假俭草R2R3-MYB基因家族的鉴定及其在干旱胁迫下的表达模式分析

R2R3-MYB家族是植物中最大的转录因子家族之一，广泛参与各种生理响应和分子调控。本研究利用假俭草(Eremochloa ophiuroides(Munro.))基因组数据和生物信息学手段鉴定了R2R3-MYB转录因子，并对系统进化、结构、顺式作用元件等进行分析；同时对R2R3-MYB转录因子响应干旱胁迫的表达模式进行分析。结果显示，假俭草中有113个R2R3-MYB成员；蛋白二级结构和三级结构都表明R2R3-MYBs蛋白都含有螺旋-转角-螺旋结构；顺式作用元件分析发现启动子区含有大量植物激素响应和胁迫响应元件，为R2R3-MYB基因进化分析提供了依据。基因表达模式分析表明，与野生型相比，抗旱突变体叶中有39个基因、根中有58个基因在一个或多个干旱时期表达量提高，推测这些R2R3-MYB基因在响应干旱胁迫过程中发挥着重要作用。本研究结果为进一步深入研究假俭草R2R3-MYB基因家族的功能奠定了基础。     

紫花苜蓿MsMYB58基因克隆及抗旱功能鉴定

干旱是限制紫花苜蓿(Medicago sativa)生长的重要环境限制因子，MYB转录因子广泛参与调控植物的生长发育和非生物胁迫。本研究对紫花苜蓿MsMYB58基因进行克隆及生物信息学分析，初步解析紫花苜蓿MsMYB58在干旱胁迫应答过程中的功能。结果显示，MsMYB58开放阅读框全长1 002 bp,编码蛋白含有333个氨基酸，分子量为37.80 kDa,属于典型的R2R3-MYB家族成员，定位在细胞核、细胞壁和细胞膜中。MsMYB58的组织特异性表达主要在茎中，在根中的表达最少；在脱落酸、盐和自然干旱处理中，MsMYB58的表达水平呈现不同的变化趋势。干旱胁迫下，过表达MsMYB58的转基因烟草的过氧化氢酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶的活性和脯氨酸含量显著增加，而丙二醛的含量则显著下降，叶绿素荧光参数PSⅡ利用效率和PSⅡ最大光化学量子产量显著升高，非光化学猝灭显著下降。本研究初步探究了紫花苜蓿MsMYB58在干旱胁迫应答过程中的功能，为进一步挖掘紫花苜蓿干旱响应功能基因提供理论基础。     

紫花苜蓿MsMYB33基因克隆、亚细胞定位及转录自激活检测

MYB(V-myb Avian myeloblastosis viral Oncogene Homolog)转录因子数量较多、功能多样，在植物的发育过程中起着十分重要的作用。为了探究紫花苜蓿(Medicago sativa)中MsMYB33基因的亚细胞定位及自激活特性，本研究从紫花苜蓿中克隆MsMYB33基因，该基因开放阅读框为1 641 bp,编码多肽含有546个氨基酸。遗传进化树显示MsMYB33蛋白与鹰嘴豆(Cicer arietinum)中的CaMYB33蛋白同源关系最高。将MsMYB33与黄色荧光蛋白(Yellow fluorescent protein, YFP)进行融合表达，结果显示：MsMYB33蛋白定位于细胞核。通过DNA重组技术成功构建pGBKT7-MYB33酵母表达载体，并转化到Y2HGold酵母菌中。酵母自激活检测结果显示，MsMYB33具有自激活活性，进一步分析发现激活区域位于C端。本研究为进一步研究紫花苜蓿MsMYB33基因及MYB转录因子家族提供了科学依据。     

白三叶TrMYB1R1全长克隆及转录表达分析

R1-MYB是MYB转录因子家族中的一亚类,可能参与植物非生物胁迫应答。通过RT-PCR和RACE技术,在白三叶(Trifolium repens)中成功克隆出一个MYB转录因子TrMYB1R1,基因全长1 403 bp,编码297个氨基酸残基。通过生物信息学分析,发现TrMYB1R1蛋白含有一个MYB结构域,属于MYB-related蛋白,保守域形成3个α-螺旋;亚细胞定位预测该蛋白可能位于细胞核中。同源进化分析结果显示TrMYB1R1蛋白和豆科植物MYB蛋白亲缘较近,蛋白进化符合植物进化分类。非生物胁迫和外源激素处理结果表明,该基因在白三叶根和叶中均受到诱导调节。在聚乙二醇(PEG)水分胁迫、镉胁迫、4℃冷处理及35℃高温处理下,白三叶TrMYB1R1表达受到抑制,且该基因对镉、冷及热处理响应强烈,对PEG处理响应较弱;而在NaCl胁迫处理下该基因受到诱导表达;同时,脱落酸(ABA)处理前期抑制TrMYB1R1表达,但细胞分裂素(CTK)显著诱导该基因表达。这些结果表明,该基因可能参与多种非生物胁迫应答并可能受激素调控,但对TrMYB1R1在白三叶中的功能及调控作用仍需进一步研究。     

全基因组水平紫花苜蓿TCP基因家族的鉴定及其在干旱胁迫下表达模式分析

紫花苜蓿是世界最重要的豆科牧草之一，干旱是影响其产量和地理分布的关键瓶颈。在紫花苜蓿响应干旱胁迫过程中，转录因子发挥着重要的调控作用。TCP（teosinte branchesd 1/cycloidea/pro-liferating cell factors）为植物特有的转录因子，在植物生长、发育、响应逆境胁迫中都具有重要的生物学功能。截至目前，该基因家族在紫花苜蓿中的分布以及响应干旱胁迫的生物学功能仍未见报道。因此，为进一步挖掘紫花苜蓿中响应干旱胁迫功能基因，本研究利用生物信息学方法在全基因组水平对TCP基因家族进行了鉴定，并对其系统进化、基因结构、染色体定位、共线性分析以及干旱胁迫下的表达模式进行了分析。结果表明，紫花苜蓿基因组中共鉴定出40个MsTCP基因，不均匀地分布于20条染色体上，其中包括17对旁系同源基因对，且都是基因片段复制事件。系统发育和保守结构域分析发现，MsTCP基因可以分为2个大分支和3个亚家族（PCF， CIN与CYC/TB1），同一分支中的成员具有相同氨基酸数目的TCP结构域，同亚家族中的成员具有相似的保守基序与基因结构。此外，通过分析紫花苜蓿响应干旱转录组数据共鉴定出4个可能与紫花苜蓿响应干旱胁迫有关的MsTCP基因（MsTCP23，MsTCP27，MsTCP29，MsTCP33）。qRT-PCR结果进一步表明PEG模拟干旱胁迫处理后，这4个基因的表达量在根和叶中均显著上调，进一步确定了这些基因的确响应紫花苜蓿干旱胁迫。该研究为后期深入解析紫花苜蓿响应干旱胁迫理论以及通过基因工程技术创制高抗旱紫花苜蓿新种质奠定基础。     

白羊草R2R3-MYB转录因子的挖掘及对干旱胁迫反应的研究

本文以白羊草（Bothriochloa ischaemum）为材料，利用其目前已有的转录组序列，通过搜索、比对、功能域多态性分析、进化树构建和基因表达分析等手段，对白羊草R2R3-MYB型转录因子进行挖掘和干旱胁迫下的表达模式分析。结果从白羊草挖掘出43个R2R3-MYB转录因子，它们具有高度保守的[W]-X（19）-[W]-X（19）-[W]-X（n）-[W]-X（18）-[W]结构，主要参与生长发育、次生代谢和逆境响应等生物过程。通过进一步的分析，本研究筛选出8个可能参与干旱胁迫响应的R2R3-MYB转录因子。这为白羊草R2R3-MYB基因的功能研究和开发利用奠定了基础。     

紫花苜蓿耐盐性相关NAC转录因子的挖掘及表达分析

NAC(NAM,ATAF1/2,CUC2)是植物特有的一类转录因子家族,可调控植物响应盐胁迫。本研究基于盐胁迫下紫花苜蓿(Medicago sativa L.)耐盐品种GIB和盐敏感品种LS根和叶的转录组数据,通过生物信息学方法筛选出17个差异表达的MsNAC转录因子家族成员,并对其序列特征、系统进化、顺式作用元件及盐胁迫下的表达模式等进行分析。结果显示,17个MsNACs均具有NAC典型的NAM结构域,且蛋白结构相似。系统进化分析将17个MsNACs分成8个亚族,各亚组成员具有高度相似的保守基序。顺式作用元件分析发现,有15个MsNACs具有ABA响应顺式元件ABRE。转录组数据表达模式分析与RT-qPCR验证结果显示MsNAC1,MsNAC2,MsNAC35,MsJUB1和MsNAC40基因在盐处理下GIB叶中上调表达,在LS叶中下调或者未发生变化,推测这些基因参与调控紫花苜蓿的耐盐反应。本研究为进一步研究紫花苜蓿NAC转录因子响应盐胁迫功能提供参考依据。     

紫花苜蓿CAMTA基因家族鉴定及其在非生物胁迫下的表达模式分析

钙调蛋白结合转录激活因子(CAMTA)是一类重要的钙调素结合蛋白,在激素信号转导、发育调控和环境胁迫耐受中发挥着重要作用。本研究采用生物信息学技术,基于紫花苜蓿“新疆大叶”参考基因组,对紫花苜蓿中CAMTA家族成员进行鉴定,并对这些基因的理化性质、系统发育树、保守结构域、染色体上位置、顺式作用元件、转录表达谱进行分析和验证。结果表明,共鉴定出17个MsCAMTA基因,MsCAMTA家族成员可划分为3个亚家族,亚家族成员在基因结构、保守基序位置上较为相似。染色体定位结果显示,MsCAMTA家族成员不均匀地分布在7条染色体上。启动子区具有大量响应低温、盐胁迫及植物激素信号相关的顺式作用元件。此外,采用RT—qPCR对盐(300 mmol·L^-1 NaCl)、模拟干旱(400 mmol·L^-1甘露醇)、低温(10℃)和脱落酸(100μmol·L^-1)处理下紫花苜蓿叶片中MsCAMTA1、MsCAMTA3、MsCAMTA11和MsCAMTA12的表达模式进行了初步研究。结果表明,4个MsCAMTA候选基因在各胁迫处理下均有一定程...     

千穗谷TALE转录因子家族的生物信息学分析

TALE转录因子广泛存在于植物中，对植物的生长发育和对外界环境的响应发挥着重要作用。本研究在千穗谷(Amaranthus hypochondriacus)基因组中共鉴定出11个TALE基因。系统发育分析将千穗谷TALE家族蛋白分为BELL和KNOX两个亚家族，同一亚家族中的AhTALEs基因具有相似的基因结构，编码蛋白也具有类似的结构域。蛋白二级结构和三级结构分析都表明AhTALEs蛋白由螺旋-角-螺旋的结构构成。此外，对千穗谷与其他物种的TALE基因共线性关系、组织表达特性和AhTALEs基因启动子区的顺式作用元件分析发现，不同AhTALEs亚家族在各组织中的表达模式不同，并且发现启动子区包含大量非生物胁迫和激素响应元件，这为AhTALE家族的进化分析提供了依据。qRT-PCR分析发现AhTALEs基因在低温和干旱胁迫下的表达水平有不同程度的变化，表明AhTALEs基因能够响应低温和干旱胁迫应答。本研究为开展千穗谷中TALE转录因子在非生物胁迫中的生物学功能研究提供了重要参考。     

Identification of CAX gene family and expression profile analysis of response to abiotic stress in alfalfa北大核心CSCD

Ca²⁺/H⁺反向转运蛋白（CAX）是一类重要的跨膜转运蛋白,在调控植物Ca²⁺平衡、抵抗非生物胁迫和转运重金属离子等方面具有重要作用。利用生物信息学方法在全基因组水平对紫花苜蓿CAX基因家族进行了鉴定,并对其理化性质、结构特征、系统进化关系、顺式作用元件、染色体定位等进行了分析。结果表明,在紫花苜蓿全基因组中共筛选鉴定出15个MsCAX基因,分布于紫花苜蓿15条染色体上,发生22对基因片段重复事件,编码367~460个氨基酸,等电点为5.2~6.5,且均表现为疏水性蛋白。系统进化关系分析结果表明,MsCAXs分为2个亚家族,同一亚家族成员具有相似的基因结构、保守基序和跨膜结构域数量。MsCAXs启动子区域存在光响应性、激素反应性和胁迫响应元件。利用qRT-PCR分析了6个MsCAXs基因在非生物胁迫下的表达模式,结果表明,在干旱和低温胁迫下,6个MsCAX基因均显著下调表达,在盐和盐碱胁迫下,3个MsCAX基因上调表达。说明在不同的非生物胁迫下,MsCAXs基因表现出不同的表达模式。研究结果为进一步探索紫花苜蓿CAX基因家族的功能提供了参考。     

白羊草BiMYB52基因的克隆及转基因拟南芥抗旱性表达分析

白羊草(Bothriochloa ischaemum)是一种耐旱的优良乡土草种。为了探索白羊草转录因子MYB的结构和功能,本研究以白羊草转录组测序中筛选出的一段对干旱胁迫响应表达量变化显著的MYB序列为基础,采用基于拓扑异构酶快速克隆法从白羊草中克隆了一个R2R3-MYB基因BiMYB52,该基因编码237个氨基酸。为了深入研究BiMYB52基因的抗旱性,利用染色体步移技术扩增出了BiMYB52启动子序列,构建了pCAMBIA1301-BiMYB52过表达载体,采用农杆菌介导的花序侵染法对拟南芥(Arabidopsis thaliana)进行遗传转化,然后对野生拟南芥和转基因拟南芥进行干旱胁迫处理。结果表明,干旱胁迫复水后,转基因拟南芥的存活率显著高于野生拟南芥,丙二醛(Malondialdehyde, MDA)含量是干旱胁迫后转基因拟南芥的显著低于对照,脯氨酸(Proline, Pro)含量则显著高于对照。由此推测BiMYB52基因可能增加了拟南芥对干旱胁迫的抵抗能力。这为白羊草抗旱育种提供候选基因和理论基础。     

羊草DREB转录因子的系统发育和功能研究

羊草是兼具经济价值和生态价值的重要牧草,具有耐寒、耐旱和耐盐碱的特点。在植物应对非生物胁迫的过程中,DREB转录因子起到关键作用。然而,目前在GenBank的核酸数据库和EST数据库中羊草仅有2条DREB序列,其中只有1个DREB基因的功能得到实验验证。本研究从羊草转录组测序数据中1次挖掘了26条DREB EST。用羊草EST和拟南芥基因组中DREB基因的蛋白序列构建了系统发育树, LcDREB21位于第4类群,是DREB2类转录因子基因。通过RACE,获得了LcDREB21编码区全长(Genbank登入号:JN860437)。荧光定量PCR结果表明,其表达受干旱和高盐诱导。另外,通过酵母单杂交实验证明了LcDREB21具有转录激活功能;通过表达GFP融合蛋白证明其专一性定位在细胞核中。总之,LcDREB21是一个具有转录激活功能和细胞核专一定位能力的转录因子,可能在植物应对干旱和高盐胁迫的过程中起作用。本实验结果丰富了羊草抗逆基因数据库,为植物改良提供了基因资源。     

全基因组水平蒺藜苜蓿CPP基因家族的鉴定及表达模式分析

CPP （cysteine-rich polycomb-like protein）基因家族是一类小转录因子，广泛存在于除酵母与原核生物外的各种生物体中，在植物生长发育及响应胁迫过程中具有重要作用。截至目前，CPP基因家族已在多个物种中被鉴定和研究，但在豆科模式植物蒺藜苜蓿中还未见报道。本研究采用生物信息学的方法，在蒺藜苜蓿中共鉴定出9个CPP基因。通过与3个物种CPP基因的蛋白序列构建系统发育树，将CPP基因分为3类，MtCPP成员与大豆的亲缘关系更接近。保守结构域分析表明MtCPP转录因子都具有1~2个CXC保守结构域。染色体定位分析得出，9个CPP基因分布在6条染色体上，并鉴定出2对旁系同源基因，均来源于片段重复事件。通过基因芯片技术检测MtCPP基因的表达模式结果显示，MtCPP基因的表达具有一定的时空特异性。MtCPP基因启动子中含有大量与激素以及胁迫相关的顺式作用元件，并且MtCPP2、MtCPP5、MtCPP6和MtCPP7基因具有响应干旱的表达特征，MtCPP2和MtCPP8基因具有响应盐胁迫的功能。该研究可为后期深入解析MtCPP基因家族功能和筛选参与苜蓿抗逆的MtCPP基因奠定基础。     

象草全基因组bHLH转录因子家族鉴定及表达分析北大核心CSCD

bHLH转录因子家族不仅参与了植物的生长发育,而且在植物响应逆境胁迫和次生代谢方面发挥着关键作用。在全基因组水平对重要饲草及能源植物象草的bHLH转录因子家族进行了鉴定及分析,并利用转录组数据及定量RT-PCR分析了象草bHLH转录因子对赤霉素(GA_(3))和多效唑(PAC)的响应。结果显示:在象草中共鉴定出229个具有完整保守结构域的bHLH基因家族成员(CpbHLH001~CpbHLH229),不均匀地分布于14条染色体上;系统进化分析结果表明,229个CpbHLHs可被分为18个亚类,其中C亚类的成员数量最多,为41个;此外,相同亚家族中的大多数基因具有相似的基因结构和保守基序;基于转录组数据的表达谱分析结果发现,多数bHLH基因在象草茎尖组织中均对GA_(3)和PAC有响应。随机挑选9个表达量较高的基因进一步通过qPCR进行验证。结果显示,经外源GA_(3)和PAC处理之后,这9个基因因不同处理而差异表达,表明这9个基因可能与GA_(3)和PAC介导的信号通路有关。综上所述,本研究为象草bHLH转录因子家族的生物学功能奠定了基础。     

紫花苜蓿花青苷合成的转录组分析

为探究紫花苜蓿（Medicago sativa）花色形成的分子机制，本试验以紫花苜蓿及其白花突变体为研究材料，进行转录组测序。结果表明：紫花和白花之间共有差异表达基因4 857个；代谢通路富集分析中，苯丙氨酸生物合成途径等6条代谢通路显著富集；研究还发现类黄酮合成通路中关键基因二氢黄酮醇4-还原酶（Dihydroflavonol 4-reductase，DFR）在白花突变体中的表达量显著下调，其启动子中存在MYB和bHLH等转录因子的结合位点；转录组以及荧光定量PCR的结果均表明：MYB，bHLH和WD40等基因的表达量都具有显著性差异。这些结果表明MYB转录因子或MBW复合物可能通过调控DFR的转录影响紫花苜蓿花色形成。本试验为探明紫花苜蓿花青苷合成的分子机制提供了理论基础。     

紫花苜蓿高温诱导启动子pMsMBF1c的克隆与功能分析

植物耐热性受复杂而精细的调控。热诱导启动子能经济、高效的激活或关闭耐热调节途径关键基因的表达,在植物功能基因组研究与现代分子育种技术中起十分重要的作用。以紫花苜蓿耐热候选基因MsMBF1c的编码序列为基础,采用酶切连接的方法分离获得了其上游1748bp序列,生物信息学分析发现该区域具有HSE与GATA结合位点等2个与植物耐热调节相关的保守模体,此外还有5个ABA应答元件(ABRE、MYB2、MIC2、CBF与DPBF)和2个MYB蛋白结合位点,说明MsMBF1c除了参与植物耐热性调节外,还可能参与其他抗逆性调节。构建pBI121-MsMBF1c::GUS双元载体转化野生型拟南芥,荧光定量分析热诱导后的转基因植物中GUS与AtMBF1c基因的表达发现其分别上调了5.4与4.8倍,并且高温诱导下转基因植株的组织化学染色分析同样证明MsMBF1c启动子显著受高温诱导。分离获得紫花苜蓿MsMBF1c启动子序列并转化拟南芥,并且从生物信息学、组织化学染色与基因表达等方面验证该序列能显著被高温诱导,为探讨紫花苜蓿耐热调控机制及通过分子生物技术改善紫花苜蓿耐热性提供理论支撑,最终为培育适应南方高温气候条件的紫花苜蓿新品种提供技术储备。