ERF转录因子新成员JERF3提高百合的耐盐性

以麝香百合鳞片愈伤组织为受体,通过对农杆菌浓度、培养时间及抗生素敏感性的比较试验,建立了农杆菌介导的麝香百合愈伤组织遗传转化的优化体系,并利用该体系将ERF转录因子JERF3基因导入百合中,通过PCR、RT-PCR及Southern blot检测,证明JERF3已整合到百合基因组中并在转录水平上表达。对T0代转基因株系耐盐性鉴定表明,与未经转化的对照相比,转基因百合的耐盐性能明显提高,说明JERF3基因的超表达能有效提高转基因百合抵抗盐害的能力。     

农杆菌介导的百合遗传转化体系的建立

 通过根癌农杆菌介导的遗传转化方法, 建立了凝望星空百合(Lilium ‘Star Gazer’) 愈伤组织和西伯利亚百合(Lilium ‘Siberia’) 叶片的遗传转化体系。试验结果表明: 以愈伤组织和叶片为受体, 均能取得较理想的转化效果; 根癌农杆菌OD600介于0.5～1.0时, 能获得较高的转化率; 40 mg·L ^{- 1}的潮霉素对愈伤组织和叶片有很好的筛选效果; 在共培养培养基中, 去除NH₄NO₃对提高百合转化效率有极显著的效果。对转基因百合进行PCR检测, 结果表明gus基因已整合到百合基因组中。     

GUS基因在农杆菌和甜瓜中的表达差异研究

以农杆茵和转化的甜瓜组织为试验材料,通过组织化学染色法,来研究GUS基因在农杆菌和甜瓜组织中的表达.结果表明,含有GUS基因的农杆茵和甜瓜愈伤组织都能被染成蓝色,而不含有GUS基因的农杆菌和甜瓜愈伤组织没有被染色,因此在检测转基因植株时,可以减少或避免假阳性的出现,为植物的转化奠定了坚实的基础.     

梨愈伤组织双靶点CRISPR/Cas9基因编辑系统的建立

为了在梨愈伤组织中建立CRISPR/Cas9基因编辑体系,将proDAM3∶GUS转入'茄梨'愈伤组织,通过构建双靶点的CRISPR/Cas9基因编辑载体,利用农杆菌介导的遗传转化法侵染proDAM3∶GUS转基因梨愈伤组织,通过测序及GUS染色的方法检验敲除效果,分析靶基因突变类型.结果 表明,共有4个转基因株系在靶...     

发根农杆菌K599对菊花活体转化及其高效再生

 发根农杆菌K599侵染菊花无菌苗刻伤的叶片形成转基因不定根,生根频率为88.0%;不定根经过诱导培养形成愈伤组织,并再生完整植株,愈伤组织诱导率和分化率分别为75.0%和63.3%。诱导的不定根和再生植株经过PCR鉴定含有K599 Ri质粒中的rolC基因,qRT-PCR检测显示rolC基因在再生转基因植株中实现了正常表达。再生植株表现出矮缩、多毛状根特征,并能正常开花。建立的利用活体材料直接作为发根农杆菌K599侵染的受体诱导不定根的遗传转化体系,能克服假阳性不定根的出现;同时,利用不定根繁殖过程中顶端生长点区域无菌的特点,通过截取不定根顶端靠近生长点区域进行继代培养,结合使用头孢霉素杀菌,能达到有效抑制和杀灭农杆菌的目的,在随后的不定根诱导愈伤及分化过程中无须再使用抗生素杀菌,提高了转基因再生效率,为菊花的矮化育种和目标基因的转移提供了良好的试验体系。     

百合分子育种研究进展

从百合基因克隆（包括减数分裂基因、花发育基因、花色基因、花粉发育基因以及抗性相关基因）,再生体系建立（包括不定芽再生系统、原生质体再生系统、体细胞胚再生系统、愈伤组织再生系统）,外源基因转化方法（包括农杆菌介导的遗传转化、DNA直接导入系统的基因转化、花粉管通道法）及转基因应用等方面,介绍近年来国内外百合分子育种的研究进展,并讨论了百合分子育种研究中存在的问题和应用前景。     

月季Rchsp17.8基因转化烟草的非生物胁迫耐性研究

为了研究从月季中分离的小分子热激蛋白Rchsp1718的生理功能, 把Rchsp1718的编码框插入到表达载体PHB的35S组成型启动子后面, 通过农杆菌GV3101转化烟草, 获得转基因植株。在高温、干旱、渗透、高盐胁迫条件下分别检测转基因烟草形态、失水率、电导率、脯氨酸含量及其内外源基因表达模式。结果显示: 与对照相比, 转基因烟草抗性表型明显, 电导率较低, 脯氨酸含量大幅度提高, 失水率降低; P5CS基因的表达量上调, 说明转Rchsp1718基因烟草苗在高温以及高渗透胁迫下表现出明显的耐受性。     

马蔺cbf转录因子的克隆及序列分析

根据GenBank已发表的拟南芥cbfs转录因子基因序列设计特异性引物, 采用PCR和RT-PCR方法, 从鸢尾科野生花卉马蔺基因组DNA和cDNA中克隆出cbf转录因子基因片段, 将其克隆到pMD18-T-Vector上。经序列测定及分析表明, 两种途径得到的cbf基因序列相同, 基因全长642 bp, 可编码213个氨基酸。同源性分析表明该基因的核苷酸序列和推导的氨基酸序列与其它植物cbf类基因具有同源性, 尤其与拟南芥cbf1和黄瓜cbf1基因有很高的同源性, 氨基酸同源性高达97%。鉴于同cbf1基因高的同源性, 初步确定克隆到马蔺cbf1转录因子基因, 命名为Ilcbf1, 在GenBank中登录号为DQ131497。     

根癌农杆菌介导荔枝遗传转化研究

利用带有内含子的GUS基因(uidA)的瞬时表达,研究影响根癌农杆菌介导荔枝胚性愈伤组织遗传转化的若干因素。结果表明:在AGL-1、LBA4404和EHA105三种菌株中,EHA105对荔枝胚性愈伤组织的侵染力最强;采用2d的共培养时间既有较高的瞬时表达率,又避免了农杆菌的过度生长;0.5×10~8个细胞/mL的菌液密度为最佳侵染浓度;继代培养15d的胚性愈伤组织处于最旺盛分裂的时期,是转化的合适受体;愈伤组织转化前干燥处理对uidA瞬时表达率的提高有一定的促进作用。使用优化的农杆菌侵染条件获得了稳定表达uidA基因的荔枝抗性愈伤组织。     

根癌农杆菌介导马齿苋愈伤组织遗传转化研究

利用马齿苋的叶片诱导出愈伤组织,再以愈伤组织为受体建立了根癌农杆菌介导的遗传转化体系。结果表明:利用该转化体系得到抗性愈伤组织后,对其进行GUS组织化学染色和PCR扩增鉴定,证实为转化子,表明根癌农杆菌介导外源基因转化马齿苋的愈伤组织是完全可行的,为今后通过基因工程手段进行马齿苋的改良奠定了基础。     

康乃馨ACC氧化酶反义基因遗传转化康乃馨的研究

 在建立康乃馨从愈伤组织到完整植株的高频再生体系的基础上，用花特异表达启动子驱动的康乃馨ACC氧化酶反义基因通过农杆菌介导法对康乃馨进行遗传转化，获得了3株转基因植株．经多重PCR及PCR-Southem杂交检测，证实康乃馨ACC氧化酶的反义基因已整合进康乃馨的基因组中。     

以PMI为选择标记的露地菊转Lc-14-3-3基因体系的建立及功能鉴定

 从东北地区高pH盐碱地上生长良好的羊草中克隆Lc14-3-3基因，以露地菊（Chrysanthemum morifolium）‘火焰’叶片愈伤组织为受体，以农杆菌介导，将Lc14-3-3基因转入‘火焰’基因组中。以载体中的磷酸甘露糖异构酶基因（phosphomannose isomerase，PMI）为筛选标记，通过甘露糖的筛选，结合PCR、Southern杂交检测Lc14-3-3整合到其基因组。通过转基因植株与对照植株的耐盐性对比可见转化Lc14-3-3基因植株具有更高的耐盐能力。磷酸甘露糖异构酶基因/甘露糖筛选系统可有效应用于露地菊遗传转化。     

Optimization of Wheat Immature Embroys Genetic Transformation System Mediated by Agrobacterium tumefaciens

为了优化农杆菌介导的小麦幼胚转化体系,通过对4个小麦品种河农827、石新828、河农825、良星99的幼胚组织培养及再生系统的研究表明,在改良培养基MSW1和MSW2中,小麦幼胚胚性愈伤组织诱导率与MSW0培养基相比分别提高了6.0%和5.4%,并且显著提高了植株再生能力。采用混合正交试验设计,对农杆菌遗传转化过程中小麦幼胚的诱导培养基、诱导时间、农杆菌侵染浓度、侵染时间进行了优化。结果表明,在诱导培养基MSW2,诱导培养6d,OD660=1,侵染时间3h时,愈伤GUS瞬时表达率及抗性愈伤成活率最高,对河农827成活的抗性再生植株进行PCR检测,获得了候选转基因植株。     

农杆菌介导BADH基因转化葡萄的研究

以葡萄品种鲁贝的花丝为试材,在葡萄的细胞悬浮系得到胚性愈伤组织及悬浮细胞再生植株的基础上,通过农杆菌介导转化甜菜碱醛脱氢酶基因,利用共培养后GUS染色组织分析探讨了影响转化效率的各种因素,优化了转化体系。组培苗经PCR检测,证明获得了转基因葡萄植株。     

根癌农杆菌介导IFS基因对岷山红三叶遗传转化研究

以岷山红三叶草为试材,以其子叶和叶柄的愈伤组织为受体,采用根癌农村菌介导法,研究其遗传转化的条件,以期建立根癌农杆菌介导的异黄酮合酶IFS基因遗传转化体系。结果表明:利用该转化体系,获得的抗性愈伤组织,通过提取其基因组进行PCR扩增鉴定,证实为转化子。提示根癌农杆菌介导转化岷山红三叶愈伤组织是完全可行的,为利用基因工程方法改良红三叶的品种并获得高产异黄酮品系奠定了基础。     

逆境诱导转录因子AtDREB2A 转化百合的研究

 以东方百合‘西伯利亚’为试验材料,探讨影响农杆菌转化效率的因素,优化了以无菌小 鳞片为外植体的遗传转化体系,通过农杆菌介导法将逆境诱导转录因子AtDREB2A 基因转入百合基因组 中。结果表明：外植体预培养3 d,侵染菌液浓度OD600 = 0.8,侵染时间20 min,25 ℃下共培养3 d,获 得的卡那霉素阳性植株率最高。对获得的59 株抗性单株进行PCR 检测,有28 个单株的DNA 经扩增后 产生了与阳性对照相同的特异扩增带。进一步对转基因阳性植株进行Southern 杂交鉴定,结果表明外源 基因已经整合到转化植株的基因组中。生理指标测定表明转基因植株的对高温的适应性有一定程度的提 高。     

高羊茅抗真菌病基因转化的研究

 通过农杆菌介导法将双价载体(含抗真菌病的几丁质酶基因Chi和β - 1, 3 - 葡聚糖酶基因Glu) 导入高羊茅愈伤组织细胞内, 建立了高羊茅的农杆菌转化体系, 获得了抗真菌病的转基因高羊茅植株。在转化过程中, 确定了卡那霉素(Kan) 筛选剂的浓度以200～300 mg/L为宜, 联合运用羧苄青霉素(Carb) 与头孢霉素(Cef) 作为抗菌素能得到好的脱菌效果; 农杆菌的几种共培养方式对转化频率的影响表明, 共培养基上垫一层滤纸, 愈伤周围滴加浸染液, 恢复培养1周后用甘露醇和抗生素液洗涤, 是一种好的转化方式。对转化植株进行PCR分析和分子杂交及禾谷镰刀菌挑战接种, 发现转化植株有高阳性率及抗真菌能力。     

RNAi沉默CsHB1降低茶树叶片愈伤组织咖啡碱积累

以‘英红9号’茶树叶片为材料,克隆HD-Zip转录因子基因CsHB1,原核表达CsHB1重组蛋白,利用本氏烟草进行CsHB1表达蛋白的亚细胞定位;构建CsHB1的RNAi转基因载体,经农杆菌介导转化‘英红9号’茶树叶片愈伤组织,并对沉默CsHB1愈伤组织系进行基因表达分析和咖啡碱含量测定。结果表明,克隆基因与NCBI登记的‘龙井43’茶树CsHB1（MF033534）有6个碱基差异,但编码相同的氨基酸序列;原核诱导表达获得CsHB1的49 kD不可溶蛋白;将CsHB1蛋白亚细胞定位于细胞核和细胞质。在沉默表达CsHB1愈伤组织中,CsHB1表达显著下降,催化茶叶咖啡碱合成的N–甲基转移酶基因yhNMT1表达下调,愈伤组织中咖啡碱含量显著降低。推测转录因子基因CsHB1的沉默抑制了靶基因yhNMT1的表达,进而降低‘英红9号’愈伤组织中咖啡碱的合成积累。     

苹果MdRCD1基因的表达分析以及功能的初步鉴定

【目的】分离克隆苹果MdRCD1基因,分析其蛋白结构和逆境响应,并初步鉴定MdRCD1在苹果愈伤中的功能。【方法】同源克隆MdRCD1并测序,用DNAman和MEGA5相关软件分析MdRCD1氨基酸序列以及进化关系,不同逆境处理‘嘎拉’苹果组培苗,qRT-PCR分析MdRCD1在逆境条件下的表达量。农杆菌介导的遗传转化方法获得过量表达MdRCD1的转基因愈伤,不同盐浓度处理野生型和转基因愈伤,观察愈伤的长势,检测愈伤的鲜质量、脯氨酸和丙二醛含量,鉴定MdRCD1的初步功能。【结果】从‘嘎拉’苹果中克隆了MdRCD1(MDP0000234325)基因。该基因ORF为1 803 bp。通过进化树和蛋白同源性分析,表明苹果MdRCD1和中国白梨PbRCD1进化亲缘关系最近。在MdRCD1的N端有1个保守的WWE结构域,1个PARP催化中心,在C端有1个RST结构域。qRT-PCR实验表明MdRCD1在苹果各个组织器官中都有表达,在茎中的表达量高于其他组织;同时MdRCD1的表达受Na Cl、ABA、渗透胁迫等逆境胁迫的诱导。通过农杆菌侵染获得过量表达MdRCD1转基因苹果愈伤。盐胁迫处理条件下,过量表达MdRCD1的抗性明显提高。【结论】MdRCD1在进化过程中比较保守,苹果不同组织中都有表达,过量表达MdRCD1苹果愈伤的抗盐性得到提高。     

根癌农杆菌介导绿色荧光蛋白基因转化印度酸桔的研究

 通过根癌农杆菌介导将绿色荧光蛋白基因转入印度酸桔的胚性愈伤组织中, 经潮霉素筛选,获得抗性愈伤组织, 并再生植株。对这些植株进行GUS 染色、PCR 分析、绿色荧光检测和Sourthern 杂交验证, 结果表明绿色荧光蛋白已经在转基因植株中表达。