过表达TwHMGR和TwDXR基因对雷公藤萜类次生代谢产物的影响

3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase,HMGR)和1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase,DXR)分别被认为是植物萜类合成途径:甲羟戊酸(mevalonate,MVA)和2-甲基赤藓醇4-磷酸(2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate,MEP)途径的关键酶,这两个酶的基因表达水平将会直接影响到植物萜类物质的合成。本研究通过构建TwHMGR(KU246037.1)和TwDXR(KJ174341.1)基因的过表达载体,借助发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)整合到雷公藤(Tripterygium wilfordii)基因组中,分别筛选得到三株转基因发状根系。qRT-PCR分析结果表明,转基因发状根系中目的基因TwHMGR和TwDXR的表达量均明显高于对照,最高可分别达到对照的4.73倍和5.81倍。高效液相色谱(high-performance liquid chromatography,HPLC)法测定结果显示,转TwHMGR基因和TwDXR基因的发状根雷公藤内酯醇、雷公藤吉碱和雷公藤次碱的含量均明显高于对照,结果表明,提高雷公藤TwHMGR基因和TwDXR基因的表达量,可以提高雷公藤萜类次生代谢产物的产量。研究结果为进一步利用代谢工程手段调控雷公藤活性物质的生物合成以及为研究雷公藤萜类物质的生物合成途径奠定基础。     

拟南芥5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶基因(EPSPS)的定点突变及抗草甘膦转基因拟南芥获得

目前商业化种植的抗草甘膦转基因作物中使用的基因主要是来自土壤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)CP4和大肠杆菌(Escherichia coli)的5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶(5-enolpyruvyshikimate-3-phosphate synthase,EPSPS)基因,抗性基因资源过于狭窄,有必要拓宽可用基因种类。本研究通过PCR方法克隆了拟南芥(Arabidopsis thaliana)EPSPS基因,对其进行定点突变,并将野生型基因(AtEPSPS)和突变基因(AtTIPS)分别转化EPSPS基因缺陷型大肠杆菌菌株ER2799。草甘膦抗性鉴定结果表明,含AtTIPS基因的重组菌株在20 mmol/L草甘膦胁迫条件下长势良好(P0.01),而含AtEPSPS基因的重组菌株在5 mmol/L的草甘膦胁迫条件下即受明显抑制(P0.01)。同时将两个基因分别构建到植物表达载体中,并转化野生型拟南芥。对T1代转基因植株进行PCR验证和转录水平分析,证明外源基因已整合到拟南芥基因组中并正常表达。对转基因拟南芥进行草甘膦抗性分析结果表明,在0.5 mmol/L草甘膦处理下,转AtTIPS基因拟南芥相比转AtEPSPS拟南芥有更高的植株鲜重和存活率(P0.05),表明转AtTIPS基因拟南芥有更高的草甘膦抗性。以上结果表明AtTIPS具有较高的草甘膦抗性能力,可以用于抗草甘膦转基因作物的培育。     

洋甘菊细胞色素P450还原酶基因(CPR)的分子克隆及表达分析

细胞色素P450还原酶(cytochrome P450 reductase,CPR)是生物体内氧化系统中的电子供体,在细胞色素P450介导的氧化还原反应中起限速作用,是氧化反应中的关键酶。本研究根据已经报道的其他植物的CPR基因设计简并引物,并在洋甘菊(Matricaria recutita L.)中克隆CPR基因的部分片段,然后通过RACE扩增得到CPR基因全长。结果表明,克隆得到洋甘菊的CPR基因,提交至GenBank,得到登录号KJ004519,其cDNA全长2 272 bp,包含2 106 bp的编码区,翻译701个氨基酸序列;生物信息学分析表明,洋甘菊与青蒿(Artemisia annua)的亲缘关系最近,CPR基因氨基酸序列有94%的相似性,CPR蛋白质结构包括结合P450结构域和辅因子黄素腺嘌呤二核甘酸(flavin adenine dinucleotide,FAD)和黄素单核甘酸(flavin mononucleotide,FAM)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADP)结构域;通过qRT-PCR检测CPR基因在洋甘菊开花阶段舌状花冠、管状花冠、茎和叶中的表达量,结果表明,CPR mRNA转录本积累量在管状花冠中表达量最高,是叶中表达量的20多倍,在舌状花冠和茎中有微量表达量。本研究首次克隆了洋甘菊中CPR基因,CPR基因是植物萜类的氧化修饰过程中关键酶,为进一步研究细胞色素P450氧化酶系在洋甘菊中萜类的生物合成途径中的具体作用提供了基础资料。     

鹅3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGR)基因内含子5的SNP及其与鹅重要经济性状的关联性

屠宰测定了116只皖西白鹅(Anser anser)杂种一代鹅(母本为四川白鹅(A.anser))的胴体性状、羽绒性状和肉质性状,克隆了鹅3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGR)基因内含子5,PCR-SSCP检测其SNP,并分析了SNP与鹅重要经济性状之间的关联性。结果显示,鹅HMGR基因内含子5长704bp,与鸡的同源性44.0%;PCR-SSCP检测发现,内含子5存在1个SNP位点,带有1对等位基因A和B,其基因频率分别为0.7716和0.2284。分析不同基因型与性状的关联性表明,AA型对提高鹅胸肌重和腺胃重(P<0.05),增加胸肌纤维直径和羽绒的千朵重(P<0.01),以及降低胸肌45pH和绒系水率(P<0.05)具有显著的遗传效应;AB型的遗传效应则与AA型相反。     

浙贝母HMGR基因保守区序列的克隆及生物信息学分析

3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)是甲羟戊酸途径中的第一个限速酶,在植物生物碱类物质代谢过程中发挥重要的作用。为探究HMGR酶在浙贝母甾体类生物碱合成代谢途径中的调控作用,以百合科浙贝母狭叶品种为材料,利用RT-PCR技术和Ta克隆技术首次从浙贝母中克隆出HMGR基因保守区序列,长度为390 bp。序列分析表明,浙贝母HMGR基因保守区序列与其他9种植物的HMGR基因有较高的相似性(84%~79%);蛋白质同源比对、特征区及系统进化树分析表明,浙贝母HMGR氨基酸片段与其他植物有较高的同源性(95%~88%),与球药隔重楼和海枣等单子叶植物的亲缘关系较近,据此,初步确定该基因为浙贝母HMGR基因,命名为Ft HMGR。Ft HMGR基因的克隆及分子鉴定为进一步解析该基因在浙贝母甾体类生物碱合成代谢途径中的分子调控作用奠定了基础,有助于对浙贝母活性物质的合成进行调控,从而提高产量。     

茶树海藻糖-6-磷酸合成酶基因(CsTPS)的克隆及表达分析

海藻糖-6-磷酸合成酶(trehalose-6-phosphate synthase,TPS)是海藻糖合成途径中的一个关键酶.目前,TPS基因的研究多数集中于细菌和真菌等,而对植物的研究较少.本实验通过对茶树(Camellia sinensis(L.)O.Kuntze)全器官转录组文库序列比对,获得一条与其他物种同源性较高的编码TPS基因的EST序列,通过RACE扩增后获得茶树TPS基因cDNA全长序列,命名为Cs TPS(GenBank登录号JQ742017).该基因cDNA全长3 125 bp,包含一个2799 bp的开放阅读框,编码932个氨基酸.多序列比对分析结果表明,Cs TPS基因编码的蛋白具有明显的TPS和TPP两个结构域.系统进化分析表明,其编码的氨基酸序列与拟南芥(Arabidopsis thaliana)、烟草(Nicotiana tabacum)和番茄(Solanum lycopersicum)等植物的TPS同源性较高,且CsTPS与拟南芥TPS1(AtTPS1)的同源性高于TPS2(AtTPS2)和TPS3(AtTPS3).qPCR分析显示,CsTPS基因在茶树不同组织器官中呈现差异性表达.低温诱导促使老叶和嫩叶中的CsTPS基因上调程度明显大于根系,表明CsTPS基因可能参与了茶树抗寒机制.     

三种植物生长调节剂对刺梨果实维生素C积累及其代谢基因表达的影响

维生素C又称抗坏血酸(L-ascorbic acid,AsA),在植物生长发育、逆境响应及信号转导等过程中发挥着重要作用,其合成、积累受多种生物及非生物因子调节。为探索植物生长调节剂调控果实AsA积累的作用机制,本研究以贵农5号刺梨(Rosa roxburghii)为材料,采用离体喂饲结合田间喷施的方法研究了芸苔素内酯(brassinolide,BR)、茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)和赤霉素(gibberellin 3,GA3)3种外源生长调节剂对刺梨果实AsA积累及其相关代谢基因表达的影响。结果表明,无论是离体喂饲或田间喷施处理,外源BR均显著提高刺梨果实中AsA含量,而MeJA和GA3处理的刺梨果实AsA含量则显著低于对照,且随着时间的延长AsA含量递减。进一步的qRT-PCR分析表明,3种外源植物生长调节剂对AsA代谢基因表达的影响不尽相同。离体喂饲BR对刺梨果实中参与AsA合成途径基因(包括GDP-L-半乳糖磷酸化酶(GDP-L-galactose phosphatase,GGP),L-半乳糖-1-磷酸磷酸酶(L-galactose phosphatase,GPP),L-半乳糖脱氢酶(L-galactose dehydrogenase,GDH),L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶(L-galactono-1,4-lactone dehydrogenase,GalLDH),D-半乳糖醛酸还原酶(D-galacturonic acid reductase,GalUR)和肌醇加氧酶(Myoinositol oxygenase,MIOX))及还原过程的基因(脱氢抗坏血酸还原酶(Dehydroascorbate reductase,DHAR)和单脱氢抗坏血酸还原酶(Monodehydroascorbate reductase,MDHAR))均有不同程度的上调作用,尤其是对GGP的作用最为明显(24 h后上调约5倍),并且这种效应在田间喷施时也是一致的,表明BR可以通过上调AsA合成和还原过程从而促进刺梨果实AsA的积累。在离体条件下,GA3对GGP、GalLDH和DHAR基因的表达在24 h后有一定程度的上调,其余代谢基因均呈现出下调趋势。同时MeJA对GDP-甘露糖-3′,5′-差向异构酶(GDP-mannose-3′,5′-epimerase,GME)、GalUR和抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)等基因的表达在24 h后也有一定程度的上调作用,其余代谢基因表达不一;田间喷施验证发现GA3不仅下调合成途径基因的表达,还对分解基因抗坏血酸氧化酶(asorbate oxidase,AAO)基因具有上调作用,而MeJA处理显著抑制刺梨果实中AsA积累,对其合成途径基因的表达影响不一,且对氧化分解基因未有影响。总体上,这两种外源植物生长调节剂处理下的基因表达与AsA积累之间并未呈现明显一致的规律。本研究揭示了不同外源生长调节剂对果实AsA积累具有不同的效应,对于探索植物激素参与AsA合成或积累的调控机制提供了基础资料。     

朗德鹅3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因(HMGCS1)cDNA克隆及其mRNA在填饲鹅肝组织中表达的研究

本实验旨在获得鹅(Anser anser)3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因(HMGCS1)的cDNA序列,观察该基因的表达与填饲鹅肝脏生成胆固醇的相关性。选用填饲28 d朗德鹅作为实验材料,运用RACE方法扩增目的基因的cDNA序列,利用荧光定量PCR技术检测并分析HMGCS1基因在各组织中mRNA的表达,比较填饲28 d后各组织HMGCS1基因表达的变化,同时选用胆固醇试剂盒测定鹅肝中胆固醇的含量。结果显示,HMGCS1基因的cDNA全长为2 947 bp,开放阅读框编码522个氨基酸(GenBank登录号:KF425515)。荧光定量PCR结果显示,该基因在肝脏中表达显著高于其他组织(P0.05)。填饲28 d后,填饲组肝脏胆固醇含量低于对照组(P0.05),该基因在肝脏中的表达显著降低(P0.05)。氨基酸序列分析表明,HMGCS1基因高度保守,与鸭(Anas platyrhynchos)、鸡(Gallus gallus)、鸽子(Columba livia)等家禽同源性较高。该基因特异性地在肝组织中表达,且该基因的表达与肝脏中胆固醇合成呈正相关。本实验结果为进一步研究HMGCS1基因的功能提供了参考资料。     

桃沙红果实α-甘露糖苷酶基因(α-man)克隆及其在软化过程中的表达分析

α-甘露糖苷酶(α-man)是植物体内N聚糖加工的关键酶,在控制果实软化和延长货架期方面起重要作用.明确α-man在桃果实软化中的生理功能及其调控机制对进一步阐明桃果实的成熟软化机理具有重要意义.以商业成熟期桃(Prunus persica)沙红果实为材料,采用RT-PCR和RACE相结合的方法,克隆桃果实中α-man基因全长cDNA,并利用实时荧光PCR定量技术,检测了采后乙烯利和1-methylcyclo-propene(1-MCP)处理沙红果实软化过程中α-man基因的表达差异.结果表明:桃果实α-man基因的cDNA全长长3 491 bp,包含一个3 075 bp完整的开放阅读框,编码1 024个氨基酸(Genbank登录号:JX310861),N端含有NXT/S的糖基化位点,属糖基水解酶38家族.实时荧光PCR定量技术检测发现对照果实在贮藏第2天出现α-man的表达高峰;外源乙烯处理α-man基因表达高峰提前ld出现,且峰值显著高于对照果实;而1-MCP处理可使α-man基因的表达高峰延迟1d,且后期α-man基因的表达受到极显著抑制.据此推断桃果实α-man基因可能受乙烯生成和乙烯信号转导途径的调控,参与桃果实的软化过程.     

小麦品种小偃22干旱诱导基因及其表达分析

利用抑制消减杂交(SSH)技术构建了小麦(Triticum aestivum)品种小偃22干旱胁迫诱导基因表达的SSH-cDNA文库,从文库中随机挑选插入片段大于400 bp的阳性克隆60个进行测序,去除冗余序列和嵌合序列后,获得了31条高质量表达序列标签(EST)序列(GenBank登录号:ES466737～ES466766,ES466799).进一步采用RT-PCR对其中的胚胎形成晚期富集蛋白基因(LEA)和△1-吡咯啉-5-羧基合成酶基因(P5CS)的表达模式进行了分析.结果表明,获得的EST序列中的26条EST序列具有功能已知的同源基因,这些基因多数不仅与植物的非生物胁迫相关,也与植物的生物胁迫反应相关,表明植物在胁迫反应中有明显的交叉适应性,其中与小麦表达序列高度同源的EST占58%.24条EST序列与功能已知蛋白的同源性较高,主要涉及植物的信号传导、能量代谢、转录调控及防卫反应等.表达模式分析表明,LEA家族蛋白D9在土壤绝对含水量达到4.8%时上调表达,在萎蔫后复水2 h时表达量最高,随着复水时间延长表达量降低并趋于稳定;PSCS基因D16在渍水条件下、严重干旱胁迫下均上调表达,而在可维持生长的水分条件下和严重干旱后复水4 h后表达量急剧下降.序列分析表明,LEA蛋白基因D9与PSCS基因D16均是部分同源基因,暂命名为TaLEA-D9和TaP5CS-D16.     

雷公藤转录因子TwWRKY1基因的克隆与表达分析

雷公藤(Tripterygium wilfordii)作为传统的药用植物,其主要活性成分萜类和生物碱类在农业和医药领域有着广泛的应用。WRKY转录因子广泛参与植物的生长发育、衰老、逆境胁迫反应和次生代谢产物生物合成调控等过程。本研究利用cDNA末端快速扩增(rapid-amplification of cDNA ends,RACE)和q RT-PCR技术,从雷公藤发状根中克隆得到1个WRKY转录因子TwWRKY1(Gen Bank No.GAVZ01022264.1),该基因全长962 bp,开放阅读框为537 bp,编码178个氨基酸;生物信息学分析表明,TwWRKY1编码蛋白包含1个WRKY保守结构域,具有C2H2锌指结构,属于WRKY转录因子家族的第Ⅱ类;进化树分析结果表明,TwWRKY1与日本黄连(Coptis japonica)CjWRKY1同源性最高,具有83%的同源性。qRT-PCR技术检测TwWRKY1基因组织差异性表达表明,TwWRKY1基因在根、茎、叶中均有表达,在叶中表达丰度最高,其次是发状根、茎和不定根,自然根中最低。雷公藤发状根经茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,Me JA)诱导后,TwWRKY1基因在6 h内诱导表达,随后诱导表达减弱;水杨酸(salicylic acid,SA)在9 h内诱导变化不明显,12 h后对TwWRKY1有明显的诱导作用。高效液相色谱分析发现,雷公藤发状根中内酯醇、吉碱和次碱均响应MeJA诱导,吉碱和次碱含量变化较大,内酯醇含量变化较小,但含量的增加都呈先增后减的变化趋势,与TwWRKY1基因受Me JA诱导处理后表达量的变化一致。研究结果为深入研究该基因的分子生物学特性及其调控雷公藤次生代谢产物的生物合成提供科学依据。     

超量表达响应β-氨基丁酸诱导的StWRKY8基因提高马铃薯晚疫病抗性

晚疫病是马铃薯(Solanum tuberosum)生产中最为严重的病害,抗晚疫病是马铃薯育种的主要目标之一。前期研究中,在具有田间抗性的马铃薯材料中筛选到一个受广谱诱抗剂β-氨基丁酸(β-aminobutyric acid,BABA)诱导表达的转录因子StWRKY8基因片段。为了进一步研究该基因在马铃薯晚疫病抗性中的功能,本研究利用qRT-PCR技术进一步分析了该基因受β-氨基丁酸和晚疫病菌—卵菌致病疫霉(Phytophthora infestans)诱导表达的模式;从马铃薯中克隆了该基因cDNA,构建了35S启动子驱动的植物表达载体,通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的方法进行了马铃薯的遗传转化;对获得的超量表达转基因株系进行了离体叶片晚疫病接种抗性鉴定,同时利用qRT-PCR技术检测了StWRKY8下游植保素合成相关基因—3-羟-3-甲戊二酰辅酶A还原酶基因2(3-hydroxy-3-methylglutaryl Co A reductase 2,HMGR2)和NADP-苹果酸酶基因(NADP-malic enzyme,NADP-ME)的表达。研究结果表明,BABA和P.infestans都能诱导StWRKY8基因上调表达,BABA诱导24 h达到表达高峰,而P.infestans诱导36 h达到表达高峰。本研究克隆的StWRKY8基因编码区长1 605 bp,编码534个氨基酸,与已报道马铃薯StWRKY8(NP_001274836.1)蛋白序列相似性达到98%,含有两个WRKYGQK保守结构域。获得了StWRKY8超量表达转基因株系,晚疫病接种抗性鉴定表明,4个表达量高的转基因株系晚疫病抗性显著提高。另外,本研究结果表明,受StWRKY8调控的HMGR2和NADP-ME基因的表达量在超量表达转基因株系中并未明显提高。但是,当转基因株系受到晚疫病菌液体培养物(culture filtrate,CF)诱导时,这两个基因在转基因株系中显著上调表达。本研究结果为进一步探讨StWRKY8抗性调控机理以及利用该基因提高马铃薯晚疫病抗性提供了重要信息。     

桂花15-顺式-ζ-胡萝卜素异构酶基因(Z-ISO)的克隆及表达分析

15-顺式-ζ-胡萝卜素异构酶(15-cis-ζ-carotene isomerase,Z-ISO)可以催化9,15,9'-三顺式-ζ-胡萝卜素异构化生成9,9'-二顺式-ζ-胡萝卜素,Z-ISO基因是植物类胡萝卜素代谢途径中最后一个被鉴定的基因.为克隆桂花(Osmanthus fragrans) Z-ISO基因的ORF序列并研究其表达特征,本研究利用已构建的桂花花瓣转录组数据库中Unigene序列信息,结合PCR技术克隆得到桂花Of Z-ISO1(GenBank登录号:KX120175)和Of Z-ISO2(GenBank登录号:KX120176)基因ORF序列.生物信息学分析表明,Of Z-ISO1和OfZ-ISO2基因均含有长为1 107 bp的ORF,编码368个氨基酸残基.Of Z-ISO1和Of Z-ISO2蛋白均含有6个跨膜螺旋区和3个保守的异构酶功能作用所必需的活性位点(H152、H268和D296).Of Z-ISO1和Of-ISO2与玉米(Zea mays)和拟南芥(Arabidopsis thaliana) Z-ISO1氨基酸序列有较高的相似性,系统进化树分析发现,Of Z-ISO1和Of Z-ISO2与芝麻(Sesamum indicum)Z-ISO亲缘关系最近,聚为同一小支.qRT-PCR结果显示,堰虹桂花序发育过程中,OfZ-ISO1基因在花蕾期花序中表达量较低,铃梗期其表达量急剧增加,初开期表达量保持不变,而盛开期表达量显著下降;Of Z-ISO2基因在花蕾期和铃梗期花序中表达量较低,随后表达量逐渐增加,于盛开期表达量达到最高.在桂花不同花色品种中,丹桂品种堰虹桂花色最深、花瓣类胡萝卜、素总量最高,金桂品种金球桂次之,银桂品种玉玲珑花色最浅、花瓣类胡萝卜素总量最低;总体上铃梗期和初开期时玉玲珑Of Z-ISO1和Of Z-ISO2基因的表达量较高,盛开期3个不同花色品种花瓣中OfZ-ISO1和Ofz-ISO2基因的表达量大致相同.本研究结果表明,桂花花序开放过程中Of Z-ISO1和Of Z-ISO2基因的表达水平对其类胡萝卜素的积累十分重要,不同花色品种类胡萝卜素含量与其Of-ISO1和OfZ-ISO2基因表达量并非正相关.研究结果将为全面揭示桂花呈色机制提供理论基础.     

马铃薯腐烂茎线虫2-Cys型过氧化物还原酶基因的克隆及低剂量杀线虫剂对其表达的影响

过氧化物还原酶(Peroxiredoxins,Prx)属抗氧化蛋白超家族,其催化活性依赖于半胱氨酸的存在.在该家族成员中,2-cysteine型过氧化物还原酶(2-Cys Prx)在抵抗外源性ROS保护植物线虫表皮免受氧化性损害以及线虫生长发育方面具有重要作用.为了解低剂量杀线虫剂对2-Cys Prx基因表达的影响,本研究采用RT-PCR和RACE技术克隆了马铃薯腐烂茎线虫Ditylenchus destructor)2-Cys Prx基因,并利用Real-time PCR检测了马铃薯腐烂茎线虫经低剂量(10、1、0.1、0.01、0.001和0.0001 μg/mL)杀线虫剂甲氨基阿维菌素苯甲酸盐和涕灭威处理24 h后,2-Cys Prx基因表达量的变化.结果表明,该基因cDNA全长为784 bp,编码196个氨基酸,命名为Dd-Prx-1(GenBank登录号:JQ609353).同源性分析结果表明,Dd-Prx-1与其他线虫的2-Cys Prx具有较高的同源性.Dd-Prx-1的基因组由6个外显子和5个内含子组成.蛋白质预测N端没有明显的信号肽,但有一个含有23个亲水氨基酸的跨膜结构域.qRT-PCR分析结果表明,经低剂量甲氨基阿维菌素苯甲酸盐和涕灭威处理后,马铃薯腐烂茎线虫Dd-Prx-1基因的表达量与对照相比较无显著性差异(P＜0.05).结果为深入研究植物线虫应对低剂量杀线虫剂的机制提供了基础资料.     

克雷伯氏菌1,3-丙二醇氧化还原酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达

以基因组DNA为模板,利用PCR技术从克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)中扩增得到含有1,3-丙二醇氧化还原酶基因(dhaT)的DNA片段,将其定向连接到克隆质粒pGEM-3xf上,得到重组质粒pGEM-dhaT。将此重组质粒转化到受体菌Escherichia coli DH5α中,通过蓝白斑鉴定挑选出阳性菌株。DNA序列分析表明其基因全长为1185bp。将该片段插入表达载体pSE380,构建成重组子pSE-dhaT,并在E．coli JM109中获得表达,经SDS-PAGE检测,表达产物分子质量与天然纯1,3-丙二醇氧化还原酶(DHAT)相同,约为43ku。     

甘薯肌醇-1-磷酸合成酶基因的克隆及序列分析

甘薯(Ipomoea batatas (L.) Lam.)新品系农大603是从感茎线虫(Ditylenchus destructor)病品种徐薯18的辐照后代中获得的一个抗茎线虫病的突变体。以农大603和徐薯18块根的mRNA为模板，根据植物抗线虫病基因NBS保守氨基酸序列设计引物，进行 RT-PCR分析，发现农大603的肌醇-1-磷酸合成酶(Myo inositol-1-phosphate synthase , MIPS)基因的表达量高于徐薯18。采用3'RACE技术扩增出MIPS基因的3'末端cDNA。根据植物MIPS基因 5'端一段保守的氨基酸序列设计兼并引物，并与3'端的特异引物组合，扩增出该基因的5'端cDNA序列。DNA序列比对表明，甘薯MIPS基因与大豆(Glycine max)、番茄(Lycopersicon esculentum )的MIPS基因同源性较高，分别达83.63 %和83.89 %。甘薯MIPS基因全长cDNA的克隆，有利于进一步研究该基因与抗甘薯茎线虫病的关系。     

甘蔗抗坏血酸过氧化物酶基因(ScAPX)的克隆及表达分析

抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)是清除活性氧(reactive oxygen species,ROS)的重要酶类.本研究对针刺接种黑粉菌(Sporisorium scitamineum)后的抗、感基因型甘蔗(Saccharum officinarum)进行APX活性测定.结果表明,甘蔗接种黑穗病菌48h内,抗病品种(崖城05-179) APX活性显著高于感病品种(柳城03-182) (P＜0.05).借助电子克隆技术,结合RT-PCR方法,从甘蔗中分离到一个APX基因,并命名为ScAPX(GenBank登录号:KJ7565501).生物信息学分析显示,ScAPX基因全长l 171bp,包含一个1 038 bp的完整开放阅读框,编码345个氨基酸.ScAPX编码的蛋白不含信号肽,推测其为非分泌蛋白,定位于线粒体基质和叶绿体基质中的概率分别为91.1％和88.7％.实时荧光定量PCR检测结果显示,ScAPX在甘蔗根、芽、叶、蔗皮和蔗髓中均有表达,为组成型表达基因,表达量在蔗皮中最高,叶中最低,前者是后者的19.7倍;在外源因子处理后0～48 h,ScAPX基因的表达受水杨酸(salicylic acid,SA)、茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)、过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)、脱落酸(abscisic acid,ABA)、氯化钠(sodium chloride,NaCl)和聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)诱导,SA、MeJA和H2O2处理后的ScAPX 转录本积累量峰值较外源激素(ABA)和环境(NaCl和PEG)胁迫早.前者的ScAPX转录本变化呈现出胁迫初期积累量增加,达到峰值后又逐步下降的特点;在同样的测试时间(处理后24 h)内,ABA、NaCl和PEG处理后ScAPX转录本在达到峰值后未见下降.虽然在外源胁迫下,ScAPX表达量变化存在明显差异,但其表达均表现出正响应上述外源因子对甘蔗的胁迫.本研究为后续深入鉴定该基因的功能与进一步应用提供基础资料.     

苹果短链脱氢酶基因MdSDR响应腐烂病菌侵染的功能研究

短链脱氢/还原酶(SDR)是一类NAD(P)(H)依赖的氧化还原酶,负责催化生物体内各种代谢活动的氧化还原步骤。为了探究苹果(Malus domestica)SDR(MdSDR)蛋白的功能,利用农杆菌介导的苹果组培苗瞬时转化技术在苹果叶片中瞬时表达MdSDR,然后通过刺伤接种法研究过表达MdSDR对叶片抗病性的影响;利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测瞬时表达MdSDR后苹果中脂肪酸生物合成相关基因的表达水平;利用气相色谱分析技术检测瞬时表达MdSDR苹果叶片中的脂肪酸含量;利用尼罗红染色检测苹果叶片中的脂滴(LDs)积累情况。结果表明,瞬时表达MdSDR显著增强了苹果叶片对腐烂病菌(Valsa mali)的抗病性,试验组叶片病斑直径相比对照组减小约14.46%(P<0.001);瞬时表达MdSDR后苹果叶片中脂肪酸生物合成相关基因的表达显著上调(P<0.001),其中MdACCase上调48.41倍,MdKAR上调129.79倍,MdENR上调168.20倍,MdHAD上调8.67倍,MdβCT、MdKASⅠ和MdKASⅡ均上调约5倍;然而过表达MdSDR后苹果叶片中脂肪酸的积累水平无显著变化(P>0.05);进一步研究发现,过表达MdSDR后苹果叶片中调控脂滴合成的基因MdSEIPIN显著上调表达(P<0.05),脂滴数量大量增加。本研究初步证明MdSDR能够通过促进脂肪酸的合成,间接提高脂滴的数量,从而提高苹果的抗病性,为苹果抗性品种的研究提供了一定的理论基础。     

植物二氢黄酮醇-4-还原酶基因的研究进展

二氢黄酮醇-4-还原酶(DFR)是花青素生物合成途径中的关键酶,在花色的修饰中起重要作用,目前,已从多种植物中分离得到。从DFR基因的结构和作用机制、底物特异性、时空表达模式及花色修饰等方面进行了概括和总结,为DFR基因的进一步研究和利用提供理论依据。     

基因表达系列分析技术及其在植物抗病性研究中的应用

基因表达系列分析(SAGE)技术不仅能够全面地分析特定组织或细胞内表达的基因，还可以比较不同组织在不同时间、空间条件下基因表达的差异，从而发现新基因。SAGE技术在植物抗病性研究中的应用近几年发展很快。综述介绍了SAGE技术的原理、特点、实验方案、技术发展与演变。