巴西橡胶树HbUBC22基因克隆与表达分析

泛素蛋白酶体途径（ubiquitin proteasome pathway, UPP）是细胞内最重要的且具有高度选择性的蛋白质降解途径,而泛素结合酶E2/UBC是该途径的一个关键酶。本研究通过对巴西橡胶树同源EST序列拼接和RT-PCR扩增的方法,克隆了一个巴西橡胶树的泛素结合酶基因HbUBC22,该基因的开放阅读框（ORF）共807 bp,编码268个氨基酸,编码蛋白含有一个保守的UBC结构域和一个高度保守的半胱氨酸催化位点。系统进化关系分析发现,HbUBC22蛋白与蓖麻、杨树、油茶和葡萄的UBC蛋白的同源性最高,分别为89%、85%、85%和81%;在拟南芥基因组中,HbUBC22则与AtUBC22的同源性最高达到73%。表达谱分析结果显示,HbUBC22受乙烯利和茉莉酸甲酯诱导显著上调表达。原核表达分析结果表明,经IPTG诱导后,HbUBC22能够在大肠杆菌中表达出目标蛋白。本研究结果为进一步研究HbUBC22在橡胶树中的生物学功能奠定了良好基础。     

荷斯坦奶牛IFN-γ基因的克隆、序列分析及表达研究

利用RT-PCR技术从荷斯坦奶牛外周血淋巴细胞总RNA中扩增IFN-γ(ccIFN-γ)基因,克隆至pMD18-T载体进行测序。测序结果表明,ccIFN-γ基因全长501bp,编码166个氨基酸,其中前23个氨基酸残基构成信号肽序列,后面147氨基酸残基构成成熟肽,其中含有2个潜在的N-链糖基化位点。二级和三级结构预测发现,ccIFN-γ蛋白分子中存在7个的α-螺旋,中间由无规卷曲连接,折叠成由α-螺旋包绕的中空状结构。将ccIFN-γ成熟肽编码区序列进一步克隆至pET-28a,转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达。经SDS-PAGE分析,表达出与预期大小(20.6KDa)相符的重组蛋白,占菌体蛋白18.6%。Western blot检测证实表达的融合蛋白为牛IFN-γ,这为进一步开展重组ccIFN-γ生物学活性的研究奠定了基础。     

转基因烟草中半胱氨酸跨膜基因CYS生物信息学分析

在烟草中过量表达MYB转录因子LrAN2,能够激活上调花青素生物合成代谢通路,但富含半胱氨酸跨膜结构域蛋白A (CYS)的表达量明显降低。作为植物中一种重要的生物氨基酸,CYS的生物学研究鲜有报道。本研究克隆烟草的CYS基因,其全长为282 bp,编码氨基酸数94个。预测编码的蛋白分子量和等电点分别为24 019.84 Da和5.23,并且序列中没有保守区。实验结果显示该蛋白具有亲水性,主要由α-螺旋(19.35%)和无规则卷曲(65.59%)构成,CYS蛋白质不通过跨膜区,在膜外进行作用。系统发育树显示,烟草CYS基因与辣椒CYS基因亲缘关系最近,其次是番茄的HTC基因和WIH2基因。本研究结果克隆并分析CYS基因编码区序列,为CYS基因的功能研究提供参考依据。     

小麦Cyp450基因的电子克隆与生物信息学分析

为获得对小麦Cyp450基因及其编码蛋白质的理化性质与结构特性等,利用电子克隆方法克隆了一个新的小麦Cyp450基因,并对其编码的蛋白质进行了生物信息学分析。结果表明,该基因全长2155 bp,编码511个氨基酸;该蛋白序列的N端存在一个显著信号肽序列,属于CypX超家族,该蛋白定位于细胞质中,属于分泌途径中的信号肽蛋白,含有多个不同的磷酸化位点;二级结构以α螺旋（占48.14%）和无规则卷曲为主（占33.86%）,存在5个不稳定区,在85-511位处形成一个较大的球形蛋白域。该蛋白与大麦、二穗短柄草、水稻和高粱的同源Cyp450蛋白相似性较高,进化距离较近。获得了一个新的小麦细胞色素P450基因,并分析了其编码蛋白质的序列特性,为进一步实验克隆和研究其功能提供了理论基础。     

巴西橡胶树HbMADS5的克隆及表达分析

在前期巴西橡胶树胶乳转录组测序的基础上,通过PCR克隆了1个编码巴西橡胶树MADS-box转录因子的基因,命名为Hb MADS5。Hb MADS5全长1 077 bp,编码358个氨基酸,推测Hb MADS5蛋白分子量为40.75 k D,等电点为6.38。氨基酸序列比对分析表明,Hb MADS5具有MADS-box家族典型的MADS-box保守结构域,与蓖麻、葡萄、麻风树、甜橙、木本棉、蒺藜状苜蓿等物种的MADS-box家族成员具有较高的同源性,分别为79%、74%、72%、70%、65%和59%。Hb MADS5与麻风树中的1个MADS-box成员亲缘关系最近。Hb MADS5在巴西橡胶树根、茎、叶、花和胶乳等中都有表达,其中在胶乳中表达量最高,在根中表达量最低;茉莉酸甲酯和乙烯能诱导Hb MADS5的表达,茉莉酸甲酯处理12 h后Hb MADS5表达量提高了10倍,乙烯处理48 h后Hb MADS5表达量提高了2倍。本研究将为进一步研究Hb MADS5在巴西橡胶树中的功能提供了帮助。     

甘蓝型油菜BnACP5基因克隆及表达分析

ACP5基因是参与植物体中脂肪酸代谢的重要基因之一,在甘蓝型油菜中该基因还未被深入研究。为了弄清楚BnACP5基因在甘蓝型油菜中的螺旋结构及功能,以湘油15为试材,采用同源克隆法得到一个与脂肪酸合成相关的基因BnACP5。BnACP5基因CDs序列长417 bp,共编码138个氨基酸。生物信息分析表明,BnACP5蛋白的相对分子质量15.25 ku,理论等电点(p I)为5.94,其不稳定参数为43.03,属于不稳定蛋白;其总疏水平均系数(GRAVY)为-0.148,是一种亲水性蛋白;不含跨膜结构,也不含信号肽序列;二级结构中含有59.42%的α螺旋、23.19%无规则卷曲、14.49%延伸链和2.90%β转角;其中18个可能是磷酸化位点;该蛋白位被定位在线粒体内;ACP氨基酸序列比对表明,植物ACP磷酸泛酰巯基乙胺结合位点周围的氨基酸序列高度保守;UPGMA聚类分析表明,BnACP5与白菜型油菜(XP_009111933.1)亲缘关系最近。荧光定量PCR结果显示,BnACP5基因的表达量在甘蓝型油菜种子发育的不同阶段呈一定规律变化,在授粉后15 d达到峰值,20 d呈下降趋势,25~35 d呈上升趋势,此后迅速下降,45 d表达量降到最低水平。由此分析得出,该基因可能与种子脂肪酸的合成有关。     

巴西橡胶树NAC转录因子HbNAC1基因的克隆及生物信息学分析

为了研究植物特有的NAC(NAM,ATAF1/2和CUC2)转录因子在巴西橡胶树生长发育、胁迫应答和激素调节中的功能,对巴西橡胶树NAC转录因子进行了克隆和分析。根据橡胶树胶乳cDNA文库中筛选到的NAC EST序列,利用RACE-PCR技术克隆了橡胶树HbNAC1的cDNA序列。生物信息学分析显示HbNAC1基因开放阅读框(ORF)为891 bp,编码了一个296个氨基酸组成的中性不稳定水溶性蛋白,该蛋白的N-端具有保守的NAC结构域,C-端高度变异,具备了NAC转录因子的基本特征。HbNAC1定位在细胞核中,具有3个糖基化位点和21个磷酸化位点,三级结构由3个α-螺旋和9个β-折叠组成。序列比对和系统进化分析显示HbNAC1蛋白属于NAC转录因子家族中的ANAC011亚族,推测其可能作为一种氨基酸合成相关的调节酶参与调控植物的免疫反应。     

巴西橡胶树HbNAC55的克隆及表达分析

在前期巴西橡胶树胶乳转录组测序的基础上,利用q RT-PCR技术,从巴西橡胶树中克隆得到1个NAC转录因子基因,命名为Hb NAC55。Hb NAC55全长1 755 bp,该基因编码584个氨基酸,蛋白质分子量为65.06 ku,等电点为4.79。蛋白结构分析发现,该蛋白含有一个NAM结构域,具有典型的NAC类蛋白的结构特征,与木薯、胡杨、可可、土瓶草、梅、胡桃、甜橙等物种的NAC家族成员具有较高的同源性,分别为81%、61%、56%、57%、55%和53%。通过q RT-PCR发现Hb NAC55在橡胶树胶乳中表达量最高。茉莉酸和乙烯均能诱导胶乳中Hb NAC55表达上调,其中茉莉酸甲酯处理12 h后Hb NAC55表达量提高了近6倍,乙烯处理48 h后HNAC55表达量提高了近1.7倍。本研究将为进一步研究Hb NAC55在巴西橡胶树中的功能提供了帮助。     

新疆野扁桃AlsCBF1-A基因的克隆及生物信息学分析

以野扁桃为实验材料,提取叶片的RNA,设计基因特异性引物,利用RT-PCR克隆转录因子CBF的c DNA全长,命名为Als CBF1-A(登录号KU975456);并对其基因和蛋白进行了生物信息学分析。结果表明,该转录因子基因的CDS区长699 bp,编码232个氨基酸,编码蛋白相对分子质量约为26.027 2 k D,p I 4.84;由无规则卷曲(C),α-螺旋(H),β-折叠(E)组成,分别占52.17%,21.74%和26.09%;有较强的亲水性,无跨膜区和信号肽存在,有8处丝氨酸磷酸化位点、2处苏氨酸磷酸化位点、2处酪氨酸磷酸化位点;同源性分析表明Als CBF1-A基因在高等植物中保守性较高。本研究显示CBF转录因子可能与野扁桃的抗寒性相关,此研究为野扁桃抗寒分子机理的进一步研究提供了帮助。     

MADS-box基因GmAP3的克隆及生物信息学分析

植物MADS盒基因蛋白是一类在生物发育过程中起着重要作用的转录因子家族。本研究在前期大豆花芽转录组测序分析的基础上,利用RACE技术成功克隆了一个MADS-box基因的全长cDNA序列,利用生物信息学方法对它所编码的氨基酸基本性质和结构进行了系统分析。结果表明,该基因属于MIKC家族,为亲水性蛋白,稳定性较好;二级结构中同时含有α-螺旋、β-转角、延伸链和无规则卷曲结构,其中α-螺旋和无规则卷曲所占比例均较高;亚细胞定位分析显示其定位在细胞核上;聚类分析表明该基因属于AP3亚家族,该基因编码的氨基酸与拟南芥AP3蛋白的同源性为41.18%,与大豆中GmNMH7的同源性最高为97%,命名该基因为GmAP3。本研究成功克隆出GmAP3基因,为该基因的进一步研究提供实验材料,并通过生物信息学分析预测,为下一步该基因的功能研究提供依据。     

白羊草BiCDPK基因保守区的克隆及序列分析

为了研究CDPK基因的结构和功能,利用RT-PCR方法从白羊草中克隆得到BiCDPK基因,并对其进行生物信息学分析。结果表明：该BiCDPK基因cDNA长1048 bp,包含387 bp的开放阅读框,编码128个氨基酸。蛋白表现为弱酸性,且稳定、亲水,二级结构中以无规则卷曲和α-螺旋为主。亚细胞定位于细胞质中,无跨膜结构域,无信号肽。蛋白序列中存在1个丝氨酸磷酸化位点和3个苏氨酸磷酸化位点。进化分析结果表明,克隆的BiCDPK基因与玉米、小麦和水稻具有较高同源性,相似度分别是97%、86%、86%。为进一步研究BiCDPK基因的功能奠定了基础。     

玉米ZmZFP36基因的克隆与生物信息学分析

玉米(Zea mays)是世界上最重要的粮食作物之一,研究其抗逆性机理有着十分重要的意义。本研究用在线软件预测了玉米miR408的靶基因,对其中编码锌指蛋白的靶基因Zm ZFP36进行了生物信息学分析,并构建了该基因的植物表达载体。研究结果表明,Zm ZFP36的转录本全长为1 169 bp,无内含子,开放阅读框长度为702 bp,编码的蛋白质分子量为24.52 kD;具有亲水性,无跨膜结构域;二级结构包含无规则卷曲、α-螺旋、延伸链和β-转角,所占比例分别为69.10%、20.60%、7.73%和2.58%;系统进化树分析表明ZmZFP36蛋白与小米(Setaria italica)、高粱(Sorghum bicolor)蛋白亲缘关系最近。启动子分析结果表明,它含有低温、干旱及脱落酸等多种非生物胁迫响应元件,有助于后期通过遗传转化的方法进一步研究miR408的调控机理。     

巴西橡胶树一个Mlo基因克隆及其序列特征分析

Mlo基因是植物抗病基因中的重要成员。巴西橡胶树Mlo基因的克隆和序列分析,将为进一步通过转基因技术培育抗病橡胶树新品种奠定基础。本研究以大麦Mlo基因(GenBank登录号: Z83834)为探针对巴西橡胶树的EST和转录组数据库进行同源搜索,并将获得的同源EST序列进行拼接,最后得到巴西橡胶树Mlo基因的cDNA序列。采用RT-PCR方法成功克隆了与预期大小一致的Mlo基因CDS片段1668 bp,编码555个氨基酸,分子量为63.14 kDa,等电点是8.85。对巴西橡胶树Mlo的编码蛋白结构域进行分析发现,该蛋白具有Mlo保守结构域,包含8次跨膜结构。通过对不同物种的Mlo同源蛋白进行聚类分析发现,巴西橡胶树Mlo蛋白与木薯Mlo蛋白同源性最高,达到92.1%,其次是蓖麻(87.6%);在拟南芥基因组中,与AtMlo8的相似性最高,达到67%,而且AtMlo8也包含有8次跨膜结构,因此,将巴西橡胶树中克隆的Mlo基因命名为HbMlo8。通过对所克隆的HbMlo8基因分析可知,该基因属于Mlo基因家族成员,基因的克隆及序列分析为进一步验证巴西橡胶树HbMlo8的功能奠定了基础。     

橡胶草SRPP5基因的克隆及生物信息学分析

天然橡胶是产胶植物中合成的聚异戊二烯高分子化合物,而小橡胶粒子蛋白是橡胶粒子膜上参与天然橡胶分子链延伸的关键因子,与橡胶的产量和质量密切相关。本研究利用PCR技术从橡胶草中克隆得到TkSRPP5基因全长序列并进行生物信息学分析。结果表明,该基因含有一个长度为654 bp的开放阅读框,并编码217个氨基酸,所编码蛋白的分子量为23.31 kD,理论等电点为4.58。TkSRPP5为亲水性蛋白,具有24个磷酸化位点,亚细胞定位预测在细胞质中。该蛋白属于SRPP家族,二级结构主要存在α-螺旋和无规则卷曲结构,与预测的蛋白质三级结构一致。系统进化树分析表明,该蛋白与菊苣的SRPP蛋白有着最近的亲缘关系。本研究为进一步了解TkSRPP5基因的功能和其在橡胶草胶乳合成中的作用机制提供了理论依据。     

蔗茅EfNAC基因的克隆和生物信息学分析

为了更好地利用甘蔗野生种蔗茅(Erianthus fulvus Ness.)的抗逆相关基因,并为转基因甘蔗抗逆育种提供可靠的候选基因。本研究利用电子克隆和RT-PCR的方法在蔗茅野生种‘蔗茅99-2’中克隆到一个干旱诱导表达基因,并命名为FfNAC (GenBank登录号:MT499790)。生物信息学分析表明,FfNAC基因ORF长度为765 bp,共编码254个氨基酸,具有一个保守的NAM结构域。编码的蛋白以无规则卷曲和α-螺旋为主,没有信号肽,具有多个磷酸化位点,没有跨膜结构。本研究为深入研究蔗茅干旱胁迫的分子调控机制和转基因甘蔗抗旱育种提供理论依据和技术支撑。     

牡丹PsPIP2基因的克隆及其蛋白结构预测

质膜内在蛋白作为水通道蛋白的一种存在类型,在跨膜水分运输中起着重要作用。本研究以本实验室获得的水通道蛋白基因的EST序列为模板设计引物,利用RACE技术扩增得到1 174 bp的PsPIP2全长cDNA,其中,包括3'UTR 191 bp,5'UTR 137 bp和846 bp的编码区,共编码281个氨基酸,分子量为29.79 kD。PsPIP2包括8个可能的磷酸化位点,其中7个位于丝氨酸(S),1个位于酪氨酸(Y),推测这些磷酸化修饰位点可能与PsPIP2蛋白通道的开启与闭合相关。二级结构预测显示,PsPIP2含无规卷曲和α-螺旋较多。同源性分析结果表明,PsPIP2与木薯PIP2同源性最高。本研究结果可为研究该基因的生物学功能和牡丹花衰老调控机制提供理论基础。     

蓖麻RcDELLA基因的克隆及序列分析

DELLA家族蛋白是植物GA信号途径的重要阻遏蛋白,能抑制植物的生长和发育,使植株产生矮化的表型。为了明确DELLA基因在蓖麻中的作用和功能,对RcDELLA基因进行生物学信息分析。以蓖麻2129六叶期茎尖的cDNA为模板,根据NCBI公布的DELLA(XM_002533984.2)蛋白基因片段设计引物,克隆该基因,并对其进行生物信息学分析。克隆得到该基因的完整阅读框,该基因编码序列全长为1 701 bp,编码567个氨基酸,推测其分子量为62 550.40 ku,等电点为5.14。二级结构预测表明α-螺旋占40.4%,β-折叠占8.6%,无规则卷曲占51.0%。系统进化树结果表明,RcDELLA先与大戟科巴西橡胶树和麻疯树形成分支。通过PCR扩增得到了RcDELLA基因的完整阅读框,同源性比对结果显示,RcDELLA具有典型的DELLA结构域,与NCBI上公布的其他植物的DELLA蛋白序列具有高度的同源性。系统进化树结果显示,与麻疯树亲缘关系最近,符合进化关系。生物信息学分析将为进一步研究DELLA基因在蓖麻矮化过程中的作用和功能奠定理论基础。     

大豆GmZAT12基因的克隆和表达分析

锌指蛋白是真核生物中被广泛研究的转录因子,在植物生长发育和逆境应答中发挥重要作用。为了揭示大豆锌指蛋白基因功能,从商豆1201中克隆获得GmZAT12基因的CDS全长序列,并对其编码的蛋白质进行生物信息学分析。通过烟草表皮注射系统检测GmZAT12蛋白的亚细胞定位情况,采用实时荧光定量(qRT-PCR)技术对GmZAT12基因在大豆不同组织和非生物胁迫中的表达模式进行分析。结果表明,GmZAT12全长516 bp,共编码171个氨基酸,分子质量为19.264 28 ku,理论等电点(pI)为9.02;主要构成元件为无规则卷曲和α螺旋;含有20个磷酸化位点,其中以丝氨酸磷酸化位点为主。序列分析结果表明,GmZAT12蛋白含有2个保守的C2H2锌指结构域;亚细胞定位结果显示,GmZAT12蛋白定位于细胞核。qRT-PCR表达分析结果显示,GmZAT12基因在大豆根、叶片和种子中表达量较高,在花和茎中表达量较低;GmZAT12基因受到高温、低温、NaCl和ABA诱导表达,推测该基因可能参与大豆非生物胁迫应答。     

鸡白细胞介素2的克隆及其序列分析

旨在从分子生物学角度进一步研究鸡免疫刺激因子白细胞介素2(IL-2),探究IL-2蛋白结构。根据GenBank发表的IL-2序列设计引物扩增IL-2基因,将其克隆到p GM-T载体后进行鉴定,鉴定正确的pT-IL-2重组质粒,然后对其进行序列分析。应用生物信息学软件对IL-2序列进行跨膜区、磷酸化位点、氨基酸序列、开放阅读框进行分析和IL-2蛋白的三级结构进行预测。核苷酸序列测定结果表明:IL-2基因片段为430 bp,编码143个氨基酸。生物信息学分析结果表明:本实验获得的IL-2基因编码的蛋白质中含有1个丝氨酸和3个苏氨酸,这可能成为蛋白激酶磷酸化的位点。IL-2蛋白可能在5~28位含有跨膜区。其蛋白二级、三级结构预测结果显示其属于亲水性蛋白,多为α-螺旋、β-转角和N端无规卷曲结构。该结果为IL-2的分子生物学探究奠定了基础。     

小麦衰老相关基因TaSAG39的生物信息学及表达模式分析

半胱氨酸蛋白酶是蛋白质降解过程中的一类水解酶,参与植物的衰老与成熟,在植物生长发育过程中发挥重要作用。基于前期得到的小麦衰老阶段转录组数据中筛选到一个衰老特异的半胱氨酸蛋白酶(SAG39),为了研究TaSAG39基因在小麦衰老过程中发挥的作用,采用生物信息学分析方法和实时荧光定量(qRT-PCR)技术对TaSAG39的基因结构和表达模式进行分析。结果表明,其氨基酸序列与小麦祖先种节节麦、野生二粒小麦以及硬粒小麦亲缘关系最近,含有木瓜蛋白酶亚家族特有的活性位点Cys-His-Asn以及EFNIN结构。TaSAG39-5A、TaSAG39-5B、TaSAG39-5D基因组全长分别为1 455,1 435,1 439 bp,编码序列长分别为1 041,1 050,1 038 bp,均含2个外显子和1个内含子;其编码的蛋白分别由346,349,345个氨基酸组成,分子质量约37 ku,等电点5.53～5.67,为稳定的带负电的亲水性蛋白;主要构成元件为无规则卷曲和α-螺旋,在蛋白质N段含有信号肽,具有保守的Inhibitor＿I29和Peptidase＿C1结构域,含有35～37个磷酸化位点,...