小麦TaNADP-ME1基因在大肠杆菌中的融合表达及可溶蛋白纯化

NADP依赖的苹果酸酶(NADP-ME)是C4光合途径关键酶。为了确定TaNADP-ME1基因的功能,利用重组技术将前期克隆到的TaNADP-ME1基因构建到原核表达载体pET32a,双酶切和PCR鉴定阳性克隆,CaCl2法转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,IPTG诱导融合蛋白表达,Ni2+-NTA琼脂糖亲和层析柱纯化融合蛋白。成功获得了重组原核表达载体pETE1,TaNADP-ME1基因在BL21(DE3)pLysS中得到了融合表达,SDS-PAGE表明,融合蛋白分子量为80 kDa,并成功纯化到融合蛋白。     

灰葡萄孢BcKMO基因的原核表达分析

为构建灰葡萄孢犬尿氨酸单加氧酶(Bc KMO)基因的原核表达载体并进行高效表达,获得纯化的Bc KMO蛋白。以灰葡萄孢野生型BC22为试材,通过反转录PCR扩增Bc KMO基因,回收Bc KMO基因片段克隆到p MD19-T载体中,测序正确后,酶切p MD19-T-Bc KMO和带有GST标签蛋白的p GEX4T-1质粒,将目的片段进行连接,构建Bc KMO基因的原核表达载体p GEX4T-1-Bc KMO-GST。经酶切和测序鉴定正确后,将构建好的原核载体转化大肠杆菌BL21。经IPTG诱导,在大肠杆菌BL21菌株中成功表达了与GST标签蛋白融合的Bc KMO蛋白,大小约71 k Da。SDS-PAGE分析表明,该蛋白在0.2 mmol/L IPTG诱导12 h时高效表达;Western Blot结果发现目的蛋白能与GST特异性抗体起特异性反应,表明Bc KMO基因的体外诱导表达成功。     

抗凋亡融合蛋白PTD-Bcl-xL原核表达载体的构建及表达纯化

人工抗凋亡蛋白PTD-Bcl-x L能保护多种因素引起的细胞异常凋亡,为了获得高纯度Bcl-x L与PTD(Protein transduction domains)的融合蛋白,首先采用TRIzol法提取SD大鼠肝脏总RNA,将RNA反转录为c DNA,设计引物以c DNA为模板,PCR扩增Bcl-x L基因,构建p UM19-T-Bcl-x L质粒,并对质粒双酶切鉴定和测序鉴定;其次设计包含PTD序列的Bcl-x L引物,以测序正确的p UM19-T-Bcl-x L质粒为模板,PCR扩增PTD-Bcl-x L序列,将扩增序列克隆入p ET28a载体,构建PTD-Bcl-x L蛋白的原核表达质粒p ET28a-PTD-Bcl-x L,并对p ET28a-PTD-Bcl-x L载体双酶切鉴定和测序鉴定;将p ET28a-PTD-Bcl-x L重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达,并对IPTG诱导融合蛋白表达的浓度和诱导时间进行了优化;SDS-PAGE分析表达蛋白的可溶性情况,在变性条件下用Ni-NTA琼脂纯化融合蛋白;最后用SDS-PAGE、Western Blot及质谱对融合蛋白进行鉴定。结果表明:双酶切p UM19-T-Bcl-x L质粒出现约774 bp大小条带,p UM19-T-Bcl-x L质粒测序结果与NCBI数据库比对序列一致,表明成功构建p UM19-T-Bcl-x L质粒;双酶切p ET28a-PTD-Bcl-x L质粒出现约744 bp大小条带,p ET28a-PTD-Bcl-x L质粒测序结果与预期序列一致,表明成功构建了p ET28a-PTD-Bcl-x L原核表达载体;在IPTG诱导下p ET28a-Bcl-x L重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中表达出36 k Da大小蛋白,最优IPTG诱导浓度为0.1 mmol/L,最佳IPTG诱导时间为6 h;SDS-PAGE电泳显示融合蛋白主要出现在菌液超声后的沉淀里,以包涵体形式表达,经Ni-NTA琼脂纯化获得了高纯度的融合蛋白;Western Blot和质谱鉴定证明IPTG诱导表达蛋白和纯化的融合蛋白为PTD-Bcl-x L蛋白。纯化得到了PTD-Bc L-x L融合蛋白,推进了PTD-Bcl-x L蛋白在猪、牛等家畜精液冷冻保存的应用进程。     

鸭疫里默氏菌噬菌体裂解酶的原核表达

为了原核表达鸭疫里默氏菌噬菌体RAP44的裂解酶基因,以噬菌体RAP44的基因组为模板,用PCR方法扩增裂解酶基因,与表达载体p GEX-6P-1连接,将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中表达,利用谷胱甘肽-Sepharose 4B亲和柱纯化表达蛋白。结果成功构建了表达载体p GEX-N,转化菌经IPTG诱导后成功表达出了分子量约为37 k D的可溶性重组蛋白。本研究获得了纯化的鸭疫里默氏菌噬菌体裂解酶重组蛋白,为裂解酶的功能研究奠定了基础。     

重组人早孕因子的表达与纯化

早孕因子(EPF)是具有免疫抑制和生长调节活性的妊娠相关蛋白,为目前最早确认妊娠的生化指标之一。为获得人早孕因子重组蛋白,利用PCR技术扩增人早孕因子基因,克隆入原核表达载体pGEX-6p-1,与GST基因相融合,构建重组表达质粒,转化大肠杆菌表达菌株BL21,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,以SDS-PAGE和Western blot分析重组蛋白的表达,利用GST树脂纯化表达蛋白。结果成功构建重组表达质粒pGEX6P-EPF,在大肠杆菌中诱导表达了GST- EPF融合蛋白,表达蛋白分子量为37.3kDa,并能被抗GST单克隆抗体特异识别,GST亲和层析纯化,制备了EPF重组蛋白。     

番木瓜畸形花叶病毒HC-Pro蛋白的原核表达与纯化

番木瓜畸形花叶病毒(papaya leaf distortion mosaic virus, PLDMV, Potyvirus属)是目前威胁中国番木瓜种植的主要病原之一。辅助成分-蛋白酶(helper component-proteinase, HC-Pro)是PLDMV编码参与病毒运动、复制、媒介传播、基因沉默抑制的多功能蛋白。为了获得HC-Pro基因的纯化蛋白,本研究通过密码子优化HC-Pro基因序列,成功构建原核表达质粒p ET-30a-HCPro,经IPTG诱导后实现HC-Pro在大肠杆菌中的原核表达,在0.5 mmol/L IPTG,20℃条件下诱导过夜时其表达量最高;破碎菌体后,SDS分析全菌、破碎上清以及沉淀中目标蛋白的表达量,结果显示重组HC-Pro蛋白主要以不可溶的包涵体形式在沉淀中表达;进一步溶解包涵体通过Ni-NTA层析柱进行纯化,在500 mmol/L浓度咪唑下可以获得分子量大小约为54 kD的HC-Pro重组蛋白;Western Blot分析纯化后的目标蛋白,结果显示54 kD处有明显的条带,与预期的HC-Pro重组蛋白大小一致。本研究成功表达并纯化获得了PL...     

α-苦瓜素蛋白的原核表达及其抗体制备

α-苦瓜素是一种典型的Ⅰ型核糖体失活蛋白,具有多种生物活性,有着广泛的应用前景。本研究通过原核表达技术成功获得α-苦瓜素蛋白及制备了血清抗体。首先通过RT-PCR方法从苦瓜籽中克隆到α-苦瓜素全长基因,然后将该基因连接至原核表达载体p ET-28a(+)上,导入大肠杆菌Rosetta菌株中并少量诱导表达,筛选出重组蛋白的最适表达条件。在37℃、终浓度1 mmol/L IPTG的诱导条件下,可成功诱导出分子量约为29.7 k D左右的可溶性重组蛋白,与预期α-苦瓜素大小一致。按照最适条件进行大量诱导α-苦瓜素蛋白的表达,利用Ni-NTA柱对α-苦瓜素重组蛋白进行纯化,最后以纯化的α-苦瓜素蛋白免疫注射新西兰大白兔制备抗血清。Western blotting分析表明,制备的抗血清具有较好的特异性和灵敏度,可以特异性检测苦瓜籽中的α-苦瓜素蛋白。本研究结果为下一步探究α-苦瓜素调控植物防御生物胁迫的分子机理提供指导。     

胸腺肽αl原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达

构建胸腺肽αl（Thymosin αl,Tαl）基因原核表达载体,并在大肠杆菌BL21中进行表达,为大量获得胸腺肽αl打下基础。将人工合成的Tαl三串体基因插入到表达载体pET32a后,CaC12法转化大肠杆菌BL21,经氨苄青霉素筛选后用IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测BL21中胸腺肽αl的表达。大肠杆菌中检测到与目的蛋白相对分子量(31kD)相符的条带。成功构建了Tαl原核表达载体,该蛋白能在大肠杆菌中表达。     

C型口蹄疫病毒衣壳蛋白前体P1基因的原核表达及其生物活性的初步分析

将口蹄疫病毒(FMDV)结构蛋白基因P1的完整cDNA序列插入原核表达性载体pET-28α(+)中,获得融合表达质粒pET-P1,转化E.coli.BL21(DE3),经IPTG诱导,SDS-PAGE结果表明,pET-P1获得融合表达, Western Blot 检测证实表达的融合蛋白具有免疫活性,表达产物主要以包涵体的形式存在,进一步采用纯化试剂盒纯化P1蛋白做为诊断抗原.     

棉花GhEPSPS基因的原核表达载体的构建及诱导表达

目的在于构建棉花GhEPSPS基因的原核表达载体,并在宿主大肠杆菌中成功诱导表达。利用RT-PCR技术从陆地棉苏棉18中克隆获得GhEPSPS基因的开放阅读框序列,连接到p EASY-Blunt平端载体,构建获得重组载体p EASY-Blunt-GhEPSPS;以该重组载体为模板,PCR获得两端含有Eco RⅠ和XhoⅠ酶切位点的GhEPSPS基因CDS序列,通过这2个酶切位点插入到p ET32a载体,构建获得原核表达重组载体p ET32a-GhEPSPS,转化到宿主菌株BL21(DE3)中,经IPTG诱导后,SDS-PAGE检测目的基因的表达情况。研究结果表明,成功克隆获得了棉花GhEPSPS基因的CDS序列,并成功构建了该基因的原核表达载体,目的基因能够在宿主菌中被诱导大量表达。该研究结果将为深入研究棉花EPSPS酶的结构、功能以及酶学特性提供重要的研究基础。     

荷斯坦奶牛IFN-γ基因的克隆、序列分析及表达研究

利用RT-PCR技术从荷斯坦奶牛外周血淋巴细胞总RNA中扩增IFN-γ(ccIFN-γ)基因,克隆至pMD18-T载体进行测序。测序结果表明,ccIFN-γ基因全长501bp,编码166个氨基酸,其中前23个氨基酸残基构成信号肽序列,后面147氨基酸残基构成成熟肽,其中含有2个潜在的N-链糖基化位点。二级和三级结构预测发现,ccIFN-γ蛋白分子中存在7个的α-螺旋,中间由无规卷曲连接,折叠成由α-螺旋包绕的中空状结构。将ccIFN-γ成熟肽编码区序列进一步克隆至pET-28a,转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达。经SDS-PAGE分析,表达出与预期大小(20.6KDa)相符的重组蛋白,占菌体蛋白18.6%。Western blot检测证实表达的融合蛋白为牛IFN-γ,这为进一步开展重组ccIFN-γ生物学活性的研究奠定了基础。     

鸡新城疫病毒La Sota株F基因克隆及原核表达

参照NDVLa Sota株核酸序列(AF077761)设计1对引物,利用RT-PCR扩增F基因并得到了长为1 700 bp的片段,将其克隆到pGEM-T easy vector中,经酶切鉴定和测序后克隆进原核表达载体pET-32a,将重组表达质粒转化BL21(DE3),在IPTG诱导下表达约83 kd的融合蛋白,SDS-PAGE电泳和Western blotting检测证实该基因片段获得高效表达且表达产物具有免疫学活性。     

A型口蹄疫病毒VP1基因的克隆及原核表达

文章旨在利用原核表达系统表达并纯化出A型口蹄疫病毒VP1蛋白。首先从实验室冻存的含A型口蹄疫病毒的细胞中提取FMDV总RNA,通过RT-PCR获得cDNA。并根据FMDV全基因组序列设计了一对针对VP1基因的引物,通过PCR扩增得到目的基因VP1并亚克隆入pMD 18-T载体。将鉴定出的阳性质粒和表达载体PET32a用BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切回收后连接获得阳性重组质粒PET32-VP1。用IPTG诱导重组质粒表达目的蛋白VP1并用SDS-PAGE进行检测。表达产物用镍亲和树脂进行了纯化。结果证明A型口蹄疫病毒VP1蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达且表达产物得到了纯化,为实验室进一步的研究提供了重要的材料。     

猪骨形态发生蛋白4成熟肽cDNA的克隆及序列分析

目的：克隆猪骨形态发生蛋白4（BMP-4）成熟肽基因。方法：提取猪肾的总RNA,通过RT-PCR技术扩增出目的基因,并将其回收后与pMD18-T载体连接,转化大肠杆菌TOP10感受态细胞,进行阳性克隆的筛选与鉴定。结果：琼脂糖凝胶电泳检测RT-PCR产物,显示结果与预期片段大小一致,质粒PCR检测、酶切鉴定证实重组克隆中插入了PCR产物,测序结果揭示BMP-4成熟肽cDNA长为351bp,编码116个氨基酸。序列对比表明,猪与人、小鼠、牛、绵羊BMP-4成熟肽cDNA序列的同源性分别为94.87%、90.60%、94.87%、94.59%,而相应的氨基酸同源性分别为99.12 %,99.12 %,100 %、100%。 结论：首次成功地克隆了猪BMP-4成熟肽编码基因,对于进一步研究猪BMP-4全基因结构、功能及其与繁殖性能的关系有重要的意义。     

苏云金芽胞杆菌cry2Ac4基因在 大肠杆菌中的表达

在大肠杆菌中表达苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）cry2Ac4基因;笔者以含有Bt WB9菌株cry2Ac4基因的质粒pMD2Ac为模板,利用cry2Ac4基因的特异引物对(ET-F/ET-R)扩增获得该基因,进而将cry2Ac4基因与pET-29a原核表达载体连接;成功构建了重组表达载体并转化大肠杆菌JM109,从阳性转化子中提取重组表达质粒pET-29a-cry2Ac4,再转化大肠杆菌BL21（DE3）pLysS,经IPTG诱导后,对诱导表达产物进行了SDS-PAGE检测;cry2Ac4基因编码的约70kDa蛋白在大肠杆菌中得到了高效表达。     

猪α1干扰素基因的克隆与原核表达

根据猪α1干扰素(pocine interferon-alpha1,poIFN-α1)的全基因序列(EU364896)设计合成1对特异引物,通过RT-PCR从三元杂交仔猪外周血淋巴细胞扩增出poIFN-α1全基因,将该基因克隆到pGEM-T载体,构建重组质粒pGEM-T-poIFN-α1,进行测序。以pGEM-T-poIFN-α1为模板,经PCR扩增带有酶切位点的poIFN-α1基因,将其定向克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中,构建重组表达载体pGEX-6P-poIFNα1,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行蛋白诱导表达和鉴定,并确定蛋白最佳表达条件。序列分析表明,克隆的poIFN-α1基因全长546bp,编码181个氨基酸,前23个氨基酸组成信号肽,无糖基化位点。SDS-PAGE和Western blotting证实重组表达菌经IPTG诱导后,可表达相对分子质量约46ku的融合蛋白(GST-poIFN-α1)。当以1.0mmol/L的IPTG于37℃下诱导表达9h时,蛋白表达量最高。poIFN-α1基因的克隆与表达为进一步研究其抗病毒活性,开发病毒治疗和疫苗免疫增强用生物制剂奠定了基础。     

一种高效、稳定的可溶性原核表达载体的构建及应用

以O型口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因重组克隆载体pGEM-OVP1为模板,设计表达引物,经PCR扩增获得上游带有PelB信号肽编码序列的VP1 C端编码区,将其克隆至该表达载体pET-30a(+)中,构建了可溶性原核表达载体pET-30a-PelB-VP1C.将VP1全长编码区替换VP1C,获得重组原核表达载体pET-30a-PelB-VP1.将两种重组质粒分别转化大肠杆菌工程菌株BL21-(DE3)-plysS,经IPTG诱导表达,实现了VP1全长及其C端的可溶性表达,以金属离子螯合层析法分别对表达的VP1及其C端融合蛋白进行纯化,SDS-PAGE显示纯化的目的蛋白分别在32 ku和20 ku处有单一目的条带,具有较高的纯度.Western blot 分析,VP1蛋白及其C端均可与牛O型口蹄疫病毒阳性血清反应.对重组菌株的连续传代实验证实了该可溶性表达载体的遗传稳定性,显示了该可溶性原核表达载体在蛋白可溶性表达中的应用价值.