两种拟南芥MYB51突变体的鉴定与初步分析

拟南芥MYB51(AT1G18570)转录因子是吲哚族芥子油苷合成的正向调控因子。研究组从拟南芥生物资源中心(Arabidopsis Biological Resource Center,Ohio State University,USA)购买AT1G18570的两种T-DNA插入突变体SALK_045103和SALK_059771,分别通过基因型分析筛选得到纯合突变体。半定量RT-PCR分析结果表明,两种突变体中MYB51基因的表达量极低。高效液相色谱检测结果表明,两种突变体中吲哚族芥子油苷含量与野生型相比均显著降低。由此可知,SALK_045103和SALK_059771突变体中MYB51转录因子的功能显著降低,为进一步探讨拟南芥MYB51转录因子在环境因子调控吲哚族芥子油苷合成过程中的作用奠定了材料基础。     

拟南芥AtBT4对灰葡萄孢的抗性机制分析

【目的】揭示AtBT4在拟南芥抗灰葡萄孢中与SA、JA信号途经的相互关系。【方法】利用RT-PCR技术,检测用SA、SA类似物BTH、JA、ACC及灰葡萄孢处理拟南芥野生型Col-0后其AtBT4的表达情况;检测经SA和JA处理后拟南芥SA、JA途径相关突变体AtBT4的表达情况;并检测接种灰葡萄孢后拟南芥野生型Col-0、bt4突变体和回复突变体抗病相关基因的表达情况。【结果】JA处理和接种灰葡萄孢后,拟南芥野生型Col-0中AtBT4的表达明显增强。但经JA处理后,JA不敏感突变体jar1的AtBT4表达变化趋势与野生型明显不同,AtBT4的表达水平不受JA诱导。SA信号途径相关突变体eds5、sid2和npr1中AtBT4的表达明显低于野生型,但变化趋势与野生型基本一致。bt4突变体中抗病相关基因PR1、PR4、PDF1.2和BIK1的表达明显低于野生型和回复突变体。【结论】AtBT4的表达受JA和灰葡萄孢的诱导,AtBT4突变影响抗病相关基因PR1、PR4、PDF1.2和BIK1的表达,AtBT4可能通过SA、JA信号途径影响拟南芥对灰葡萄孢的抗性。     

拟南芥两个MYB基因标签融合蛋白转基因植株的获得和鉴定

[目的]进行染色体免疫共沉淀（ChIP）试验,挖掘MYB类基因At3g11280和At5g05790所调控的下游基因。[方法]在构建了标签融合蛋白植物表达载体的基础上,利用农杆菌介导的转化将这些载体转入拟南芥植物中,获得转基因植株,并用Western blotting检测标签融合蛋白在转基因植株中的表达。[结果]拟南芥植株转基因的效率很高,4种标签蛋白融合载体的转化均获得了20株以上的转基因植株。随机对4种转基因植株的8株T1代植株进行Western blotting分析,结果表明4,种转基因植株中均鉴定出阳性植株。融合蛋白的条带大小在30 kD左右,将显色信号条带与Marker比对,显示条带大小与预测蛋白大小相符。[结论]这些有融合蛋白表达的转基因植株为ChIP试验的进行提供了重要材料。     

拟南芥T1N6_22在抵抗Pst DC3000侵染过程中的功能分析

【目的】明确拟南芥抗灰霉病基因T1N6_22在抗Pst DC3000过程中的功能,分析T1N6_22影响拟南芥对Pst DC3000的抗性原因。【方法】对t1n6_22突变体和转基因回复突变体（t1n6_22/T1N6_22）接种Pst DC3000,检测其症状;采用间苯胺蓝染色法检测接种突变体中胼胝质的积累情况;测定接种叶片中Pst DC3000的生长量,明确T1N6_22在拟南芥抗Pst DC3000过程中的功能。利用RT-PCR技术,检测SA、JA和ET对T1N6_22表达的影响及T1N6_22对抗病防御相关基因表达的影响;利用quantitative real-time PCR技术,检测Pst DC3000对T1N6_22及抗病相关基因表达的影响,分析T1N6_22影响拟南芥对Pst DC3000的抗性原因。【结果】t1n6_22突变体接种Pst DC3000后表现明显的抗病症状,而回复突变体t1n6_22/T1N6_22和拟南芥野生型表现明显的感病症状。SA处理拟南芥野生型,T1N6_22的表达量明显增强,经JA和ACC处理,该基因的表达量无显著变化。t1n6_22突变体中,PAL、PR4、PPO、SOD和CAT的表达水平均明显高于野生型Col-0和转基因回复植株。接种Pst DC3000后,拟南芥野生型中T1N6_22及抗病相关基因PR1、PR3、PR5和PDF1.2的表达量明显增强。【结论】T1N6_22在拟南芥抗Pst DC3000过程中起负调控作用,T1N6_22的表达受SA诱导,可能主要通过调节植物的次生代谢产物的分泌影响拟南芥对Pst DC3000的抗性。     

稻平脐蠕孢的分离、鉴定及对作物的安全性

为了筛选获得可用于防治李氏禾的病原菌菌株,采用孢子形态观察和ITS1-5.8S-ITS2序列分析法对分离自云南西双版纳稻田感病李氏禾植株上的两株病原真菌菌株进行了鉴定,采用离体叶片生测法评价其除草活性,采用盆栽生测法评价其对主要作物的安全性.结果表明,两株病原真菌分别被鉴定为稻平脐蠕孢(Bipolaris oryzae)和稻平脐蠕孢有性型[Bipolaris oryzae (teleomorph:Cochliobolus miyabeanus)].稻平脐蠕孢发酵液对李氏禾的致病性最高为88.9;稻平脐蠕孢有性型发酵液配制的菌悬液对李氏禾的致病性最高为100.两个菌株对水稻、玉米、黄瓜及番茄等主要农作物安全.     

拟南芥中热胁迫相关microRNA的差异表达

对改良CTAB法、改良热酚法和Trizol法3种方法在提取拟南芥叶片的总RNA中的效果进行了比较,并利用半定量RT-PCR技术检测热胁迫相关microRNA(miRNA)的表达情况。结果表明:Trizol法提取能得到高质量的拟南芥叶片总RNA,效果优于改良CTAB法、改良热酚法;筛选的4个拟南芥miRNA的表达受到热胁迫的诱导,在38℃不同时间处理下各个miRNA的表达情况都有差异,随着处理时间的延长,其表达量均出现明显提高的情况。     

拟南芥木糖异构酶在酿酒酵母的成功表达

酿酒酵母是工业上乙醇发酵的首选目标微生物,但是不能代谢木糖等五碳糖.通过导入外源木糖异构酶基因,可以赋予酵母利用木糖的能力.但是长期的研究发现很难将细菌木糖异构酶转入酿酒酵母得到活性表达.研究成功的在酿酒酵母里表达了拟南芥木糖异构酶,其活性可达到0.51 U/(mg·protein).拟南芥木糖异构酶与成功在酵母里表达的真菌木糖异构酶相比更加耐受木糖醇抑制(Ki=13.21 mM).本研究为改善酵母利用木糖提供了新的可用的木糖异构酶.     

MYB类转录因子在植物腺毛发育中的作用研究进展

MYB类转录因子是包含MYB结构域、为高等植物中转录因子中数目最多的一类基因家族成员.该类基因广泛参与植物的代谢,生长和发育调节.本文以植物腺毛的发育模型为对象,总结了近年来MYB类转录因子在高等植物腺毛如表皮毛、根毛和棉纤维发育中的研究进展,这对了解MYB类转录因子在腺毛发育中的功能及揭示腺毛发育机理有重要意义.     

杨树MYB基因应答非生物胁迫的表达特性

MYB转录因子以其含有的保守MYB结构域为特征,是植物转录因子中数量最多的家族之一,广泛参与植物生长发育和代谢的调节。利用生物信息学分析获得222条杨树MYB基因,用实时定量PCR筛选出8条对盐胁迫有强烈应答的基因,研究其在盐、干旱、ABA等非生物胁迫下的表达模式;结果表明:这8条MYB基因虽然在杨树根、茎、叶组织中均有表达,但是在不同胁迫条件和不同组织中的表达水平明显不同。在盐和干旱胁迫条件下,8个基因在根、茎、叶中均被诱导表达,表现为相似的表达模式。在ABA处理条件下,而多数基因无明显应答。说明杨树MYB基因在应答环境变化与激素调节中具有不同的作用,并且在不同组织中的作用有所差异。     

拟南芥转录因子AtMYB73转录活性区域分析及互作蛋白的筛选

【目的】确定拟南芥抗逆转录因子AtMYB73的转录活性区域并筛选获得与其互作的蛋白,为进一步阐明AtMYB73调控拟南芥抗逆的分子机制奠定基础。【方法】构建转录因子AtMYB73的酵母诱饵表达载体pAS1-AtMYB73,检测pAS1-AtMYB73的自激活性及其对酵母Y190的细胞毒性。克隆AtMYB73的N端区域（含有R2R3结构域）和C端区域（不含R2R3结构域）,检测AtMYB73的N端和C端的转录激活活性,分析AtMYB73自激活结构域的位置。利用酵母双杂交技术,以AtMYB73为诱饵筛选拟南芥的cDNA文库,将阳性克隆进行鉴定、测序;利用TAIR数据库对筛选获得的AtMYB73的候选互作蛋白进行分析。构建AtMYB73和F12F1.4的酵母双杂交载体pGBDT7-AtMYB73和pGADT7-F12F1.4,通过酵母双杂交技术,对其互作关系进行分析。【结果】含pAS1-MYB73的酵母菌在不同浓度的3-AT的SD/-His/-Trp/、SD/-Ade/-Trp培养基上均能生长,表明AtMYB73具有较高的自激活活性。含pAS1-AtMYB73的酵母菌在SD/-Trp/Amp液体培养基中培养24 h的OD₆₀₀值大于0.8,表明诱饵载体对酵母Y190没有细胞毒性。成功构建了pAS1-AtMYB73-N和pAS1-AtMYB73-C载体,获得了含有pAS1-AtMYB73-N和pAS1-AtMYB73-C的酵母;含pAS1-AtMYB73-N的酵母在含X-a-gal的YPAD培养基上呈现无色,而含pAS1-AtMYB73-C的酵母则呈现蓝色,表明AtMYB73的C端有明显的自激活性,而N端没有自激活性。以AtMYB73为诱饵,筛选拟南芥的cDNA文库,获得了与光合作用、防御反应途径、抗逆等相关的8个蛋白。利用酵母双杂交技术,确定了MYB73与F12F1.4之间存在一定的互作。【结论】拟南芥抗逆转录因子AtMYB73具有较高的转录激活活性,其活性区域位于C端;以AtMYB73为诱饵,筛选获得了与光合作用、防御反应途径、抗逆等相关的8个AtMYB73的候选互作蛋白;利用酵母双杂交技术,确定了AtMYB73与F12F1.4之间的互作关系。     

不同生态型拟南芥FLC基因的序列分析

[目的]研究拟南芥春化作用相关基因FLC的序列。[方法]对拟南芥自然群体的春化反应进行QTL分析,发现拟南芥5号染色体上有一个与开花有关的QTL,再运用序列分析确定它与FLC基因的同源性。[结果]意大利拟南芥与瑞典拟南芥在第27、461、501、638、738、884位碱基上不同。但密码子编码的第9、167、246个氨基酸由于密码子的简并性,编码的蛋白质均相同。[结论]拟南芥具有丰富的遗传多样性,由于FLC基因序列长度高度保守、碱基变异位点丰富密码子的简并性,它们均编码同一种氨基酸,对拟南芥生长没有影响。     

不同生态型拟南芥FLC基因的序列分析

[目的]对拟南芥春化作用相关基因FLC的序列分析。[方法]先期经过对拟南芥自然群体的春化反应的QTL分析,发现拟南芥5号染色体上有一个与开花有关的QTL,本实验就是运用序列分析确定它与FLC基因是否具有同源性。[结果]意大利拟南芥与瑞典拟南芥在第27位、第461位、第501位、第638位、第738位、第884位碱基上不同。虽然这些碱基有所不同,但是密码子编码出来的第9个氨基酸、第167个氨基酸、第246个氨基酸,由于密码子的简并性,编码的蛋白质均相同。[结论]拟南芥具有丰富的遗传多样性,其FLC基因序列长度高度保守、碱基变异位点丰富密码子的简并性它们均编码同一种氨基酸对拟南芥生长没有影响。这表明拟南芥的基因序列会受到环境的影响。     

拟南芥两个MYB基因标签融合蛋白植物表达载体的构建

[目的]研究MYB类基因At3g11280和At5g05790的详尽功能。[方法]利用农杆菌将标签蛋白融合的At3g11280和At5g05790基因转化拟南芥,利用转基因植株中标签蛋白的抗体进行染色体免疫共沉淀（ChIP）试验,挖掘两基因所调控的下游基因。[结果]首先扩增了At3g11280和At5g05790基因的CDS片段,随后经过一系列的亚克隆过程将两个基因和标签蛋白的融合基因片段克隆到载体pWM101上,位于35S启动子的下游,转录受35S启动子的调控。[结论]成功地构建了标签融合蛋白植物表达载体,两个基因分别携带HA和Flag标签,载体的成功构建将为ChIP试验奠定基础。     

拟南芥基因组NBS-LRR类基因家族的生物信息学分析

【研究目的】本研究对拟南芥（Arabidopsis thaliana）中含有核苷酸结合位点（Nucleotide binding site,NBS）和富含亮氨酸的重复序列（Leucine-rich repeat,LRR）类基因进行了分析。【方法】利用TAIR、Pfam网站,数据库和Chromosome Map Tool、MEGA 3.0、ClustalX软件,分析确定NBS-LRR基因及其类型、染色体物理分布、系统发育学关系。【结果】在拟南芥全基因组中共有204 个NBS-LRR 类基因,大多位于1号和5号染色体上,其中71.6%的NBS-LRR 类基因分布在基因簇内。对NBS-LRR 类基因家族进行了氨基酸多序列比对和系统进化树分析,NBS-LRR 类基因家族可分为四个亚家族。另外,NBS-LRR基因在进化过程中存在较多的复制现象。     

活性氧不敏感型拟南芥突变体的遗传特性分析

[目的]研究活性氧不敏感型拟南芥突变体的遗传特性。[方法]拟南芥种子经消毒后,在MS固体培养基上进行培养。培养5~6d后,将幼苗移栽于蛭石上继续培养。开花时,以野生型为父本,突变体为母本,进行杂交,成熟时收获得到F1代种子。将F1种子种于MS培养基上,生长5~6 d后,用10-4mol/L的H2O2处理幼苗,用根弯曲法检测植株对H2O2抗性表现,进行遗传分析。[结果]F1代幼苗,全部不抗H2O2,即根的生长受到抑制。在243个F2代植株中,有184株不抗H2O2,59株抗H2O2,不抗与抗的植株数呈现3∶1的分离。[结论]活性氧不敏感型拟南芥突变体发生了隐性单基因突变。     

拟南芥开花相关的分子调控机制的研究

植物开花是基因与环境因子协同调节的复杂过程。对于拟南芥开花的调控过程,主要分为温度途径、光周期途径、自主途径、春化途径、年龄途径和赤霉素途径六个主要途径,然后SOC1和FT等开花途径整合因子感知来自不同途径的信号,并且将信号传递给花分生组织决定基因LFY和AP1,从而完成对开花时间的精准把握和控制,最终完成拟南芥开花的整个形态建成过程。该研究就这六条主要调控机制如何调节拟南芥开花进程的机理做进一步的介绍和阐述。     

拟南芥二氧化碳突变体生理特性的分析

通过远红外成像技术,笔者获得了2个对CO2有反应的拟南芥突变体：二氧化碳敏感突变体（cdsl）和二氧化碳不敏感突变体（cdil）,通过对这2个突变体和拟南芥野生型一些生理特性的分析,探索它们之间的表型差异,以期为进一步的基因功能分析提供思路。同时对突变基因的克隆和功能分析,也会对研究在全球CO2日益增高的环境中提高作物的适应性提供一定的理论基础和研究遗传材料。     

水稻白叶枯病菌基因组简单重复序列分析

［目的］分析水稻白叶枯病菌基因组中的串联简单重复序列（simple sequence repeats,SSRs）,为其在白叶枯病菌基因组分析和遗传多样性研究提供标记信息。［方法］利用开放的基因组数据库资源,对已完成测序的3个白叶枯病菌菌株KACC10331、MAFF311018和PXO99^A进行系统的比较分析,包括基因组中SSR的结构类型、分布、丰度等;并以实例解读了在应用中可能遇到的问题。［结果］在这3个白叶枯病菌菌株的基因组中,由1～6个核苷酸为基序的SSR序列分别有940、926和1 035个;平均每隔5.26、5.34和5.06 kb的距离就有1个大于15 bp的SSR序列。在1～6个核苷酸为基序的SSR序列中,数量最多的是6碱基重复,其次分别是3、5、4、2碱基重复序列,而单碱基重复数目极少。在这3个菌株的基因组中,种类丰富、变异性高的是4、5、6个核苷酸的重复基序,但等位序列上3种菌株间的基序可能不同。［结论］3种白叶枯病菌菌株的SSR在结构类型和分布规律上均具有一定的相似性。     

拟南芥营养突变体的初步筛选

采用发芽和幼苗试验探索了筛选拟南芥抗某些抑制性物质的适宜浓度,其中2,4-D,6－BA,NaCl,AI3 ,Cu2 ,CrO4或2,4-DNP分别是10μmol．L-1,5μmol．L-1,2O0μmol．L-1,500μmol．L-1,20μmol．L-1,500μmol．L-1和18μmol．L-1。在该浓度下对经化学诱变处理获得的M2种子进行了发芽法筛选,得到了在高浓度抑制物存在时表现不同的可能突变株。     

超高效液相色谱法测定拟南芥芥子油苷

将已有的拟南芥芥子油苷高效液相色谱(HPLC)检测方法转换为超高效液相色谱(UPLC)方法,通过条件优化改进,建立拟南芥芥子油苷UPLC检测方法。该方法采用Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(50 mm×2.1 mm,1.8μm),以超纯水和甲醇为流动相进行梯度洗脱,流速为0.40 mL·min-1,检测波长229 nm,进样量5μL,内标为苯甲基芥子油苷。利用此方法测得样品的日内和日间精密度均小于9.62%,用此方法与HPLC法测定生长10周的拟南芥莲座叶中各种芥子油苷组分含量一致。方法简单、快速、准确,适用于拟南芥芥子油苷组分及含量的分析。