快速筛选苏云金杆菌高毒力菌株的有效方法

对7株苏云金芽孢杆菌菌株进行了cry 1基因检测、晶体形态观察、晶体蛋白SDSPAGE以及杀虫活性检测。结果表明，综合菌株的PCR结果、晶体形态和晶体蛋白图谱结果可以预测其杀虫特性。根据菌株预测的杀虫特性进行有目的的生物测定，可以快速、准确地筛选到对特异害虫具高毒力的菌株。     

桂林喀斯特地貌分布区苏云金芽孢杆菌菌株的分离鉴定

从桂林喀斯特地貌分布区采集了165份天然土壤样品,从中分离出10株苏云金芽孢杆菌。光学显微镜观察发现有菱形、球形、不规则等晶体类型。通过核酸电泳比对其大质粒DNA的图谱来区分菌株的类型,发现该批菌株有良好的多样性。对这10株菌进行cry1、cry11、cry2、cry3、cry4、cry5、cry6、cry7、cry8、cry9、cry10类基因的PCR-RFLP鉴定,在8株菌中分别发现含有cry1、cry11、cry2、cry3等基因类型,而G4、G6菌株中不含有已知基因。SDS-PAGE分析了10株野生菌株的杀虫晶体蛋白表达谱,发现有10株表达约130kD蛋白,有3株既表达130kD蛋白又表达60kD蛋白。对大猿叶甲、小菜蛾进行了杀虫活性测定,发现了一株对大猿叶甲具有较高毒力的菌株G8,其LC50为48.2μg/ml,置信区间为9.6～1.4ml;有6株菌株对小菜蛾有高活性。     

苏云金芽孢杆菌BtC008杀虫晶体蛋白基因鉴定、克隆及杀虫活性分析

苏云金芽孢杆菌BtC008对棉铃虫、小菜蛾和甜菜夜蛾等鳞翅目害虫具有高毒力。本文分析了其杀虫基因类型包括cry1Ab、cry1Ca、cry1Ia、cry2Ab和一种新的cry1类基因,SDS-PAGE分析其至少2种cry1类基因获得了表达,在分子水平说明了该菌株高毒力的原因。在此基础上克隆了1种cry1Ab类杀虫晶体蛋白(insecticidalcrystalproteins,ICPs)基因,并被Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会命名为cry1Ab20。序列分析显示该基因所编码蛋白与已知的Cry1Ab13有1个氨基酸不同。将cry1Ab基因毒性片段(1.95kb)插入表达载体pET-21b,转化EscherichiacoliRosetta(DE3)菌株,表达的包涵体蛋白对小菜蛾和棉铃虫幼虫具有杀虫活性,LC50分别为100.74μg/mL和29.87μg/mL,进一步明确了Cry1Ab20蛋白的杀虫活性区。     

苏云金杆菌(Bt)芽孢的杀虫作用

本文简要综述了苏云金杆菌(Bt)芽孢的杀虫作用。讨论了Bt芽孢和晶体之间的增效作用,芽孢孢衣蛋白和晶体蛋白的同源性,芽孢孢衣蛋白的杀虫活性以及芽孢杀虫的可能机制。     

对蛴螬有活性的苏云金芽胞杆菌菌株的筛选与基因鉴定

为了寻找对地下害虫蛴螬有杀虫活性的基因资源,以实验室分离的500株苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)菌株为材料,通过杀虫活性测定筛选到43株对蛴螬有活性的菌株,其中菌株C9对3种供试昆虫均有活性.光学及扫描电镜检测发现这些菌株均释放球形晶体.SDS-PAGE分析显示这些菌株均表达约130kD的蛋白.采用3种方法分析43株菌株的杀虫晶体蛋白基因类型,结果显示:其中21株只含cry8Ca;13株同时含cry8Ca和cry8Ea基因;QC4等8株菌株只能用引物HRM8F/HRM8R获得高度保守区域约110bp的扩增产物,说明这些基因的5'端序列与已知基因差异较大.测序结果经BLAST分析显示,产物序列同cry8基因的相似性均在98%以上,但其全长基因类型还需要其它方法确定.菌株QCM的PCR-RFLF图谱不同于已发现的cry8基因,推测其中含有新基因.     

苏云金杆菌（Bt）芽孢的杀虫作用

本文简要综述了苏云金杆菌（Ｂｔ）芽孢的杀虫作用。讨论了Ｂｔ芽孢和晶体之间的增效作用，芽孢孢衣蛋白和晶体蛋白的同源性，芽孢孢衣蛋白的杀虫活性以及芽孢杀虫的可能机制。     

苏云金芽孢杆菌BtC008杀虫晶体蛋白基区鉴定、克隆及杀虫活性分析

苏云金芽孢杆菌BtC008对棉铃虫、小菜蛾和甜菜夜蛾等鳞翅目害虫具有高毒力。本文分析了其杀虫基因类型包括cry1Ab、cry1Ca、cry1Ia、crygAb和一种新的cry1类基因，SDS-PAGE分析其至少2种cry1类基因获得了表达，在分子水平说明了该菌株高毒力的原因。在此基础上克隆了1种cry1Ab类杀虫晶体蛋白（insecticidal crystal proteins，ICPs）基因，并被Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会命名为cry1Ab20。序列分析显示该基因所编码蛋白与已知的Cry1Ab13有1个氨基酸不同。将cry1Ab基因毒性片段（1．95kb）插入表达载体pET-21b，转化Escherichia coli Rosetta（DE3）菌株，表达的包涵体蛋白对小菜蛾和棉铃虫幼虫具有杀虫活性，LC60分别为100．74μg／mL和29．87μg/mL，进一步明确了Cry1Ab20蛋白的杀虫活性区。     

北京植物园苏云金芽胞杆菌菌株的分离鉴定

[目的]从北京植物园采集的土壤样品中分离高毒力的苏云金芽胞杆菌.[方法]采用温度法筛选Bt菌株,比对大质粒DNA图谱,区分不同类型的Bt菌株,PCR-RFLP方法对cry1～cry40类基因型进行鉴定,SDS-PAGE分析杀虫晶体蛋白,测定Bt分离株对大猿叶甲、小菜蛾幼虫的杀虫活性,筛选出高毒力的菌株.[结果]从149份土壤样品中分离出147株Bt,分为12种类型,含有菱形、方形、球形和不规则等晶体类型;6株菌中分别含有fry1Aa、cry1Ab、cry1Ac、cy1Ah、cry1Ba、cry1Be、cry1Ia、cry1La、cry2Ab和cry7Aa等基因类型,其余6株中不含有已知基因.有9株表达约130 ku蛋白,1株表达约70 ku蛋白,2株表达约150 ku蛋白,有3株既表达130 ku蛋白又表达60 ku蛋白;发现一株对大猿叶甲具有较高毒力的菌株ZWY-7,1株对小菜蛾有高毒力的菌株ZWY-9,2株菌都没有检测到已知基因型.[结论]北京植物园中Bt分布广泛,类型多样,其中发现两株高毒力的菌株,有望获得新的杀虫基因.     

苏云金芽孢杆菌Cry8Ca2蛋白的纯化与活性的研究

cry8 Ca2基因是本实验室自行分离克隆的一种新型苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)杀虫晶体蛋白基因,其表达130 kDa蛋白对铜绿异丽金龟(Anomala corpulenta)和黄褐异丽金龟(A.exoleta)幼虫具有较高的活性。本研究对Cry8Ca2蛋白原毒素及胰凝乳蛋白酶消化片断的纯化条件及活性进行研究,最适的消化条件为质量比1∶20,37℃,消化1 h。通过阴离子交换层析得到纯的活性毒素蛋白。用原毒素与纯化的毒素对铜绿丽金龟幼虫进行生测,Cry8Ca2原毒素蛋白的LC₅₀为0.47μg/g土,纯化的毒素的LC50为0.08μg/g土,毒素的杀虫活性可以达到原毒素的6倍。     

四株对小地老虎有活性的苏云金芽胞杆菌的毒力评价

本文对4株苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis（Bt）的杀虫基因类型、杀虫蛋白表达类型、蛋白表达量以及杀虫活性进行了初步的评价分析。菌株PS9-D12和PS9-C12的基因类型与蛋白表达类型丰富,且其杀虫蛋白表达量是对照菌株HD-1的1.7倍。在相同培养条件下,制备菌株胞晶混合冻干粉对小地老虎Agrotis ypsilon的生测结果显示,菌株HD-1、PS9-D12、PS9-C12、PS9-D11和PS9-H9的LC50分别为0.71、0.19、0.14、0.24和1.16 mg·g^-1,菌株PS9-D12和PS9-C12的杀虫活性显著高于菌株HD-1（P〈0.05）;此4株菌株对小菜蛾Plutella xylostella幼虫的校正死亡率均大于78%,它们对甜菜夜蛾Spodoptera exigua幼虫的活性均高于菌株HD-1;而对大猿叶甲Colaphellus bowringi幼虫均无活性。可见菌株PS9-D12和PS9-C12比商业化生产的HD-1有更好的杀虫活性,可作为Bt杀虫剂的候选材料。     

对甜菜夜蛾具有杀虫活性的Bt菌株cry1Ca基因研究

根据已报道的14个cry1Ca基因,设计能够扩增cry1Ca全长基因的简并引物。利用该引物对本实验室分离的472株Bt菌株进行筛选。PCR扩增发现22株菌含有cry1Ca基因。对22株菌株进行cry基因多样性分析,结果获得5种类型酶切图谱,表明这些菌株分为5种类型。SDS-PAGE结果显示22株菌均表达约130ku的蛋白。Western Blotting结果证实这些株菌中cry1Ca基因均正常表达。提取菌株的晶体蛋白,经胰蛋白酶活化,对甜菜夜蛾[Spodoptera exigua(Hübner)]进行初步生测,结果表明22株菌中活化的Cry蛋白对甜菜夜蛾均表现出很强的毒杀作用。进一步从5个类型的菌中各挑选一株毒力较高的菌株进行LC_(50)的测定,结果证实它们均具有很高毒力,其中,T1-E12(0.087μg/g)、B16-C8(0.103μg/g)、T1-B8(0.202μg/g)的活性与阳性对照菌株G03(0.090μg/g)相当,具有生产应用潜力。本研究为新型高效Bt菌株的挖掘奠定了基础。     

对绿盲蝽具有杀虫活性Bt菌株的筛选及Cry15Aa蛋白活性的研究

Bt棉有效控制了棉田主要害虫棉铃虫(Helicoverpa armigera),然而原来处于次要地位的刺吸式口器害虫盲蝽(Heteroptera:Miridae)为害逐年加重,目前对绿盲蝽(Apolygus lucorum Meyer-Dür)有效的抗虫基因未见报道。本研究以本实验室保存的Bt杀虫基因和菌株为材料,对绿盲蝽进行杀虫活性筛选。利用本实验室先前克隆的Mtx类杀虫基因cry15Aa表达产物进行绿盲蝽杀虫活性测定,研究结果显示Cry15Aa蛋白对绿盲蝽具有一定的杀虫活性。通过杀虫活性测定,获得对绿盲蝽有效的Bt菌株20株;对这些菌株表达蛋白进行质谱鉴定,LC-MS/MS质谱鉴定结果显示,这些菌株可能含有Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Ae、Cry1Af、Cry1Ag、Cry1Ah、Cry1Ba、Cry1Be、Cry8Ha等十余种对鳞翅目、鞘翅目害虫有杀虫活性的蛋白片段,并且有4株Bt菌株样品中检出了Mtx类杀虫蛋白Cry15Aa的片段。但是进一步基因鉴定结果表明,这4株菌株并不含有cry15Aa全长基因,推测这些菌株中含有Cry15类的新基因。上述研究结果表明这些菌株中可能存在对盲蝽有效的新型杀虫蛋白。本研究在发现了cry15Aa基因所表达的蛋白对绿盲蝽具有杀虫活性的同时,获得了对绿盲蝽具有杀虫活性的Bt新菌株,对绿盲蝽的生物防治具有重要的意义。     

苏云金芽孢杆菌及其δ-内毒素基因的分类与鉴定

苏云金芽孢杆菌作为重要的杀虫微生物在生物防治中发挥了巨大作用。其分类鉴定对于研究资源的多样性、快速筛选优良菌株、预测其杀虫活性、分离克隆新的Btδ-内毒素基因等方面具有重要意义。本文对Bt菌株的分类、δ-内毒素基因分类、鉴定方法进行了分析讨论。     

拮抗细菌对Bt制剂杀虫效果的影响

从土壤、棉花根际和棉铃虫肠道内分离、筛选出细菌８株,初步鉴定为芽孢杆菌属、假单胞杆菌属和肠杆菌属,对水稻白叶枯、棉铃疫霉、棉花黄萎病原菌进行抑菌试验,拮抗细菌以菌悬液和细胞菌体分别与Ｂｔ制剂混配感染饲料,以２龄棉铃虫生测的结果表明,培养液无杀虫效果,拮抗细菌发酵液、菌体对Ｂｔ制剂杀虫效果有不同的影响。拮抗细菌中５株芽孢杆菌对Ｂｔ制剂有较好的增效作用,其杀虫效果均达７５％以上,防效接近ＨＤ┐７３无晶体突变株     

苏云金芽胞杆菌杀虫蛋白增效物质与增效机理

苏云金芽胞杆菌的主要特征是在芽胞形成的同时,能产生对多种昆虫具有特异杀虫活性的晶体蛋白,该蛋白对人畜和环境安全无害。但因在应用过程中杀虫毒力有限,影响了其巨大潜力的发挥。因此,如何提高杀虫蛋白的毒力,寻找更有效的增效物质成为新的研究热点。本文主要综述目前对苏云金芽胞杆菌杀虫蛋白具有增效作用的物质与增效机理的研究进展。     

Bt杀虫基因专利保护现状与趋势

苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis, Bt）能产生多种对昆虫有特异活性的杀虫晶体蛋白,这些毒蛋白由cry或cyt基因编码。目前Bt杀虫基因已经广泛应用于转基因抗虫作物并且取得了巨大的经济、社会和生态效益。Bt杀虫基因的巨大市场价值引起国内外相关研究机构和企业的高度关注,并且利用知识产权将这些基因和技术转化为自己独占的权利。本文主要分析Bt杀虫基因的克隆命名情况,并对其中受专利保护的基因进行统计分析,借此为我国在转基因技术研发、产业化应用过程中,合理有效地规避知识产权陷阱,有效利用Bt 资源提供决策参考。     

苏云金杆菌杀虫晶体蛋白作用机制的研究进展

自本世纪６０年代以来,由于化学农药引起的环境污染、害虫普遍产生抗药性等原因,生物防治越来越受到人们的重视。在现有的各种生物防治策略中,研究和利用微生物杀虫剂发展很快,最突出的方法是利用苏云金杆菌（Ｂａｃｉｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ,Ｂｔ）进行防...     

对大黑鳃金龟甲幼虫高效的苏云金芽胞杆菌筛选及cry基因鉴定

为获得对大黑鳃金龟甲幼虫具有较高杀虫活性的菌株,利用拌土法测定了本实验室分离的500株苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)对大黑鳃金龟甲的杀虫活性,建立Bt菌株比较鉴别技术来进行多样性分析,并对菌株的晶体形态及幼虫感染Bt后的中肠组织切片进行观察。结果显示,从500株Bt菌株中筛选到42株对大黑鳃金龟甲幼虫具有不同程度活性的菌株,分属于14个菌株类型;其中有10株校正死亡率大于60%,261-1菌株杀虫活性最高,7 d校正死亡率达100%。从14个菌株类型中各选取1个代表菌株进行基因鉴定,仅P65-1、1126-1、FCD114和78-2菌株分别含有cry8Ma、cry8Ca、cry8Ab、cry8Ga、cry8Ea共5个cry8类新基因,其它10个菌株均不含cry3、cry8、cry18、cry23、cry37、cry43等对鞘翅目害虫有效的杀虫基因。14个菌株中,78-3、127-2和1198-1菌株能产生双锥体型晶体,261-1、FCD114、P65-1、FTL84、78-2和1126-1菌株能产生球形晶体。幼虫感染261-1、1198-1、FCD114、1126-1、QDL40-2菌株后,中肠组织发生明显的病理变化:2 d时肠壁细胞明显出现空洞化,排列疏松,4 d时受到严重破坏并脱离底膜。表明筛选到的Bt菌株具有防治大黑鳃金龟甲幼虫的潜力。