柿和君迁子SSR分析技术的建立

通过搜寻核酸数据库中柿属植物核苷酸序列,利用Sputnik程序查找微卫星,利用Primer Premier 5.0软件设计特异微卫星引物,并对影响PCR扩增的Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶、引物浓度,以及退火温度等因素进行优化.最终确定柿(Diospyroskaki)和君迁子(D.lotus)SSR-PCR最佳反应体系为模板DNA30 ng,Buffer1×,Mg2+2.5mmol/L,dNTPs0.2mmol/L,Taq DNA酶1 U,引物0.3 μmol/L,反应总体积20μL,退火温度50℃.     

部分柿属植物IRAP反应体系的建立和指纹图谱构建

为建立柿属(Diospyros)植物反转录转座子间扩增多态性(IRAP)技术体系,对IRAP分析中影响PCR扩增结果的若干因子进行了研究。确立了适合柿属植物IRAP分析的技术体系:20μL反应体系中,1×Buffer、模板DNA50ng、Mg2 2.0mmol/L、dNTPs0.25mmol/L、引物0.40μmol/L、TaqDNA聚合酶1.0U,矿物油20μL;PCR扩增程序:95℃5min;95℃1min,56℃1min,升温速率 0.6℃/s,72℃2min,循环44次;72℃延伸8min。该优化体系在7种柿属植物33个基因型的I-RAP分析中获得较理想的扩增结果,扩增片段120～1500bp,不同种和柿种以下不同品种间扩增条带总数和带谱相同。每个基因型都有其独特的指纹图谱,可作为区分不同基因型的依据,尤其芽变品种的鉴别。     

发酵床垫料中微生物16S rDNA PCR反应条件的建立与优化

为探讨发酵床垫料中微生物16S rDNA基因扩增实验中诸多因素对实验结果的影响,采用单因素法对16S rDNA基因扩增时PCR反应体系中的5个潜在因素(Mg2+、dNTP、引物、Taq酶、模板DNA)5水平上进行优化实验,并进一步优化了反应程序中的退火温度、循环次数。结果表明:25μL的最佳反应体系为:10×PCR buffer 2.5μL、MgCl22.0 mmol·L-1、dNTP 0.2 mmol·L-1、引物0.2μmol·L-1、Taq DNA聚合酶0.5 U、模板DNA 50 ng;最佳反应程序为:在94℃下进行4 min预变性;随后循环扩增25个循环(包括94℃变性45 s,53.7℃退火30 s,72℃延伸90 s);最后在72℃下延伸10 min。     

正交设计优化玉米SSR—PCR反应体系的研究

为建立适宜玉米SSR—PCR的反应体系和扩增程序,利用正交设计L16（4^5）表,对反应体系的模板DNA、dNTPs、Primers、Taq DNA聚合酶的浓度进行4因素4水平优化筛选和扩增程序的优化,确立了最优反应体系和扩增程序。即在10μL体系中,模板DNA20ng,1×PCR buffer,dNTPs62．5pmol／μL,Primers0．25pmol／μL,Taq DNA polymerase0．5U。反应程序为：94℃预变性5min;94℃变性45S,60℃退火45S,72℃延伸1min,32个循环;72℃延伸5min,4℃保存。使用300对SSR引物对重组近交系的两亲本扩增,筛选出条带清晰,有差异的引物94对,用于基因连锁图谱构建和QTL定位。     

东兴金花茶SSR-PCR反应体系的优化及引物筛选

采用L16（45）正交设计试验对东兴金花茶SSR-PCR反应的五因素（Mg^2＋,dNTPs,引物,Taq酶和模板DNA浓度）四水平进行了优化试验,然后利用优化后的反应体系,将31对同属植物SSR引物（4对茶树,7对山茶和20对金花茶引物）运用于东兴金花茶材料上,筛选适宜东兴金花茶遗传分析的SSR引物。结果表明,东兴金花茶最佳反应体系（15μL）及扩增条件为：Mg^2＋1.50 mmol/L、dNTP 0.30 mmol/L、引物0.40μmol/L、Taq酶0.75 U、模板DNA 40.00 ng;最佳扩增程序为：94℃预变性5 min;94℃变性30 s,58℃退火30 s（因引物而异,该温度为引物CN10的退火温度）,72℃延伸40 s,共36个循环;72℃最后延伸10 min。山茶属的不同植物之间可以共享部分SSR引物信息,东兴金花茶获得了9对能扩增出条带清晰且具有多态性的引物,引物最适退货温度为54-60℃,观测杂合度（HO）和期望杂合度（HE）分别为0.433-1.000和0.391-0.932。本试验为下一步进行的东兴金花茶遗传多样性分析、遗传图谱的构建等研究奠定了基础。     

兰州百合DNA提取方法比较及RAPD体系的快速优化

以兰州百合鳞片和叶片为试材,采用改良CTAB法获得了高质量的基因组DNA。为优化兰州百合RAPD-PCR反应体系,利用正交试验设计,对兰州百合RAPD-PCR反应体系中的5种主要因素进行4水平共计16个组合设计,并选用3种反应程序,通过琼脂糖凝胶电泳结果分析,最终获得最佳反应体系为:20 uL反应体系中含30 ng模板DNA、0.5 μmol/L随机引物、0.2 mmol/L dNTPs、2.25 mmol/L MgCl2, 及1.5U Taq DNA聚合酶。最佳反应程序:94 ℃预变性4 min;94 ℃变性1 min,36 ℃退火1.5 min;72 ℃延伸2 min;35个循环;最后72 ℃延伸7 min。     

杧果SC-SSR分子标记反应体系的建立与优化

采用正交设计方法,对影响PCR反应体系的5个因素(Mg2+、Taq DNA聚合酶、dNTPs、引物和模板DNA)进行了优化,建立了适用于杧果的SC-SSR-PCR反应体系。结果表明,总反应体系25μL中,包含模板DNA用量100 ng·mL-1、Mg2+浓度2.00 mmol·L-1、引物浓度0.40μmol·L-1、 Taq DNA聚合酶浓度1.00 U、 dNTPs浓度0.15 mmol·L-1。利用优化的杧果SC-SSR-PCR反应体系对10对SC-SSR引物进行验证,均能扩增出清晰、明亮、特异的电泳条带。因此,优化的杧果SC-SSR-PCR反应体系适用于杧果种质鉴定和亲缘关系分析。     

根瘤菌RAPD引物筛选及条件优化

用改良的SDS-CTAB酶裂解法提取了根瘤菌基因组DNA的模板,从100个10bp的随机引物中筛选出了16条在20个菌株上均能扩增出清晰的片段。应用L16(45)正交表研究了DNA模板、Mg2+、Taq酶d、NTPs和引物浓度对扩增迁移率重现性的影响,用这种方法建立的根瘤菌RAPD-PCR优化反应体系为:20μl体系中含2.5mg/L的DNA模板、2.00mmol/L的Mg2+、1.00U的Taq酶、0.05mmol/L dNTPs、0.35μmol/L随机引物。     

北方黑土土壤细菌16S rDNA扩增体系的优化

采用降落PCR方法扩增目的基因,设计两次正交试验对PCR反应体系中的各组分浓度进行筛选,同时对退火时间、延伸时间及循环次数进行摸索。结果表明,适合北方黑钙土土壤细菌16S rDNA扩增体系为:在25μl体系中,10×buffer2.5μl,DNA模板20ng,Mg2+2.5mmolL-1,dNTPs0.25mmolL-1,引物0.3μmolL-1,TaqDNA聚合酶1.5U。降落PCR扩增程序为:95℃,5min;95℃,45s;65~56℃,60s;72℃,90s;每两个循环降低1℃。95℃,45s;5.5℃,60s;72℃,90s;10个循环。最后72℃,10min。     

枣SRAP-PCR体系的正交优化研究

采用正交试验设计的方法,建立了枣SRAP分析的优化反应体系,即20µL反应体系中含有1×buffer,dNTP 200µmol/L、引物各30ng、MgCl2 2.5mmol/L、Taq酶1.0U和模板DNA 20ng。适宜的扩增条件为94℃预变性5min;94℃变性1min,33℃复性1min,72℃延伸1min,5个循环;94℃变性1min,53℃复性1min,72℃延伸1min,30个循环;最后72 ℃延伸5min。本研究建立的枣SRAP 体系重复性好,稳定性强。