棉花根部拮抗枯萎病菌或黄萎病菌的可培养内生细菌多样性分析

为解析棉花内生细菌的种群结构,更好地开发利用生防内生细菌,以棉花枯萎病菌、黄萎病菌为指示病原真菌,对常抗棉和泗棉3号根部分离获得的内生细菌进行拮抗活性筛选,获得87株至少对其中1个指示病原真菌具有拮抗作用的内生细菌。ARDRA分析(Amplified ribosomal DNA restriction analysis)和16S r DNA序列测定表明棉花根部可培养内生拮抗细菌可分为13个ARDRA类群,分属于芽孢杆菌属(Bacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、农杆菌属(Agrobacterium)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium)、不动杆菌属(Acinetobacter)和假单孢菌属(Pseudomonas)7个属。其中常抗棉根部内生拮抗细菌分属于芽孢杆菌属、短芽孢杆菌属、伯克霍尔德氏菌属和农杆菌属,而泗棉3号根部内生拮抗细菌则分属于芽孢杆菌属、伯克霍尔德氏菌属、中华根瘤菌属、不动杆菌属和假单孢菌属,二者的优势种群都是芽孢杆菌属细菌。BOX-PCR分析显示这些内生拮抗细菌具有丰富的遗传多样性。通过测定这些内生拮抗细菌对棉花黄萎病菌和棉花枯萎病菌的拮抗力大小,以及是否具有产纤维素酶、几丁质酶、蛋白酶和嗜铁素的活性,表明这些内生拮抗细菌具有不同的生防作用机制。     

三明水稻-烟草轮作土壤细菌群落多样性比较

为了比较福建三明地区不同水稻-烟草轮作土壤细菌多样性及群落结构,认识三明水稻-烟草轮作土壤微生物资源多样性,对不同土壤样品中细菌类群进行分析。通过构建细菌16S r DNA克隆文库,对将乐砂壤土、将乐壤土、宁化砂壤土和宁化壤土细菌多样性和群落结构进行分析和比较。结果表明:4个土壤样品中的细菌类群包括厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)等11个类群,将乐2个土壤样品中厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)是优势类群;宁化2个土壤样品中变形菌门(Proteobacteria)和酸杆菌门(Acidobacteria)为主要优势菌门。香农-维纳指数(H′)和辛普森指数(D)表明,壤土细菌多样性高于砂壤土。通过构建细菌16S r DNA克隆文库揭示了三明水稻-烟草轮作土壤中细菌多样性十分丰富,这为初步掌握三明水稻-烟草轮作土壤中细菌种类和组成状况提供了一定的参考依据,也为进一步开发利用该地区水稻-烟草轮作土壤微生物资源提供科学的依据。     

重病田和无病田棉花根组织中细菌群落结构的差异

为了研究黄萎病菌侵染条件下内生细菌群落结构多样性变化,以不同时期健康棉株和感染黄萎病菌(Verticillium dahliae)的棉株根部组织为材料,提取样品总DNA,扩增内生细菌16S r DNA的V3可变区,将扩增产物进行变性梯度凝胶电泳分析,并对21个优势条带进行切胶回收、克隆测序,构建系统发育树。结果表明:不同时期发病棉株和健康棉株样品可以聚成2大类,一是苗期和蕾期的根部样品,二是初花期和结铃期的根部样品;感染黄萎病棉株内生细菌种类多样性下降;BLAST比对结果发现21个克隆序列与Gen Bank数据库中已知16S r DNA基因序列同源性很高(99%~100%),绝大多数属于变形菌门(Proteobacteria),占总克隆序列的80.95%,其他不可培养细菌占19.05%。说明黄萎病菌的侵染能明显影响内生细菌群落结构多样性。     

辣椒内生固氮菌的分离鉴定与多样性分析

通过分离湖南省不同地区辣椒的内生固氮菌,探索其多样性,为内生固氮菌资源应用于现实生产提供理论依据。利用改良无氮培养基对辣椒的根、茎、叶中内生固氮菌进行分离和纯化,并进行菌落计数比较其菌群密度,再对分离出的菌株进行16S rDNA序列扩增,分析其多样性,最后通过乙炔还原法结合气相色谱法测其固氮酶活性。结果筛选到内生固氮细菌30株,经16S rDNA序列刚定和分析,结果显示土壤杆菌属(Agrobacteriumsp.)、根瘤菌属(Rhizobium sp.)、泛菌属(Pantoeasp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)相对频率较高,是辣椒内生固氮菌的优势种。经乙炔还原法测定固氮酶活性表明,该30株菌株均具有较弱固氮酶活性,范围为4~183nmol/(mL.h),且不同地区同种菌的固氮酶活性存在一定差异。     

蝴蝶兰根内生细菌的分离及可分泌IAA细菌的筛选

为从蝴蝶兰(Phalaenopsis amabilis)根部分离出可分泌吲哚乙酸(Indole-3-acetic acid,IAA)的内生细菌,通过探讨蝴蝶兰根部表面消毒的最佳条件,采用分离培养法、生理生化实验和16S rDNA分析,对蝴蝶兰根部出内生细菌进行研究。结果表明,NA培养基分离出的6株细菌分别属于短杆菌属(Brevibacterium)、伯克氏菌属(Burkholderia)、Dyella和类芽胞杆菌(Paenibacillus);R2A培养基分离出的20株细菌分别属于伯克氏菌属(Burkholderia)和Dyella;分离获得的26株内生细菌中,具有分泌IAA的功能有23株,占分离总菌数的88.5%。综合来看,蝴蝶兰根中存在可分泌IAA不同种属的内生细菌,为进一步研究内生细菌与蝴蝶兰植物之间的相互作用提供了菌种资源。     

基于高通量测序的不同轮作方式下烟田土壤细菌群落组成分析

在自然界中,土壤微生物与植物之间存在着密切的联系,土壤微生物依赖植物提供的养分而生存,同时对植物的生长发育起着促进作用。本研究利用Illumina Hi Seq高通量测序技术,提取西双版纳烟田烟草连作、田菁轮作和青蒿轮作3种种植模式下土壤样品的总DNA,通过PCR方法扩增构建16S r RNA基因文库。结合生物信息学方法分析土壤细菌16S r RNA基因V3~V4区的多样性指数、群落结构等,以确定烟田更好的种植模式。所有样本共测序分析获得4 898个细菌分类单元OTU,经琢多样性和茁多样性分析表明3个处理下细菌群落多样性存在显著差异,并且在对照组中的细菌群落丰富度最高,青蒿轮作中的细菌群落丰富度最低。样本中优势门类为变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和绿弯菌门(Chloroflexi),其中变形菌门(Proteobacteria)相对丰度33.49%占绝对优势。优势属类为硝化螺旋菌属、Kaistobacter、红游动菌属和黄杆菌属,可促进氮素转化的硝化螺旋菌属在田菁中的相对丰度最高,烟株青枯病致病菌罗尔斯通菌属在青蒿轮作中相对丰度最低;拮抗黑胫病的假单胞杆菌属在青蒿轮作中相对丰度最高。本研究将对烟草轮作方式和轮作作物的选择提供分子层面的支持。     

四个玉米自交系根系内生细菌的分离和鉴定

对4个玉米自交系(PH4CV、PH6WC、郑58和昌7-2)根系中的内生细菌进行分离和鉴定,为获得有益微生物资源奠定基础。通过形态学观察、生理生化特征鉴定及16S r DNA基因序列同源性分析和构建系统发育树等方法对分离菌株进行生物学鉴定,以确定其种属。共分离到23株内生细菌,鉴定为6个属,包括芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas sp.)、肠杆菌属(Enterobacter sp.)、贪噬菌属(Variovorax sp.)、鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium sp.),其中优势属为芽孢杆菌属。4个玉米自交系内生细菌的种类不同,细菌种类由多到少依次是PH6WC、郑58、PH4CV和昌7-2。通过对不同玉米自交系内生细菌的比较分析,发现内生细菌的种类和数量与玉米基因型相关。     

高原作物青稞根及根际内生细菌群落结构的高通量分析

利用高通量测序技术分析了西藏青稞主栽品种藏青2000根及根际内生细菌的16S V4变异区序列,同时应用UparseRON、KA等软件整理和统计样品序列数和操作分类单元（OTU）数,分析物种丰度及Alpaha多样性等指标。获得的用于分析青稞根部内生细菌的有效序列和OTUs为55 192/3 613,用于分析青稞根际土壤内生细菌的有效序列和OTUs为62 181/4 399;根部及根际土壤Chao1指数分别为3 443.4290和4 632.5820,shannon多样性指数分别为8.542和9.967。在门水平对代表性OTU进行注释发现,青稞根及根际土壤内生细菌主要是变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、放线菌门（Actinobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）。在属水平上主要是假单胞菌属（Pseudomonas）、链霉菌属（Streptomyces）、土地杆菌属（Pedobacter）、黄杆菌属（Flavobacterium）、红游动菌属（Rhodoplanes）。结果显示,青稞根及根际内生细菌具有丰富的多样性,且二者的优势菌属一致。     

基于高通量测序的金钗石斛种子内生菌群落结构组成分析

本研究基于免培养和高通量测序技术,对金钗石斛种子内生菌16 S rDNA V 4区和ITS 1区扩增序列进行分析,揭示内生菌的组成和丰度。结果表明:扩增的内生细菌16 S rDNA序列归为13 OTUs,隶属于变形菌门(Proteobacteria)和蓝细菌门(Cyanobacteria);其中变形菌门为优势门,泛菌属(Pantoea)为优势属;香农指数、辛普森指数和Chao 1指数分别为1.82、0.69和11.00。内生真菌序列归为14个OTUs,隶属于子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)和接合菌门(Zygomycota);其中子囊菌门为优势门,德巴利酵母属(Debaryomyces)为优势属;香农指数、辛普森指数和Chao1指数分别为0.57、0.79和14.13。金钗石斛种子的内生细菌与内生真菌具有一定的多样性。此研究为进一步促进金钗石斛种子萌发及幼苗栽培具有一定的指导意义。     

海南辣椒尖孢镰刀菌拮抗内生细菌的分离与鉴定

为了获得对辣椒尖孢镰刀菌具有较好防治效果的内生细菌,课题组于2022年1～3月份在海口、定安、澄迈、临高和陵水等海南辣椒主产区采样,并从健康辣椒样品中分离获得内生细菌192株,其中39株对辣椒尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum) CMTT4-1有拮抗作用,分别来源于根系(23株)、茎秆(2株)、叶片(8株)和果实(6株),有拮抗作用菌株占比20.31%,抑菌率为10.68%～59.02%。通过形态学和16S rDNA序列测定及同源性分析,初步鉴定芽孢杆菌属(Bacillus spp.)细菌36株、短杆菌属(Brevibacterium spp.) 1株、农杆菌属(Agrobacterium spp.) 1株和假单胞菌属(Pseudomonas spp.) 1株。研究结果为辣椒枯萎病的生物防治提供了菌株来源。     

患根肿病的上海青根内生菌组成和结构的研究

旨在优化植物根内生菌高通量测序分析技术,更好地解析健康与患根肿病上海青根内生菌之间的差异。采用高通量测序方法,对其16S rDNA的V3-V4区进行扩增,并通过合适的软件和数据库进行菌群分析。结果表明,植物内生菌受植物叶绿体DNA的干扰大,平均叶绿体数据占67%。上海青根内生微生物菌群具有丰富的多样性,主要由变形菌门、放线菌门、拟杆菌门和厚壁菌门细菌组成,优势种群为假单胞菌,根瘤菌,芽孢杆菌,以及链霉菌等。健康样品的稳定性较好,不同患根肿病样品之间菌群比例差异较大。研究显示,根肿病侵染对上海青根内生菌群的结构和组成有较为显著的影响。     

含羞草、山蚂蟥等几种豆科植物根瘤菌的数值分类及16S rDNA PCR-RFLP分析

为揭示云南省豆科植物根瘤菌的资源多样性,采用数值分类、16S rDNA PCR-RFLP和16S rDNA全序列分析技术对云南省8个地区含羞草、山蚂蝗等几种不同豆科植物分离的48株根瘤菌菌株进行了遗传和表型多样性研究。16S rDNA PCR产物经HinfⅠ、MspⅠ、RsaⅠ和HaeⅢ4种内切酶消化后产生22种遗传图谱类型;数据经MVSP3.0软件聚类后,所有供试菌株在70%的相似性水平上分为4个分支,经16S rDNA全序列分析,确定分支Ⅰ为伯克霍尔德属(Burkholderia)类群,含1株菌株;分支Ⅱ为贪铜菌属(Cupriavidus)类群,含5株菌株;分支Ⅳ为根瘤菌属(Rhizobium)类群,包括29株菌株;而分支Ⅲ没有和参比菌株聚在一起,经测序为狭长平胞属(Stenotrophomonas)类群。通过对菌株的抗生素抗性、耐盐性、生长温度范围、BTB产酸产碱反应以及对3-酮基乳糖利用情况共计28个表型性状测定,结果显示所有菌株耐盐性较强,多数菌株可耐受60℃的高温。实验表明,分离自云南省的这些菌株具有丰富的遗传和表型多样性。     

灯盏花内生细菌分离及其鉴定

为了解决灯盏花资源紧缺问题,对灯盏花植株及其根际土壤内生细菌进行分离鉴定。利用纯培养方法分离植物内生细菌,根据菌株形态及16S rRNA基因序列系统发育分析对分离到的内生细菌进行鉴定。结果表明获得内生细菌共100株,植株中分离得到62株、土壤中分离得到38株,其中芽孢杆菌属(Bacillus)和假单孢属(Pseudomonas)为灯盏花和根际土壤内生细菌的优势属,分别占总数的55%、28%。表明灯盏花不同部位和根际土壤内生细菌的数量、分布和种群存有差异性,叶部和正常根际土壤中分离到的内生细菌种类最多。     

施钙对酸性红壤花生根系内生细菌群落结构的影响

花生是我国重要的油料作物,也是嗜钙作物。为了探讨施钙对种植在酸性红壤下的花生根系内生细菌多样性的影响,本研究对不同处理、不同生育期的花生植株根系内生细菌基因组进行16SrRNA基因V3–V4区深度测序,分析种植于酸性红壤中施钙处理和对照下花生植株根系微生物群落结构。结果发现,根系内生菌群落中克雷伯氏菌属(Klebsiella)与肠杆菌属(Enterobacter)在所有样品组中均为优势属且相对丰度较高;花针期不同处理下假单胞菌属(Pseudomonas)与赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus)在施钙组中相对丰度显著高于对照组,而劳尔氏属(Ralstonia)的相对丰度在施钙组中显著降低;Network共发生网络分析显示,施钙组根系内生菌的网络连接相对紧密。综上结果表明,花生根系内生菌群落组成受施钙处理和植株生长发育共同影响,施钙能改变根系内生菌群落结构,提高花生植株应对病原菌侵袭。所得结果为今后通过施钙改良酸性土壤品质进而提高花生植株抗病能力提供了理论参考。     

低温条件下牛粪沼气产甲烷菌多样性初步研究

为了在低温条件下调查牛粪沼气产气高峰期的产甲烷菌菌群结构。采用分子生物学方法构建16S rDNA基因文库,随机分析文库中60个克隆的16S rDNA基因序列,研究了牛粪沼气池发酵液中产甲烷菌的菌群结构。结果表明,在60个克隆中,18个属于甲烷八叠球菌属（Methanosarcina sp.）与Methanosarcina spAK-16菌株同源程度最高,相似性为99%。7个属于甲烷八叠球菌科（Methanosarcinales）,15个属于甲烷鬃毛菌属（Methanosaeta）。利用MEGA 4.0软件分析60个克隆的16S rDNA序列,构建相应的系统进化树,结果显示,60个克隆子主要分为两大类群GroupA和GroupB。其中以属于甲烷八叠球菌属(Methanosarcina sp.)为主要类群,占全部克隆的42%,另一部分以甲烷鬃毛菌属(Methanosaeta)为主要类群,占25%。在整个发酵周期中到投料第18天达到产气最高峰。随着产气高峰期的过后,产气量逐渐下降。1个周期的总产气量504.91 mL 折合8 m3发酵罐产气量21.71 m3,其中甲烷气体总量为62%。分析低温（4℃）条件下以牛粪为主要发酵原料的沼气池产气高峰期的优势产甲烷菌群,结果发现甲烷八叠球菌属(Methanosaeta sp.)占总数的42%。     

烟草黑胫病拮抗细菌复合菌株的筛选与防治效果评价

从烟草根际土壤中筛选对烟草黑胫病菌(Phytophthora parasitica var. nicotianae)具有拮抗作用的细菌,并对拮抗菌株进行复配筛选,以期为烟草黑胫病的生物防治提供高效生防资源。从贵州省毕节市、四川省泸州市种植烟草的田地采集根际土壤样品,平板稀释法分离土壤细菌,平板对峙试验筛选对烟草黑胫病菌有拮抗作用的菌株,相容性试验测定亲和性较好的菌株组合,对获得的菌株和复配菌株进行进一步盆栽和大田试验,测定其对黑胫病的防治效果,并对拮抗效果较好的菌株进行16S rDNA鉴定。在采集到的17份土壤样品中共分离到247株细菌,初筛获得19株对烟草黑胫病菌有拮抗作用的菌株,相容性测定筛选出6株亲和性较好的拮抗细菌B3和B64、B41和B57以及L7和L47。进一步的抑菌、盆栽和大田试验表明以复配菌株B41B57和L7L47抑菌效果最佳,盆栽试验防治效果分别达到75.72%和77.95%,大田试验中防治效果分别达67.99%和71.40%,且复配菌株抑菌效果高于单一菌株。16S rDNA序列分析鉴定拮抗细菌B41为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),L7、L47为解淀粉芽孢杆菌(B. amyloliquefaciens),B57为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。复配菌株B41B57和L7L47对烟草黑胫病具有良好的防治效果,可作为烟草黑胫病生物防治的有效生防资源。     

不同表面消毒方法对核桃叶内生菌分离效果的比较

摘 要：【研究目的】表面消毒是植物内生菌分离的关键步骤之一,不同的表面消毒方法不仅会影响表面消毒效果,对内生菌的分离效果也有一定影响。本文分析比较了几种不同的表面消毒方法下分离获得的内生菌数量及种类。【方法】采用传统的分离方法,即真菌用组织块法,细菌用稀释梯度法进行分离。【结果】结果表明无论是内生真菌还是内生细菌二氧化氯方法处理下获得的内生菌种类最多。即二氧化氯法获真菌6株,鉴定为5个属,细菌37株,鉴定为11个属种（其中包括1个放线菌属）;次氯酸钠法获真菌8株,鉴定为3个属,细菌4株,鉴定为3个属种;升汞法获真菌3株,鉴定为3个属,细菌1株,为未知种。从分离内生菌的数量上比较,二氧化氯方法分离获得的细菌数显著性的多于其他两种方法,由多到少依次为二氧化氯法、次氯酸钠法、升汞法。【结论】二氧化氯表面消毒更适合进行内生菌多样性研究,但不同的表面消毒方法会获得不同的机会菌株。