PVY引起马铃薯块茎细胞坏死的相关基因研究

本研究采集健康马铃薯块茎和被PVY侵染的马铃薯块茎为材料,选取马铃薯RCCR基因和LSD1基因为目标基因。首先提取总RNA后通过反转录PCR(RT-PCR)、琼脂糖凝胶电泳,证明RCCR基因和LSD1基因成功获得,然后进行荧光定量PCR(qPCR)测定在PVY侵染的马铃薯块茎中RCCR基因和LSD1基因的相对表达量,最后又进行了目标基因编码蛋白的结构分析。结果表明,这2个基因的相对表达量均有所下降,推测这2个基因与马铃薯块茎细胞坏死相关,为之后研究PVY引起马铃薯块茎细胞坏死的相关分子机制做了前期探索,为今后的分子育种和抗病药物筛选提供了可选的靶点。     

马铃薯块茎休眠解除过程中CAT酶活性变化及其编码基因的生物信息学分析

以马铃薯栽培品种"克新4号"为试验材料,测定了在马铃薯块茎休眠解除过程中H2O2含量、CAT活性和CAT基因的相对表达量,并对CAT基因及其编码的蛋白质进行生物信息学分析。结果表明:马铃薯块茎中的H2O2含量和CAT活性变化与CAT1基因表达量变化的趋势相同,均在收获后第40 d达到最大值。马铃薯CAT1的CDS区长1 479 bp,编码492个氨基酸,是一种亲水性蛋白,有12个磷酸化位点,其与番茄CAT同源性高达99%。研究结果为阐明CAT在马铃薯块茎休眠解除过程中的作用提供了基础。     

玉米KNOX基因家族鉴定及表达分析

KNOX基因家族存在于大部分植物体中,是同源异型盒基因家族的一类,其编码的转录因子参与调控植物的模式形成、形态建成等生理活动。用含有KNOX结构域的隐马尔可夫模型文件(PF03790, PF03791)作为探针结合Hmmsearch软件,对玉米(Zea mays L.)基因组中KNOX家族成员进行了鉴定,并对其理化性质、亚细胞定位、系统进化树、基因在染色体定位、顺式作用元件和组织特异性表达模式进行了分析。通过hmmer搜索鉴定出16个玉米KNOX基因,其蛋白的氨基酸数在154～484之间,分子量在16.3～52.9 kD之间,等电点在4.33～7.74之间,其成员基因主要位于细胞核。根据玉米和拟南芥KNOX基因进化树分析,可将其分为2个进化分支。染色体定位结果表明,玉米KNOX基因家族的16个家族成员分布于9条不同染色体。1号染色体(Chr.01)分布6个成员,其中2个成员基因为串联重复基因。除ZmKNOX8和ZmKNOX9外,所有成员启动子区域都存在多个响应激素、光和逆境信号的cis-element。此外,ZmKNOX14和ZmKNOX15在嫩叶中表达量最高,可能与玉米叶细胞中次生细...     

马铃薯扩展蛋白基因家族的鉴定与表达分析

为了分析马铃薯扩展蛋白基因家族的进化与功能,鉴定了马铃薯的扩展蛋白基因家族,分析了其基因结构特征、系统发育及表达模式等。结果表明,马铃薯基因组包含33个扩展蛋白基因,包括A(21)、B(5)、LA(1)和LB(6)4个亚家族,分布在马铃薯11条染色体上。扩展蛋白氨基酸长度为194~488 aa,编码蛋白质具有保守的结构域,蛋白质亚细胞定位预测结果表明所有蛋白均定位于细胞外。基因结构分析表明,马铃薯扩展蛋白家族有23个基因(69.7%)含有2~3个内含子。基因表达分析发现,该家族基因在马铃薯根、茎、匍匐茎、果实及块茎发育过程中表达丰度较高,并且其表达受到高温、盐、激素及病害等逆境的调控。     

马铃薯质体表达载体构建及GFP基因在块茎中的瞬时表达

利用高等植物质体基因组在进化中高度保守的特点, 根据烟草质体基因组全序列设计合成引物, PCR扩增并克隆了马铃薯质体的trnI-trnA基因片段。将测序正确的trnI基因和trnA基因作为定点整合外源基因的同源重组片段, 构建成包含Prrn-gfp-aadA-TpsbA表达盒的马铃薯质体定点转化载体pBMLSIA-GFP, 酶切鉴定表明, 所构建载体符合预期设计。采用该载体对马铃薯块茎进行基因枪法转化, 结果表明, GFP基因可在质体特异性启动子Prrn及终止子TpsbA的调控下在马铃薯块茎中瞬时高量表达, 经基因枪轰击后马铃薯块茎在紫外投射仪下产生很强的绿色荧光, 在距离为6 cm, 压力1 100 psi轰击2枪的条件下产生的绿色荧光最强。马铃薯块茎可溶性蛋白SDS-PAGE电泳分析表明, GFP蛋白表达量约占总可溶性蛋白的15.4%~30.2%, 均达到了较高的表达水平。该载体对后期马铃薯质体转化体系的建立和其他功能基因导入马铃薯质体进行性状改良具有重要应用价值。     

马铃薯光敏色素作用因子基因PIF4的克隆及表达分析

本研究以栽培种马铃薯青薯9号为试验材料,利用同源克隆技术分离出一个光敏色素作用因子St PIF4基因,该基因开放阅读框长度为1 554 bp,编码517个氨基酸,含有HLH保守结构域;系统进化树分析表明,StPIF4与茄科植物聚为一类,和已测序的马铃薯DM亲缘关系最近。蛋白功能预测表明,StPIF4蛋白不具备信号肽位点和跨膜结构,其蛋白序列含有56个磷酸化位点,亚细胞定位于细胞核或细胞质中。RT-qPCR分析表明,StPIF4在根、茎、叶片、块茎和匍匐茎中均能表达,在叶片中相对表达量最高,根中较低。通过对StPIF4基因的克隆和表达分析,为深入马铃薯StPIF4的功能分析提供科学基础。     

马铃薯块茎休眠解除过程中NOX酶活性变化及其蛋白质结构分析

本研究测定了马铃薯块茎休眠解除过程中NADPH氧化酶(NADPH oxidase,NOX)的酶活性,用q RT-PCR方法检测了马铃薯St NOXs基因在块茎休眠解除过程中的相对表达量,并利用生物信息学方法分析了St NOX3基因编码蛋白质的可能结构和功能。情况表明:马铃薯块茎休眠解除过程中NOX酶活性呈升-降-升-降的动态变化过程;q RT-PCR情况显示St NOX3基因的相对表达量与NOX酶活性呈相同的变化趋势;生物信息学分析表明该基因编码940个氨基酸,蛋白质相对分子量为106 004.79,等电点为8.76。研究情况为进一步阐明St NOX基因家族在马铃薯块茎休眠解除过程中的作用奠定了基础。     

马铃薯StNCED1基因过表达载体的构建及其遗传转化

马铃薯块茎的休眠和发芽对于块茎生产和加工极为重要,延长块茎休眠期有助于降低块茎水分和养分的消耗,从而提高其应用价值。本研究用PCR方法从马铃薯中克隆了9-顺式-环氧类胡萝卜素双氧合酶(NCED)编码基因St NCED1,并构建了马铃薯块茎特异表达启动子CIPP驱动的St NCED1基因的植物过表达载体p BIC-St NCED1,然后通过根癌农杆菌介导法转化马铃薯栽培品种"陇薯3号"获得转化植株,经卡那霉素抗性筛选得到5株抗性苗,PCR检测证明St NCED1基因已整合到马铃薯的基因组中。qRT-PCR检测表明St NCED1基因在转基因植株试管薯中的表达量分别比未转基因的对照增加2.10~8.09倍。该研究有助于培育块茎休眠期延长的马铃薯新种质。     

BR相关基因在低温调控马铃薯萌芽中的响应分析

油菜素内酯(BR)是调控植物生长发育的重要激素。本项目组研究发现,BR合成和信号转导基因表达量均随马铃薯块茎休眠解除而升高,抑芽剂可明显抑制BR合成相关基因delta24-甾醇还原酶(DWF1)、甲基甾醇单加氧酶(SMO1)、信号转导成员油菜素内酯不敏感蛋白(BRI1)、信号转导激酶(BSK)和信号激活因子细胞周期蛋白(CYCD3)等在马铃薯块茎中的表达。还发现,低温可以显著延长马铃薯‘费乌瑞它’等品种的贮藏时间,而对‘米拉’等品种的作用不显著。为进一步探明BR合成、信号转导和激活基因在低温调控马铃薯萌芽中的响应情况,本试验以休眠中后期的马铃薯‘费乌瑞它’和‘米拉’原原种为材料,采用常温(23±2)℃和低温(4℃)贮藏,利用q RT-PCR技术测定两个品种在萌芽过程中5个BR合成、信号转导及激活关键基因的表达量变化。结果表明,低温下,两个品种中的DWF1、BRI1基因在萌芽过程中的表达量保持在低水平;SMO1、BSK和CYCD3基因的表达量在‘费乌瑞它’的萌芽阶段维持在低水平,而在‘米拉’中的表达量却呈相对较高的水平。由此推测低温通过抑制SMO1、BSK和CYCD3基因在‘费乌瑞它’萌芽过程中的表达,抑制萌芽,而有效延长马铃薯贮藏时间。与低温显著延长该品种贮藏时间、延迟萌芽的效果一致。本研究为阐明马铃薯萌芽过程中BR调控机制及其与环境温度的关系,利用分子技术辅助选育耐贮藏品种,以及为马铃薯贮藏调控新技术研发提供新的依据。     

桑树MaGte4基因的克隆、表达及序列特征分析

Virp1基因是第一个被报道可以结合RNA的Bromodomain(BRD)蛋白,在马铃薯纺锤块茎类病毒(potato spindle tuber viroid,PSTVd)对宿主的感染及其复制中起重要作用。本研究根据NCBI登录的virp1基因序列和桑树基因组数据库设计引物,进行RT-PCR扩增和克隆测序,获得桑树的同源MaGte4基因长1 771 bp的序列。生物信息学分析表明,基因有3个外显子,CDS长1 683 bp,编码560个氨基酸,有与乙酰化组蛋白赖氨酸具有特异相互作用的BRD及其extra-terminal(BET)结构域,且该结构及其氨基酸组成在各物种间比较保守,桑树MaGte4具有和virp1蛋白非常相似的C-末端区域,RT-PCR分析基因在正常和花叶型萎缩病桑树叶片、叶柄和叶脉中均有表达,推测MaGte4的功能可能和Virp1相类似。     

马铃薯青薯九号甜菜碱醛脱氢酶基因(StBADH)克隆及进化分析

本研究利用同源克隆,从马铃薯青薯9号中克隆到2个甜菜碱醛脱氢酶基因,分别命名为St BADH-504和St BADH-505。St BADH-504为1 631 bp,CDS为1 515 bp,编码504个氨基酸蛋白,编码蛋白亚细胞定位于线粒体;St BADH-505为1 709 bp,CDS为1 518 bp,编码505个氨基酸蛋白,编码蛋白亚细胞定位于叶绿体或过氧化物酶体,二个蛋白都有醛脱氢酶高度保守的十肽(VSLELGGKSP)结构。进化分析表明,St BADH-504和St BADH-505蛋白与茄科植物中BADH蛋白聚为一类,但二者分属不同分支。盐胁迫表达特征分析表明,马铃薯叶片中St BADH-504表达受盐胁迫的诱导,而St BADH-505为组成型表达,不受盐胁迫诱导。本研究有助于了解马铃薯耐盐机理,为耐盐马铃薯资源创制提供理论参考。     

雷蒙德氏棉KNOX基因家族全基因组鉴定及表达分析

为探究KNOX基因家族在棉花生长发育中的调控作用,本研究以雷蒙德氏棉为材料,利用生物信息学的方法全基因组鉴定KNOX家族成员,并对其保守结构域、进化模式、染色体定位、基因结构和基因表达情况进行分析。共鉴定到22个KNOX基因,分布于10条染色体上,其中13个基因发生了片段复制。除GrKNOX9和GrKNOX15外,其余GrKNOX蛋白均含有KNOX1,KNOX2,ELK和HOX四个典型结构域。Gr KNOX基因家族进化聚类成两组：ClassⅠ和ClassⅡ。ClassⅠ组包含13个基因,ClassⅡ组含有9个基因。GrKNOX基因在叶片、花瓣、开花后10、20、30和40 d的种子中的表达分析显示,ClassⅠ组成员表达模式差别较大,ClassⅡ组成员表达模式较相似。GrKNOX12、GrKNOX1、GrKNOX17、GrKNOX2、GrKNOX11、GrKNOX3和GrKNOX22在测定的组织中表达量均较高;GrKNOX6、GrKNOX16和GrKNOX19在开花后20、30和40 d的种子中表达量较高,推测这3个基因参与调控棉花种子发育过程。本研究为进一步探究KNOX基因家族在棉花...     

马铃薯GATA12基因克隆及表达分析

GATA转录因子是一类广泛存在于真核植物中的转录因子,GATA转录因子具有锌指结构,是锌指蛋白家族的成员之一。为了进一步分析马铃薯中GATA基因的结构与功能,本研究以马铃薯(Solanum tuberosum)栽培品种‘陇薯3号’为材料,克隆了StGATA12转录因子编码基因,分析了其序列特征、表达模式,并分析了该基因在马铃薯不同组织中的表达量。结果表明马铃薯GATA12基因序列含有一个全长为1 407 bp的开放阅读框,编码一个由437个氨基酸残基构成、分子量为49.22 kD、理论等电点为6.55的蛋白。StGATA12转录因子含有C-X_2-C-X_(18)-C-X_2-C锌指环,属于GATA转录因子家族Ⅰ亚族。组织表达分析显示,StGATA12在马铃薯根、茎、花和叶中均有表达,在花中的表达量最高。本研究对GATA12基因的研究可以为作物增产提供一定的理论基础。     

马铃薯空心块茎转录组分析

空心是马铃薯块茎内部生理缺陷性状,它会严重影响马铃薯的鲜食和加工。为了解马铃薯空心块茎不同形成时期的差异表达基因和探究与空心块茎形成密切相关功能基因。本研究采用RNA-Seq技术对马铃薯空心敏感性材料('5-19')块茎无空心期(N)、空心轻微期(S,空心长度0～1 cm)、空心较重期(M,空心长度1～3 cm)进行转录组分析。结果显示,各送样样品高质量碱基均达到6.54 Gb,各组样品Q30碱基百分比均在94.15%以上。N-vs-S和S-vs-M的差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs)数目分别为44和130个。GO功能注释显示差异表达基因主要集中在代谢过程、细胞过程、单组织过程、结合、催化活性、细胞组分等。KEGG代谢通路富集发现,差异表达基因显著富集到角质素、木栓质、蜡状物合成、苯丙烷生物合成、脂肪酸延长、苯丙氨酸代谢等途径。进一步分析挖掘到19个与马铃薯块茎空心形成相关基因。本研究解析了马铃薯空心块茎形成过程中的转录调控分子机制,为后续研究提供了相关基因数据信息。     

黑喉石斛DoCOL10基因克隆及在花发育过程中的表达模式分析

CO (CONSTANS)是植物成花诱导中光周期途径的关键基因。为探明黑喉石斛(Dendrobium ochreatum)CO同源基因在其花发育过程中的表达模式,以黑喉石斛不同时期叶片为试验材料,基于转录组测序结果,结合同源克隆和3'RACE克隆技术得到黑喉石斛CO同源基因,命名为DoCOL10。DoCOL10基因编码区长度为1 263 bp,共编码421个氨基酸;该基因编码的氨基酸序列有2个完整且相连的B-box元件和1个CCT结构域,属于CO家族第1类,为CO同源基因;Do COL10不具备跨膜结构域和信号肽,为亲水性蛋白;进化树分析结果显示,DoCOL10与兰科植物如铁皮石斛、小兰屿蝴蝶兰、墨兰等的同源基因的氨基酸序列亲缘关系最为接近,单子叶和双子叶植物之间CO进化较远,处在不同分枝中。Real-time PCR分析结果显示,DoCOL10的表达量在花芽始分化阶段出现显著上调并达到峰值,随着花芽形成呈下降趋势;DoCOL10不仅在叶片中高表达,其在花芽中的表达量也处于较高水平,在花器官中也有一定表达。为深入研究DoCOL10基因在黑喉石斛嫩茎成花机制中的作用提供理论依据。     

马铃薯蔗糖磷酸合成酶StSPS1的原核表达及抗体制备

为了对马铃薯蔗糖磷酸合成酶(SPS)编码蛋白StSPS1进行原核表达及多克隆抗体制备。从四倍体马铃薯品种川芋10号的块茎中克隆出了StSPS1基因，该基因编码区全长为3 165 bp,编码蛋白的长度为1 055 aa。随后基于构建的His标签融合表达载体PET30a-StSPS1,进行了StSPS1蛋白的诱导、变性、纯化、复性及兔免疫试验。结果发现，StSPS1蛋白分子量约为119.62 ku,在可溶性上清中的表达极少，主要在不溶的沉淀中表达，最佳的诱导条件为37℃下用0.5或1.0 mmol/L的IPTG诱导4 h。由于StSPS1为包涵体蛋白，故对其进行包涵体变性处理，并利用His标签纯化出了与目的条带大小相符的蛋白，同时通过His抗体进行了蛋白质免疫印迹(WB)试验，发现在119.62 ku处检测到目标条带，说明StSPS1包涵体蛋白纯化成功。最后，通过将透析复性后的StSPS1蛋白注射进兔子皮下组织中，成功免疫出2个StSPS1的抗体，经过WB鉴定发现2个抗体均能在抗原和川芋10号叶片的总蛋白中杂出目标条带。综上，对马铃薯StSPS1蛋白进行了诱导及纯化，并成功制备了StSPS...     

菊芋果聚糖:果聚糖1-果糖基转移酶1-FFT基因的克隆及表达分析

果聚糖作为一种重要的渗透调节物质,与植物碳素分配和抗逆性的密切相关。为明确果聚糖在植物生长发育过程中的作用,本研究以菊芋为材料,克隆出果聚糖:果聚糖1-果糖基转移酶1-FFT基因,其CDS长2 025 bp,编码641个氨基酸,该蛋白的分子量(Mw)为73.906 k D,蛋白的等电点(p I)为10.01。进化树分析显示菊芋中1-FFT基因与维氏菊的1-FFT基因进化距离最近,具有较高的保守性。荧光定量检测结果显示,1-FFT基因在菊芋的叶、根、花、茎和块茎中均有表达,其中在块茎中表达量最高。本研究为解析果聚糖合成酶的分子调控机理及功能鉴定提供依据。     

番茄发育相关基因SlLNG1和SlLNG2的鉴定与组织表达模式分析

LNG(LONGIFOLIA)基因在模式植物叶片和果实生长发育过程中发挥重要的调控作用。然而,茄科作物中的LNG基因功能尚不明确。本研究运用同源克隆的方法从"Micro-Tom"番茄矮化品种中鉴定到两个LNG基因,基于其与拟南芥AtLNG1和AtLNG2的序列相似性,命名为SlLNG1和SlLNG2。并对这两个家族成员进行了基因结构、蛋白特征、序列保守结构域和进化关系等分析。结果表明:SlLNG1和SlLNG2分别位于第2染色体和第3染色体,编码产物与马铃薯同源蛋白的相似性最高。荧光定量PCR实验结果发现,SlLNG1和SlLNG2基因在番茄的各组织中的表达具有较大差异,表现出明显的组织特异性。SlLNG1在花中的表达量最高,而SlLNG2在叶片中的表达最高。此外,在SlLNG1和SlLNG2的1.5 kb启动子区域发现多个光响应、胁迫响应和水杨酸响应的顺式作用元件。本研究为深入研究番茄LNG基因的结构、功能和调控机制奠定了基础。     

马铃薯StGS基因克隆及镉胁迫下的表达分析

谷胱甘肽(glutathione, GSH)是植物体内重要的抗氧化剂,能有效清除活性氧自由基对细胞造成的损伤。为研究镉胁迫对马铃薯(Solanum tuberosum)谷胱甘肽合成酶(glutathione synthetase, GS)编码基因表达的影响,本研究以马铃薯‘威芋7号’为试验材料,采用同源克隆的方法从cDNA中克隆到StGS基因。序列分析表明,该基因ORF全长为1 644 bp,可编码344个氨基酸;在所选的物种中,蛋白序列同源性分析显示,马铃薯GS蛋白与潘那利番茄(Solanum pennellii)的亲缘关系最近,相似度为93.98%,与枸杞(Lycium barbarum)亲缘关系最远。另外,实时荧光定量PCR分析表明,镉胁迫24 h与4 h相比,马铃薯根和叶中GS相对表达量均达到极显著水平,分别为胁迫4 h的15倍和13倍;而在茎中GS相对表达量呈现出下降趋势。镉胁迫4 h时GS相对表达量为24 h的6倍,暗示StGS不仅是一个镉应答的基因,而且马铃薯植株不同器官应在应答镉胁迫时GS的表达存在一定差异。本研究结果为进一步探究StGS基因介导的镉胁迫响应机制提供前期基础。     

葡萄HXK基因家族的鉴定与表达分析

为了对葡萄HXK基因家族进行鉴定和表达分析,利用拟南芥和玉米的HXK(Hexokinase)基因注册序列,从葡萄全基因组中鉴定得到HXK基因4个,并命名为VvHXK1、VvHXK2、VvHXK3和VvHXK4,对其进行生物信息学分析。蛋白质理化性质分析结果表明,每个基因编码的氨基酸个数分布在412-524 aa,VvHXK4是碱性蛋白,其余3个均为酸性蛋白;亚细胞定位分析表明,4个VvHXK基因都在细胞质中表达,且VvHXK4主要定位于叶绿体,而VvHXK2也存在于线粒体和细胞核中;蛋白质的二级结构预测表明,4个VvHXK基因编码的蛋白主要以α-螺旋为主;外显子结构分析表明,除VvHXK1含10个外显子外,其余3个都有9个外显子,说明VvHXK基因比较保守;启动子顺式作用元件分析表明,4个VvHXK基因均含有ABA响应元件和MYB及WRKY转录因子的结合区域,而VvHXK4中没有发现低温响应元件;系统进化树分析表明,VvHXK1与拟南芥AtHXK1的同源关系最近,推测其不仅具有调节生长发育,影响根系的生长等功能,而且具有加速衰老的作用。VvHXK2与马铃薯StHXK1的同源关系最近,推测其具有使叶绿体中的葡萄糖磷酸化活性升高的功能。VvHXK3与马铃薯StHXKRP1的同源关系最近,可能具有诱导离体叶片中糖表达的作用。VvHXK4与菠菜SoHXK1的同源关系最近。荧光定量分析表明,VvHXK2、VvHXK3和VvHXK4均在20 g/L的葡萄糖处理下相对表达量最高,即其对葡萄糖磷酸化最显著,在果糖和蔗糖的处理下表达量较低。