病毒性疾病分子诊断方法的现状和未来(续完)——OIE合作中心对应用PCR方法进行兽医病毒性疾病诊断的展望

上期回顾:上期阐述了对跨边界动物疾病建立早期预警系统和快速高特异的病原检测方法的重要性以及分子病毒学在建立快速高特异性病原检测方法中的作用。并对基于凝胶的常规PCR分析方法、"常规"PCR系统检测系统、实时PCR分析法的论断利用、多重PCR方法在病毒性疾病快速诊断、病毒遗传相关性测定和变异株传播途径的追溯中的使用效果进行了介绍。     

牛环形泰勒虫病二温式PCR诊断方法的建立及初步应用

为建立特异、敏感、快速的二温式PCR诊断方法,根据牛环形泰勒虫裂殖子表面抗原(tams1)基因,设计了一对特异性引物,扩增出大小为154bp基因片段,经克隆、测序分析,与已知基因序列的相似性为96%。用建立的牛环形泰勒虫病二温式PCR诊断方法,对从新疆牛环形泰勒虫病流行地区采集的50份全血样品进行诊断,阳性率为88%,而血涂片检出的阳性率只有58%。经试验验证,该方法具有特异性高、敏感性强、重复性和稳定性好等优点。表明本试验所建立的二温式PCR诊断方法可用于牛环形泰勒虫病的临床诊断、隐性感染检测和流行病学调查。     

Ⅰ群禽腺病毒通用型二温式PCR和VPCR方法的建立及初步应用

为建立快速检测Ⅰ群禽腺病毒(FAdV-Ⅰ)血清型通用PCR方法,根据FAdV-Ⅰ 12个血清型基因保守区设计引物,建立了二温式PCR和VPCR方法.结果显示:本研究建立的FAdV-Ⅰ二温式PCR方法,在90℃～94℃变性3 s、70℃～74℃退火兼延伸8 s,循环35～40次时,最快可在15 min内完成扩增;对分属5...     

PCV3和PCV2双重PCR鉴别诊断方法的建立及应用

本研究根据GenBank中报道的PCV2和PCV3毒株全基因组序列,设计两对特异性引物,建立了一种多重PCR鉴别诊断方法,两种病毒的预期扩增片段分别大小分别为1 007 bp和505 bp。通过对扩增条件的优化,获得最佳的反应体系为25μL体系,最佳退火温度为56℃。该鉴别方法可以同时扩增PCV3和PCV2的特异性片段,而猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、轮状病毒(RV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪德尔塔冠状病毒的基因组及阴性对照均未扩增出任何条带。该方法对PCV3和PCV2的最低检出量均为10 ng/μL。对采自湖北省内规模化猪场的260份淋巴结样品检测。结果显示,PCV3阳性率为16.9%(44/260),PCV2阳性率为46.5%(121/260),PCV3和PCV2混合感染率为4.6%(12/260),双重PCR检测与测序分析的符合率为100%。结果表明,本研究建立了一种简便、灵敏、稳定可靠且特异性强的双重PCR鉴别诊断方法,可为临床样品中PCV3和PCV2的快速鉴别诊断及流行病学研究提供技术支持。     

羊泰勒虫病半套式PCR诊断方法的建立及初步应用

试验根据羊泰勒虫 18S rRNA基因序列设计了3条引物,建立了羊泰勒虫病半套式PCR诊断方法.该方法是基于一次PCR的一种提高PCR敏感性的方法,同时也保证了产物的特异性,并对吉林省珲春地区的65份羊抗凝血进行检测,旨在为今后羊泰勒虫病的诊断和流行病学调查奠定基础.     

鉴别猪伪狂犬病病毒gE基因缺失疫苗和野毒感染的二重PCR诊断方法的建立和应用

为建立猪伪狂犬病病毒(PRV)gE基因缺失疫苗和野毒感染的快速鉴别诊断方法,本研究根据猪伪狂犬病野毒具有gD表面抗原基因和gE毒力基因,而基因缺失疫苗只有gD基因无gE基因的特性,针对gD/gE基因的5'端核苷酸序列自行设计引物,建立鉴别PRV gE基因缺失疫苗和野毒感染的二重PCR诊断方法,并进行了特异性、敏感性和重复性试验;利用所建立的检测方法对临床疑似样品进行了检测.结果表明,成功建立了鉴别PRV gE基因缺失疫苗和野毒感染的二重PCR诊断方法,该方法灵敏度高,最低检出限为100拷贝/μL;重复性好;特异性强,可特异性地扩增出PRV细胞毒中的gD和gE基因及gE基因缺失疫苗毒中的gD基因,但对PK-15细胞和猪流行性腹泻病毒等其他8种病原扩增不出任何条带;自835份临床疑似PRV感染病料中共检测出PRV gD和gE基因双阳性样品即野毒感染阳性样品267份,PRV gD基因单阳性样品28份,选取该方法检测出的26份PRV野毒感染阳性样品用于病原分离培养,两种方法的符合率为96.1%.说明本试验建立的二重PCR鉴别诊断方法快速、灵敏、特异,对于临床上疫苗毒和野毒感染的快速鉴别诊断具有重要意义.