中国水仙R2R3-MYB基因NtMYB5的克隆和功能研究

为研究中国水仙（Narcissus tazetta var. chinensis）中类黄酮代谢途径的调控网络,从其转录组中筛选出1条R2R3-MYB基因并从花瓣cDNA中克隆其编码区全长序列,命名为NtMYB5。NtMYB5开放阅读框为681 bp,编码226个氨基酸。蛋白多重序列比对分析发现NtMYB5含有R2和R3结构域以及1个pdLNLD/ELxiG/S氨基酸基序;系统进化树分析表明,NtMYB5与花青素合成抑制因子亲缘关系最近;通过对NtMYB5在中国水仙中的表达检测发现,其表达量在花器官中较高,且随花开放逐渐上升;在烟草瞬时表达中,NtMYB5显著抑制花青素合成促进因子StMYB的效果;转NtMYB5烟草花瓣颜色变浅,qPCR检测表明NtMYB5抑制类黄酮代谢途径大部分结构基因表达。NtMYB5为中国水仙中花青素合成抑制因子。     

过量表达杜鹃红山茶CaAPX1的烟草耐热性提高

根据山茶(Camellia japonica)同源序列设计特异性引物,利用同源克隆和3′,5′-RACE技术,从杜鹃红山茶(C.azalea)嫩叶组织中克隆出抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)基因,命名为CaAPX1(Gen Bank登录号:KP635267),基因全长1 097 bp,开放阅读框753 bp,编码250个氨基酸。实时荧光定量分析发现,CaAPX1在4种不同的山茶中均得到表达,其中较耐热的微花连蕊茶(C.minutiflora)表达量最高,其次是中等耐热的杜鹃红山茶和‘耐冬’山茶(C.japonica‘Naidong’),最低的为耐热性较差的‘恨天高’云南山茶(C.reticulata‘Hentiangao’)。结果表明该基因的表达量高低与测试物种的耐热性有关。CaAPX1在杜鹃红山茶4种组织中均得到表达,表达量由高到低依次为:叶片、花蕾、种胚、花芽,其中叶片表达量高达其他组织的1.29~4.26倍。CaAPX1转基因烟草分析表明,过量表达CaAPX1后,APX酶活性提高了2.58~3.81倍,抗坏血酸(Ascorbate,AsA)含量也提高了2.67~3.56倍,并且转基因烟草植株及其种子的耐热能力也提高。     

甜樱桃MADS box基因的克隆与表达分析

 以甜樱桃‘拉宾斯’（Prunus avium L.‘Lapins’）为试材,采用RT-PCR结合RACE技术,克隆获得1个与花发育相关的MADS box基因,命名为PaMADS3,其在GenBank中的登录号为HQ229605。PaMADS3基因全长1 095 bp,包含1个723 bp的开放阅读框,推断其编码240个氨基酸。序列分析表明：PaMADS3蛋白与拟南芥中的SEP蛋白高度同源。组织特异性表达显示PaMADS3基因在花瓣、雄蕊、心皮中表达。实时定量RT-PCR分析表明,花芽露绿期的离体枝条经过15和25 ℃处理后,其雌蕊中PaMADS3基因在25 ℃的表达量高于在15 ℃的表达量。     

牡丹查耳酮合酶基因Ps-CHS1的克隆及其组织特异性表达

以牡丹（Paeonia suffruticosa）品种‘彩绘’为试材,采用RT-PCR和RACE方法从花瓣中获得了一个牡丹查耳酮合酶（chalcone synthase,CHS）基因cDNA全长,命名为Ps-CHS1,GenBank登录号为GQ483511。序列分析结果表明,Ps-CHS1全长1 475 bp,包含82 bp的5′非编码区、208 bp的3′非编码区和一个长度为1 185 bp编码394个氨基酸的开放阅读框。氨基酸序列分析显示该基因编码的蛋白具有CHS家族保守存在的所有功能活性位点和特征多肽序列。序列比对和系统进化分析表明,Ps-CHS1与杨柳科、锦葵科、蔷薇科等植物的CHS亲缘关系较近,相似性达90%以上。相对荧光定量PCR分析表明,Ps-CHS1在花瓣中的表达量最高,其次是萼片,再次是叶片和雄蕊,在心皮中表达量最低。     

水仙红色副冠形成机理的初步研究

 以中国水仙（Narcissus tazetta var. chinensis）‘金盏银台’和喇叭水仙（N. pseudonarcissus L.） ‘粉红魅力’为材料，通过定量PCR 分析比较了类胡萝卜素合成途径主要结构基因在‘金盏银台’黄色 副冠和‘粉红魅力’红色副冠中的表达；使用透射电镜观察‘粉红魅力’红色副冠以及‘金盏银台’黄 色副冠、白色花瓣中有色体的超微结构；克隆了中国水仙有色体类胡萝卜素相关蛋白（CHRC）基因并分 析其在不同组织中的表达。研究结果表明，‘粉红魅力’副冠呈现红色是一系列结构基因表达发生变化 的结果，其中LYCE 表达量降低是红色副冠中累积β–胡萝卜素的关键；红色和黄色副冠中有色体都为膜 状有色体，副冠呈现红色与细胞中有色体的结构和数量无关，但红色副冠有色体中存储类胡萝卜素的质 体球数量较多，这与其CHRC 的表达量增强，有色体累积β–胡萝卜素的能力增强相关。研究还发现‘金 盏银台’白色花瓣中有色体结构与其黄色副冠明显不同，有色体数量少，且有色体内质体球体积小、数 量较少。研究结果将为阐明水仙花色形成机理以及利用基因工程技术改良中国水仙花色提供依据。     

牡丹ACC氧化酶基因cDNA克隆及全序列分析

 以牡丹品种‘洛阳红’（Paeonia suffruticosa 'Luoyang Hong'）花瓣为材料,用CTAB法提取总RNA,根据已报道的ACC氧化酶（1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase,ACO）保守氨基酸序列设计简并引物,通过RT-PCR扩增得到1条821 bp的牡丹ACO基因同源片段。利用该已知中间序列,通过快速扩增cDNA末端技术(Race)及序列拼接,最终得到该基因cDNA全长序列,命名为Ps-ACO1,GenBank登录号为DQ337251。分析结果表明,Ps-ACO1 cDNA全长1 221 bp,包含一个939 bp的开放读码框,5'非翻译区长65 bp,3'非翻译区长117 bp,编码产物为含有312个氨基酸残基的蛋白质。氨基酸序列与烟草、苹果、桃等植物的ACO同源性都达80%以上。     

柿花发育相关的MADS2box基因克隆与表达

以雌花型柿(Diospyros kaki) ‘阳丰’花为试材, 克隆得到一个与其花发育相关的MADS2box基因, 命名为DkMADS1, GenBank登录号为DQ412058。该基因cDNA全长1 193 bp, ORF为747 bp, 编码一个含有249个氨基酸的蛋白。DkMADS1 具保守的MADS区及半保守的K区, 与其它植物中的MADS2box蛋白有很高同源性。RT-PCR表达分析表明, 该基因在‘阳丰’花的萼片、花瓣、子房和‘禅寺丸’的雄蕊中均有表达。     

葡萄VvACO1的表达及在拟南芥和番茄中的遗传转化

采用RT-PCR方法从葡萄（Vitis vinifera）叶片中克隆到1个ACC氧化酶（ACC Oxidase,ACO）基因,命名为VvACO1。序列分析表明,VvACO1的开放阅读框长度为957 bp,编码318个氨基酸,具有亮氨酸拉链、Fe²⁺结合基序和抗坏血酸结合位点等ACO蛋白的典型结构域;与烟草和番茄的ACO蛋白的相似度分别为87%和84%。组织特异性及乙烯诱导表达结果表明,VvACO1在葡萄叶片、卷须、幼茎、果实、花序、须根以及腋芽等组织中差异表达,并受到乙烯利的诱导上调表达。过表达VvACO1的番茄开花期及果实成熟期提前,过表达VvACO1的拟南芥叶片光合效率和叶绿素a的荧光强度明显下降。     

菠萝AcSERK15’上游区(-499/+258bp)转录活性的研究

【目的】探究Ac SERK1启动子的功能,有助于了解Ac SERK1的表达调控模式。【方法】以‘神湾’菠萝(Ananas comosus L.‘Shenwan’)为材料,将Ac SERK1启动子缺失序列与GUS融合,构建植物表达载体,并导入根瘤农杆菌GV3101中。利用农杆菌真空渗透法侵染烟草叶片,并检测GUS活性;利用浸染法转化菠萝胚性愈伤组织获得转基因植株,分析光照、2,4-D和4℃等处理后的GUS表达量。【结果】构建2个Ac SERK1启动子植物缺失表达载体,分别命名为p(-30/+258 bp)和p(-499/+258 bp)。烟草瞬时表达结果显示p(-499/+258 bp)表现出强的GUS活性,p(-30/+258 bp)表现出微弱的GUS活性。q RT-PCR结果表明,光照处理后,GUS表达量降低。相反的,2,4-D和4℃处理转基因菠萝植株后GUS表达量均显著增加。【结论】Ac SERK1启动子-499/-30 bp区段内含有光、生长素和低温响应元件。     

桂花OfNCED3调控转基因烟草叶片类胡萝卜素和叶绿素的合成

从桂花（Osmanthus fragrans）‘堰虹桂’转录组数据库中筛选获得OfNCED3基因序列。氨基酸序列分析发现OfNCED3具有NCED家族特有的2个保守结构域MIAHPKxDP和HDFAITE以及4个保守的组氨酸残基。进化树分析发现OfNCED3与番茄SlNCED1聚为一支。实时荧光定量PCR结果表明，桂花开放过程中，Of NCED3在类胡萝卜素含量较高的‘堰虹桂’花瓣中的表达量显著低于类胡萝卜素含量较低的‘玉玲珑’，推测OfNCED3可能与‘堰虹桂’和‘玉玲珑’花瓣中类胡萝卜素含量差异有关。通过农杆菌介导的遗传转化方法获得过表达OfNCED3烟草株系。利用分光光度计和超高效液相（ultra high performance liquid chromatography,UPLC）测定叶绿素、类胡萝卜素和ABA的含量，并采用实时荧光定量PCR分析类胡萝卜素通路上相关基因的表达差异，结果发现异源过表达Of NCED3导致转基因烟草叶片中叶绿素和类胡萝卜素含量下降，ABA含量增加，类胡萝卜素合成基因的表达量明显上调，且下游合成基因上调幅度高于上游合成基因。本研究表明Of NCED...     

水仙温度诱导脂质运载蛋白基因NtTIL的克隆与表达分析

采用PCR法,从水仙（Narcissus tazetta var. chinensis）鳞茎主芽中分离克隆到1个温度诱导脂质运载蛋白基因NtTIL。该基因含有567 bp开放阅读框,编码188个氨基酸。该基因属于lipocalin-2 superfamily基因家族;推导的氨基酸序列含有SCR1、SCR2和SCR3 3个植物lipocalin的典型结构域,与小麦、拟南芥等植物的同源性大于75%;编码的蛋白为稳定酸性亲水蛋白,不含有信号肽,进行N末端朝外由外到内的跨膜运动。qRT-PCR结果分析表明,水仙生长发育过程中鳞茎膨大期NtTIL表达量较低;休眠期表达量先升高后降低。推测NtTIL对水仙鳞茎主芽休眠具有一定调控作用。     

中国水仙NTMADS1基因表达分析及转化拟南芥研究

 利用RT-PCR技术分析了中国水仙（Narcissus tazetta var.chinensis）花器官特征基因NTMADS1在花期不同器官及花不同部位的表达模式。结果表明，该基因只在花器官中表达，且在雄蕊和副冠中的表达量高于雌蕊，在花瓣中未检测到该基因的表达。将该基因置于CaMV 35S启动子控制下，构建到载体pBI121的多克隆位点，获得了包含35S启动子、NTMADS1基因的编码区和NOS终止区域的植物表达载体。在农杆菌介导下将该基因转入模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）中，获得了卷叶、花期提早和花型改变的转基因植株。     

百合LfMADS基因植物表达载体的构建及其功能分析

 为了分析百合LfMADS1和LfMADS3基因的功能，分别将其正、反义基因插入到植物组成型双元载体pBin438中，并通过根癌农杆菌LBA4404介导转化烟草。PCR和PCR-Southern杂交结果均证明外源基因已经插入到烟草基因组中。转LfMASD1反义基因植株中1朵花的雄蕊极短、花药缺失；转LfMASD1正义基因植株中发现1个花萼变瓣的突变体。在转LfMASD3反义基因植株中发现1个植株的苞叶部分瓣化，花柄变短，另外1个植株上发现1朵花缺失1枚雄蕊；而转LfMASD3正义基因植株中没有发现变异。作者认为LfMASD1是百合花器官发育的B功能基因，LfMASD3是百合花器官发育的SEP基因，这些基因在烟草中的表现说明百合的花器官特性基因的表达模式与模式植物有所不同。     

中国水仙3个特异种质的分子细胞遗传学分析

 应用荧光原位杂交技术进行rDNA在黄花水仙和两色花水仙染色体上的定位研究,并分析了两色花水仙的基因组成。结果表明：不同材料的NOR位点表现出多态性,即黄花水仙上具3个45S rDNA位点,两色花水仙具有5个位点;5S rDNA在位点和数量上表现出一致性。基因组荧光原位杂交结果表明两色花水仙的染色体有10条来自于黄花水仙,22条来自于白花水仙。根据rDNA在这些种质资源上的分布,结合GISH技术的分析,证实两色花水仙是黄花水仙和白花水仙的天然杂交种。     

中国水仙NtPLATZ1正、反义植物表达载体构建及转化烟草的研究

通过构建中国水仙锌指蛋白基因NtPLATZ1正义和反义两种植物表达载体,并用冻融法将其导入农杆菌EHA105菌株,介导遗传转化烟草,对遗传转化的烟草再生植株进行PCR-Southernblot和RT-PCR检测,研究NtPLATZ1的功能。结果表明成功将NtPLATZ1转化烟草,获得5株阳性转基因植株。NtPLATZ1在转基因烟草中过表达能抑制烟草的生长,抑制表达可促进烟草生长。     

换锦花LsMYB4基因的克隆与表达分析

以换锦花（Lycoris sprengeri）为材料,采用RT-PCR方法和RACE技术相结合的方法,从花瓣中克隆了MYB基因的cDNA全长序列,命名为LsMYB4。该序列全长793 bp,包含606 bp完整开放阅读框,编码201个氨基酸,具有明显的R2R3-MYB结构域,与中国水仙NtMYB相似性达96%。实时荧光定量PCR分析结果表明,LsMYB4在换锦花不同组织和不同花期均有表达,其中在花瓣中的相对表达量比叶中多9 ~ 10倍,在盛花期的相对表达量比花苞期多20倍。不同花色无性系花瓣中表达量存在差异,花色较浅的无性系高于其它无性系,推测LsMYB4在调控换锦花花色形成的过程中起着负调控作用。     

石蒜黄烷酮3–羟化酶基因LrF3H 的克隆及表达分析

 采用RT-PCR 和RACE 技术相结合的方法,从石蒜花瓣中克隆到1 个黄烷酮3–羟化酶（F3H） 基因的cDNA 全长序列,全长1 293 bp,包含1 098 bp 的完整开放阅读框,编码365 个氨基酸;氨基酸序 列比对显示该序列编码的氨基酸与水仙的F3H 具有高达91%的同源性,将其命名为LrF3H。二级结构预 测表明,随机卷曲是LrF3H 蛋白最大量的结构元件,而α–螺旋和延伸链散布于整个蛋白中。保守结构 域预测表明该基因编码的蛋白具有典型的F3H 蛋白功能结构域,其保守结构域中含有铁离子及2–O–酮 戊二酸结合位点,属于2OG-FeⅡ_Oxy 双加氧酶超家族。实时荧光定量PCR 分析表明,LrF3H 在整个花 发育过程中均表达,而且从初蕾期到盛开期随着花瓣着色加深表达量逐渐增加,盛开期表达量最高,之 后随着花朵萎蔫表达量下降;在不同器官中,LrF3H 的表达量在花瓣和花葶中最高,而在根、鳞茎和叶 片中都很低,推测该基因在石蒜花色形成过程中起着关键作用。     

鹤望兰ζ–胡萝卜素脱氢酶基因SrZDS的克隆及表达分析

采用RT-PCR和RACE方法从鹤望兰(Strelitzia reginae Banks)黄色花萼中克隆到1个ζ–胡萝卜素脱氢酶基因(Sr ZDS)。其c DNA全长2 111 bp(Gen Bank收录号:KT428724),具有完整的开放阅读框,共1 710个碱基。与其他物种的氨基酸序列都有一定的同源性,其中与玉米的ZDS同源性最高,达到86%。系统进化树分析显示,Sr ZDS与水仙蛋白亲缘关系较近。荧光定量PCR分析表明:Sr ZDS在鹤望兰黄色花萼中高表达,且在花发育的始花期和盛花期表达量最高。应用UPLC对其类胡萝卜素含量进行分析,其总量在黄色花萼中最高,且在盛花期最高,表明Sr ZDS的表达与类胡萝卜素含量成正相关。     

矮牵牛花发育相关基因PhTs2的克隆及功能分析

从矮牵牛‘幻想’中克隆了花发育相关基因PhTs2，该基因CDS长855 bp，编码284个氨基酸，具有保守的adh-short结构域。进化分析表明，PhTs2蛋白与同科植物烟草和番茄的同源蛋白亲缘关系较近。实时荧光定量PCR分析发现该基因在矮牵牛花药发育的早期特异性表达。为分析其功能，构建PhTs2超量表达载体，转化了烟草，并对转基因烟草进行了鉴定：表型观测发现其花药形态异常，花粉数量减少；花粉活力和萌发率极显著降低；扫描电镜观测发现其花粉粒畸形，外壁纹饰不规则；半薄切片显示其绒毡层发育过程紊乱。该研究为培育雄性不育系提供了潜在的基因资源。