32之间,其中主效QTL位点3个(LOD≥3.5),可解释17.37%~65.68%的表型变异。获得紧密连锁的特异标记(S183-210、S148-460)为进一步进行QTL精确定位提供了参考。