咯利普兰通过MAPK/ERK信号通路抑制中性粒细胞的黏附

【目的】研究磷酸二酯酶4(PDE4)特异性抑制剂咯利普兰抑制中性粒细胞黏附的有关分子机制,明确其抗炎的主要信号通路,为PDE4选择性中药抑制剂的药理研究提供参考。【方法】猪中性粒细胞的提取采用密度梯度离心法,中性粒细胞与猪内皮细胞的黏附采用虎红比色法,中性粒细胞黏附分LFA-1和Mac-1表达量的检测采用流式细胞技术,中性粒细胞p38MAPK、ERK等磷酸化活性检测采用western blot法。【结果】咯利普兰可显著抑制fMLP刺激的中性粒细胞和内皮细胞的黏附(P0.05),极显著抑制fMLP刺激的中性粒细胞LFA-1和Mac-1的表达(P0.01),阻断fMLP刺激的中性粒细胞ERK磷酸化活性(P0.01),而对p38MAPK磷酸化活性无显著影响。【结论】咯利普兰可抑制中性粒细胞和内皮细胞黏附,其机制与阻断中性粒细胞ERK磷酸化进而抑制LFA-1和Mac-1表达有关。     

犬中枢神经不同部位磷酸二酯酶基因表达和活性测定

为探明磷酸二酯酶(phosphodiesterase,PDE)在犬中枢神经活动中的作用,采用反转录聚合酶链反应检测18个PDE亚型在犬中枢神经不同部位中(大脑、小脑、延髓和脊髓各段)的表达分布,以高效液相色谱法检测环核苷酸在酶反应前后的含量变化,计算PDE活性。结果显示:在所测18个PDE亚型中,犬中枢神经的8个测定部位均有PDE1A,PDE1B,PDE1C,PDE2A,PDE3A,PDE3B,PDE4A,PDE4B,PDE4C,PDE4D,PDE5A,PDE7A,PDE7B,PDE8A,PDE8B,PDE9A,PDE11A表达,PDE10A均呈阴性表达,不同部位之间表达量差异较大,其中PDE4在各部位均呈优势表达;8个测定部位cAMP-PDE活性均高于cGMP-PDE活性,且不同部位PDE活性存在差异,其中脑组织cAMP-PDE活性和cGMP-PDE活性均高于脊髓各段。结果提示PDE可能在由cAMP和cGMP介导的中枢神经经信号传导中发挥着重要作用。     

大鼠肺及其微血管内皮细胞磷酸二酯酶4表达及活性与清热药影响

通过检测肺与肺微血管内皮细胞（PMVEC）Ⅳ型磷酸二酯酶（PDE4）的表达及其活性,探讨入肺经中药对PMVEC环腺苷酸（cAMP）磷酸二酯酶（PDE）活性的影响,为筛选作用于PMVEC的PDE4抑制剂类抗炎药积累资料。本试验采用RT-PCR测定PDE4的表达,应用高效液相色谱（HPLC）检测酶反应前后大鼠肺组织与PMVEC的cAMP变化,计算PDE活性。结果显示：PDE4A、4B、4C、4D在肺与PMVEC内均有表达;17味入肺经清热药均对肺组织cAMP-PDE酶活性有不同程度的抑制作用,其中黄芩、黄药子、青蒿抑制率较高对肺组织酶分别为：75.37%、72%、61.26%,对PMVEC分别为：66.1%、63.54%、59.39%。由此可见,PDE4所有亚型在肺与PMVEC内均有表达;黄芩、黄药子、青蒿等入肺经的清热药能够抑制肺组织和PMVEC内cAMP-PDE活性;以cAMP-PDE活性为指标,有望筛选出其特异性PDE4抑制剂,并揭示入肺经清热药的作用机制。     

猪嗜中性粒细胞cAMP磷酸二酯酶的提取与活性检测

目的:提取动物体的cAMP磷酸二酯酶(PDE),并检测其活性,为兽医临床研究PDE活性的生理病理变化和中西药物对PDE活性调节作用建立实验方法。方法:猪血经过葡聚糖沉降,淋巴细胞分离液分离,特殊分离液洗涤和红细胞溶胀后,获得嗜中性白细胞。嗜中性白细胞破碎后释放PDE,通过反相高效液相色谱(RP HPLC)法测定反应体系中cAMP的含量,根据底物(cAMP)的减少量,确定嗜中性白细胞中PDE活性。结果:经显微镜计数嗜中性粒细胞纯度达95%;酶量在10～40μl间对cAMP的分解率为9 90%～31 39%,与PDE活性之间存在直线相关关系(r=0 99)。结论:猪嗜中性粒细胞中含有高纯度、高活性的cAMP PDE;高效液相色谱法可以准确测定PDE反应前后cAMP含量的变化;两种方法结合可以作为兽医临床研究机体PDE活性变化和中西药物对PDE活性调节作用的新方法。     

中草药对磷酸二酯酶4活性影响的初步研究

以对磷酸二酯酶4(PDE4)活性的影响为指标,筛选PDE4选择性中草药调节剂,为中兽医药理学研究和临床调节环核苷酸水平提供依据。以cAMP为底物,加入由猪嗜中性粒细胞中提取的PDE4与中草药样品, 用HPLC法检测反应后的cAMP含量,计算中草药对酶活性的影响,正数为抑制作用,负数为促进作用。54味中草药里,对PDE4活性具有抑制作用的有38味,具有促进作用的有16味。部分所选中草药对PDE4活性具有较强的抑制作用,部分具有较强的促进作用,提示从中草药里筛选特异性PDE4活性调节剂是可行的。     

白芍制剂对中性粒细胞相关功能及磷酸二酯酶活性的影响

 【目的】以猪中性粒细胞为靶细胞,研究白芍制剂对其相关功能（呼吸爆发和弹性蛋白酶释放）及磷酸二酯酶活性的影响。【方法】中性粒细胞分离纯化后,以细胞色素C还原法检测中性粒细胞呼吸爆发,以弹性蛋白酶底物的减少反映弹性蛋白酶的释放量,以HPLC检测底物cAMP的变化反映磷酸二酯酶的活性等。【结果】白芍制剂呈剂量依赖性抑制中性粒细胞的呼吸爆发（P＜0.001）,3个不同浓度的抑制率分别为33.15%、45.96%和62.22%;对弹性蛋白酶的释放在低浓度时表现抑制作用（P＜0.05）,抑制率为23.22%,在高浓度时表现促进作用;对中性粒细胞磷酸二酯酶活性具有抑制作用,低、高浓度抑制率分别为13.24%和25.87%（P＜0.01）;HPLC指纹图谱分析表明白芍制剂主要存在5种成分。【结论】白芍制剂对猪中性粒细胞呼吸爆发具有明显的抑制作用,对弹性蛋白酶释放在低浓度有显著抑制作用,其作用机制可能与白芍制剂对磷酸二酯酶活性的抑制有关。     

fMLP诱导猪中性粒细胞LFA-1表达的信号机制研究

【目的】研究致炎因子f MLP诱导中性粒细胞黏附分子淋巴细胞功能相关抗原G1(LFAG1)表达的信号机制,为相关中药及其有效成分的抗炎机制研究提供依据.【方法】猪中性粒细胞的提取采用密度梯度离心法,c AMP含量检测采用ELISA法,信号蛋白p38 MAPK、ERK、PI3K、JAK磷酸化活性检测采用Westernblot法.【结果】不同浓度f MLP可呈剂量依赖性抑制培养中性粒细胞上清液中的c AMP含量(P0.01),对中性粒细胞p38MAPK磷酸化活性有一定的促进作用,但无显著性差异(P0.05),可呈剂量依赖性显著升高中性粒细胞ERK磷酸化活性(P0.05,P0.01);f MLP在不同时间对中性粒细胞培养上清液c AMP含量均有显著的抑制作用(P0.01),对中性粒细胞p38 MAPK磷酸化活性有一定的促进作用,但无显著性差异(P0.05),在1min和5min可显著促进中性粒细胞ERK磷酸化活性(P0.05);未检测到猪中性粒细胞PI3K、JAK磷酸化活性.【结论】f MLP诱导猪中性粒细胞LFAG1表达与其抑制c AMP含量、促进ERK磷酸化活性有关.     

咯利普兰对猪中性粒细胞表达Mac-1的作用及有关信号机制

【目的】阐明咯利普兰为代表的磷酸二酯酶4抑制剂的抗炎新机制。【方法】采用密度梯度离心法分离猪中性粒细胞,流式细胞术检测猪中性粒细胞表达巨噬细胞表面分子抗原-1(Macrophage surface molecular antigen-1,Mac-1);Real-time qPCR和Western blot技术检测猪中性粒细胞p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)、细胞外调节蛋白激酶(ERK)、p65核转录因子(p65 NF-κB)mRNA表达和磷酸化活性。【结果】佛波酯(phorbol myristate acetate, PMA)可显著上调中性粒细胞表达Mac-1(P<0.01),咯利普兰对PMA上调的中性粒细胞表达Mac-1有一定抑制作用,其中,5μmol/L咯利普兰可极显著抑制中性粒细胞表达Mac-1(P<0.01);PMA可极显著上调中性粒细胞p38 MAPK、ERK和p65 NF-κB mRNA表达和磷酸化活性(P<0.01),5μmol/L咯利普兰对PMA升高的中性粒细胞p38 MAPK、p65 NF-κB mRNA表达有极显著抑制作用(P<0...     

牛蒡子苷对小鼠原代骨骼肌细胞磷酸二酯酶活性及细胞生长的影响

 【目的】以茶碱为参照,观察中药成分牛蒡子苷对原代骨骼肌细胞磷酸二酯酶（Phosphodiesterase,PDE）活性及蛋白质合成的影响,探讨中药通过抑制PDE促进肌肉生长的作用及机理。【方法】分离1～3日龄ICR小鼠四肢肌肉用于骨骼肌原代细胞培养,在培养至第5～6天时向培养基中添加不同浓度的牛蒡子苷和茶碱,以不含牛蒡子苷和茶碱的培养基为阴性对照,继续培养24 h,采用HPLC、ELISA以及考马斯亮蓝法分别测定骨骼肌细胞cAMP PDE的活性、细胞内cAMP水平以及细胞总蛋白质合成。【结果】牛蒡子苷终浓度达到2.5 μg•ml-1、茶碱终浓度为20 μg•ml-1时均能极显著抑制原代培养骨骼肌细胞cAMP PDE的活性(P＜0.01）,显著提高细胞内cAMP水平（P＜0.05）,极显著促进肌细胞总蛋白质的合成（P＜0.01）。【结论】中药成分牛蒡子苷具有通过调节骨骼肌细胞内PDE的活性和cAMP水平,增加肌细胞蛋白质合成,促进骨骼肌细胞生长的作用。结果提示对PDE有抑制作用的中药有望成为促进动物生长的新型饲料添加剂。     

佛波酯对猪中性粒细胞巨噬细胞表面分子抗原-1的作用及有关信号机制研究

【目的】研究佛波酯诱导猪中性粒细胞黏附分子巨噬细胞表面分子抗原-1表达的作用及有关信号机制。【方法】采用密度梯度离心法分离纯化猪外周血中性粒细胞,以流式细胞术检测中性粒细胞巨噬细胞表面分子抗原-1表达,分别以实时荧光定量PCR、Western Blot法检测信号蛋白p38丝裂原活化蛋白激酶、胞外信号调控激酶的基因表达和磷酸化活性。【结果】20、30 nmol/L的佛波酯能极显著促进猪中性粒细胞巨噬细胞表面分子抗原-1的表达(P<0.01)。与对照相比,佛波酯在0.5、6 h可明显增加猪中性粒细胞p38丝裂原活化蛋白激酶的基因表达量(P<0.05,P<0.01);在0.5、3和6 h可极显著增加猪中性粒细胞胞外信号调控激酶的基因表达量(P<0.01)。与对照相比,佛波酯在1、5和30 min可极显著促进p38丝裂原活化蛋白激酶磷酸化活性(P<0.01);在0.5、1、5和30 min可明显促进胞外信号调控激酶磷酸化活性(P<0.05,P<0.01)。【结论】佛波酯能诱导猪中性粒细胞黏附分子巨噬细胞表面分子抗原-1的表达,其机制至少与上调p38丝裂...     

牛蒡子与牛蒡子苷对小鼠骨骼肌cAMP及其磷酸二酯酶活性和生长性能的影响

 【目的】观察中药牛蒡子及其主要成分牛蒡子苷对小鼠骨骼肌cAMP磷酸二酯酶(cAMP PDE)活性和cAMP含量、血浆cAMP含量与生长性能的影响,探讨促进动物生长的作用及机理。【方法】断奶ICR小鼠分别灌服不同剂量的牛蒡子煎剂：1.00、0.50、0.25 g/只,牛蒡子苷溶液：1.50、0.75、0.38 mg/只和阳性对照茶碱溶液：0.75、0.38、0.19 mg/只。记录体重和采食量,采用HPLC和ELISA法分别测定骨骼肌组织cAMP PDE活性和血浆cAMP含量。【结果】1.00 g和0.50 g的牛蒡子煎剂和3个剂量的牛蒡子苷显著或极显著降低采食量;除0.38 mg的牛蒡子苷外,各剂量给药组都显著或极显著促进增重;各剂量的牛蒡子、牛蒡子苷和茶碱都极显著提高饲料转化率(P＜0.05,P＜0.01,或P＜0.001)。各剂量的牛蒡子、牛蒡子苷和茶碱都显著或极显著抑制cAMP PDE活性;除1.5 mg的牛蒡子苷外,都显著或极显著提高骨骼肌组织cAMP含量,除0.75 mg茶碱外,都显著或极显著提高血浆cAMP含量(P＜0.05,P＜0.01,或P＜0.001)。骨骼肌cAMP含量与cAMP PDE活性呈极显著负相关,r = -0.402(P＜0.001),血浆cAMP含量与骨骼肌cAMP含量呈极显著正相关性,r =0.553(P＜0.001),与cAMP PDE活性呈负相关,r =-0.436(P＞0.05)。【结论】牛蒡子和牛蒡子苷通过抑制骨骼肌cAMP PDE活性,提高骨骼肌和血浆cAMP水平,提高动物生长性能。     

槲皮素对肉鸡脂肪细胞环腺苷酸信号通路的作用

【目的】研究槲皮素对肉鸡脂肪细胞甘油三酯沉积过程中环腺苷酸（cyclic adenosine monophosphate,cAMP）信号通路的作用。【方法】将脂肪细胞随机分5组,每组6个重复;空白对照组为基础培养液,溶剂对照组为含2‰二甲基亚砜（DMSO）的培养液,试验组为含10、20和40 mg•L-1槲皮素的培养液,分别于24、48和72 h收集细胞及培养液;ELISA法测定乙酰CoA羧化酶（acetyl CoA carboxylase,ACC）、脂肪酸合成酶（fatty acid synthase,FAS）、脂蛋白脂酶（lipoprotein lipase,LPL）、cAMP、腺苷酸环化酶（adenylate cyclase,AC）、磷酸二脂酶（phosphodiesterase,PDE）、蛋白激酶（protein kinase A,PKA）含量;紫外分光光度计测定甘油三酯（triacylglycerides,TG）含量。【结果】与空白对照组相比,①溶剂对照组各指标均无显著差异（P＞0.05）;②20和40 mg•L-1槲皮素组ACC、FAS、LPL、TG和PDE含量显著降低（P＜0.05）,cAMP和PKA含量显著增加（P＜0.05）;③3个槲皮素组AC含量均无显著差异（P＞0.05）。【结论】一定剂量槲皮素可通过调控cAMP信号通路抑制脂肪合成,并减少脂肪沉积。     

小麦代换系耐低磷生理性状的主成分分析及综合评价

【目的】通过对不同磷处理下小麦代换系多项生理指标研究,筛选和鉴定耐低磷基因型。【方法】以小麦CS-Synthetic 6x 整套染色体代换系及其亲本为材料,对其在不同磷处理条件下叶片可溶性糖含量、可溶性蛋白质含量、SOD、POD活性、丙二醛含量、叶绿素、类胡萝卜素含量、光合速率、蒸腾速率,气孔导度、胞间二氧化碳浓度、初始荧光、最大荧光,原初光能转化效率（Fv/Fm）等14个生理指标进行测定,以各项指标的耐低磷系数作为耐低磷指标,通过主成分分析、聚类分析对其耐低磷特性进行综合评价。【结果】将14个单项生理指标转换成为7个相互独立的综合指标;并通过聚类分析将23个基因型划分为3类：父本Synthetic 6x与2A代换系耐低磷特性较强,母本中国春与4A、7A、2B、1D、3D代换系耐低磷特性较弱,其余15个代换系（1A、3A、5A、6A、1B、3B、4B、5B、6B、7B、2D、4D、5D、6D、7D）耐低磷特性中等。【结论】Synthetic 6x 的2A染色体上具有耐低磷胁迫特性的有关基因,在小麦耐低磷育种中可以加以利用     

利用全基因组高通量SNP标记定位二花脸×沙子岭家系中的断奶体重QTL

 【目的】利用二花脸×沙子岭家系定位影响仔猪45日龄断奶体重的数量性状位点（quantitative trait loci,QTL）并搜寻QTL区间内与表型相关的位置候选基因,为最终鉴别因果基因奠定前期工作基础。【方法】构建二花脸×沙子岭猪F2资源家系,利用Illumina porcine 60k DNA芯片判定F2个体的基因型,对45日龄断奶体重表型进行全基因组连锁分析,定位影响二花脸×沙子岭家系F2家系仔猪45日龄断奶体重的QTL。在Ensemble（EMBL-EBI）和NCBI（National Center for Biotechnology Information）网站基因组数据库中搜寻相应的位置候选基因。【结果】在猪的2号染色体（sus scrofa chromosome 2,SSC2）上定位到了1个5%基因组水平显著的QTL,在猪的5号染色体（sus scrofa chromosome 5,SSC5）和猪的14号染色体（sus scrofa chromosome 14,SSC14）上分别定位到了1个1%基因组水平显著的QTL。在上述3个QTL区域内搜寻到了5个与仔猪45日龄断奶体重相关的候选基因,分别是SSC2上的CYP2R1、COPB1、PDE3B基因和SSC5上的NOP2、GDF3基因。【结论】本研究将影响二花脸×沙子岭家系仔猪45日龄断奶体重的QTL定位于SSC2、SSC5和SSC14,并揭示出5个与仔猪45日龄断奶体重相关的候选基因。     

Influence of gallic acid on porcine neutrophils phosphodiesterase 4, IL-6, TNF-α and rat arthritis model

Our previous studies showed that the anti-inflammatory effects of Paeonia lactiflora roots extract may be mediated, at least in part, through its gallic acid content, and this effect may be regulated in part by an inhibition on cAMP-phosphodiesterase (PDE). To explore the anti-inflammatory effect and mechanism, the influence of gallic acid on neutrophils PDE4 activity and expression, TNF-α and IL-6 content and rat arthritis model were further studied. PDE4 activity and gene express were calculated respectively by substrate cAMP change examined with HPLC and real-time RT-PCR. The concentration of IL-6 and TNF-α in supernatant were assayed by ELISA method. Model of rat arthritis was caused by complete Freund’s adjuvant. Results showed that gallic acid had a dose-dependent restraint on PDE4 activity of neutrophils in vitro, promoted significantly PDE4A expression (P<0.01), and had no influence on the expressions of PDE4B and 4D. However, PDE4C expression was not detected. Gallic acid could promote IL-6 release (P<0.05), and inhibit TNF-α release of neutrophils (P<0.05). The experiment in vivo showed that gallic acid had obvious restraint on local inflammation of animal model (P<0.05). Therefore, the anti-inflammatory effect of gallic acid may be mediated in part through an inhibition on PDE4 activity and further an increase of IL-6 and a decrease of TNF-α of neutrophils, and this effect seemed to have no relationship with PDE4 expression.