山葡萄cDNA-AFLP体系的建立及引物的筛选

以山葡萄品种左山一的叶片和花芽为材料,对cDNA-AFLP体系的几个关键因素进行摸索,建立了适宜山葡萄的cDNA-AFLP反应体系.结果表明,提取山葡萄的花芽RNA适宜用改良的CTAB法,提取叶片RNA适宜用SDS-酸酚法.在2x Y/T Buffer的作用下,500 ng的cDNA利用Mse Ⅰ与EcoR Ⅰ双酶切4 h即可酶切完全,将16℃连接过夜的产物稀释5倍作为预扩增的模板,预扩增产物稀释20倍作为选扩模板能获得带型稳定可重复性好的结果.     

大白菜cDNA-AFLP分析体系的优化

本研究以高感、高抗大白菜小黑点病的大白菜叶柄为试材,对影响cDNA-AFLP分析体系的几个关键因素进行分析,建立了适宜大白菜的cDNA-AFLP分析体系,并得到了较为清晰可辨的cDNA-AFLP图谱。结果表明:试剂盒法提取的NA较完整,纯度较高;400ng的cDNA利用FastDigest EcoRⅠ和Fast-Digest MseⅠ进行快速双酶切50min,酶切充分;在20μL的体系中,连接产物取原液作为预扩增反应的模板,并且预扩增反应的循环数为35,预扩增产物稀释20倍作为选择性扩增的模板,扩增结果最佳;MBI2×PC Master Mixture反应体系满足扩增反应的需要,不需要另外摸索反应条件,节省了试验成本;选用64对AFLP引物进行扩增,筛选出具有多态性条带丰富的AFLP引物45对。本研究为利用cDNA-AFLP分析大白菜小黑点病的的发病机理奠定了基础。     

水稻叶片cDNA-AFLP技术体系的建立和优化

以高温和常温处理的水稻幼苗叶片为材料,对影响cDNA-AFLP分析体系的关键因素进行了分析,建立了适宜水稻的cDNA-AFLP分析体系,并得到了清晰可辨的cDNA-AFLP指纹图谱。结果表明:离心柱式试剂盒提取的RNA较完整,纯度较高;双链逆转录试剂盒形成的cDNA经EcoRⅠ(37℃,2 h)和MseⅠ(65℃,2 h)完全酶切后,4℃连接过夜;20μL的体系中,连接产物稀释10倍液5.0μL作为预扩增的模板,并且预扩增反应的循环数为35,预扩增产物稀释20倍作为选择性扩增的模板,扩增结果较佳;6%PAGE分离快速银染法显示,64对选择性扩增引物中筛选出多态生条带丰富的AFLP引物50对。本研究为利用cDNA-AFLP分析水稻抗高温基因进行深入的研究奠定了基础。     

苜蓿cDNA-AFLP反应体系的建立和优化

以改良的苜蓿雄性不育系叶片为材料,通过RNA提取、反转录、酶切、链接、PCR扩增、凝胶电泳等系列程序的摸索和优化,建立了适宜苜蓿cDNA-AFLP的反应体系,并得到了清晰可辨的cDNA-AFLP指纹图谱.结果如下:cDNA经EcoR Ⅰ和Mse Ⅰ完全酶切后,16℃连接15 h;20μl预扩增体系中加入连接产物2.0μl较适宜,预扩增产物稀释20倍后进行选择性扩增效果最佳.     

辣椒cDNA-AFLP体系的优化与应用

以辣椒花蕾和嫩叶为试验材料,对影响辣椒cDNA-AFLP体系的关键因素进行了探讨,建立了适宜于辣椒基因差异表达的cDNA-AFLP体系。结果表明,Trizol法适用于辣椒花蕾和嫩叶总RNA提取;SMART法合成双链cDNA效率较高;利用Taq I/Ase I分步酶切cDNA各3h可酶切完全;连接产物最佳稀释倍数为15倍;预扩产物稀释15倍经选择性扩增,PAGE电泳可以获得带型丰富且重复性好的结果。辣椒cDNA-AFLP反应体系的建立为辣椒基因的差异表达分析奠定了基础。     

优化的黍子(Panicum miliaceum L.)AFLP分子标记体系及其在真伪杂交种鉴定中的应用

为完成黍子最佳AFLP(amplified fragment length polymorphism)体系的构建,以黍子为研究材料,通过优化AFLP过程的4个限制因素,确定AFLP的最佳反应体系为:选取300 ng DNA进行酶切,将酶切产物稀释0倍作为模板进行预扩增,得到的产物稀释20倍作为模板进行选择性扩增,选用方法二对PCR产物进行银染。应用该最佳反应体系进行黍子真伪杂交种的验证,取得了同样理想的效果,扩增出清晰可辨的条带,鉴定出黍子的真正杂交种。本研究为黍子的分子研究提供了技术基础。     

南瓜矮生性研究的AFLP体系的建立

以南瓜矮生和蔓生的自交系为材料,通过对影响南瓜AFLP反应体系中的关键因素(如DNA的提取方法、酶切和连接反应时间、预扩增产物稀释倍数和银染检测方法等)进行研究,结果表明,采用加入PVP和β-巯基乙醇后的改良CTAB提取法获得的南瓜嫩叶基因组DNA质量较好;5.5 h可以满足酶切和连接反应;酶切连接产物稀释5倍,预扩增...     

油茶cDNA-AFLP技术反应体系建立的研究

以小果油茶和普通油茶的嫩叶及种仁为材料,对影响其cDNA-AFLP反应体系的关键因子进行优化分析,筛选出适合油茶的cDNA-AFLP反应体系。结果表明：分别用EASYspin Plus植物RNA快速提取试剂盒和Trizol法能成功获得高质量的油茶嫩叶和种仁总RNA;从总RNA中分离的mRNA经合成双链cDNA后,用限制性内切酶EcoRⅠ和MseⅠ在37℃下5 h内酶切完全,经5 U T4连接酶16℃连接的产物稀释10倍后可直接用于预扩增;在20μL选择性扩增体系中,以预扩增产物稀释30倍为模版、dNTP (10 mmol/L)1.5μL、引物(10μmol/L)1.0μL、Taq酶用量1.25 U时的扩增效果较好。利用优化体系成功筛选出61对可以获得带型丰富且重复性好的引物组合。差异片段回收及PCR检测的结果表明,优化后的cDNA-AFLP分析体系适用于油茶相关差异基因的表达研究。     

甘肃金鳟AFLP体系建立及应用

甘肃金鳟是我国自主培育的虹鳟新品种,为进行其种质资源研究和遗传管理,以其尾鳍为试验材料,提取基因组DNA,对影响甘肃金鳟扩增片断长度多态性(AFLP)反应体系进行优化,包括模板DNA浓度、基因组酶切时间、选择性扩增中Mg2+、预扩增产物稀释倍数及选扩性引物M+3/E+3配比等进行比较分析,建立了适于甘肃金鳟的AFLP反应体系。即：100 ng 基因组DNA,3 U EcoR I 37℃酶切3 h,再 Mse I 65℃酶切5 h;然后用1 U的T4连接酶连接12 h, 选扩25 μl PCR反应体系中Mg2+2.0 mmol/L,预扩产物稀释30倍,选扩引物M+3/E+3配比为8∶1,所得产物经电泳和银染后可获得清晰条带,效果良好;筛选出了适宜甘肃金鳟品种分析的13对选择性引物。     

甜瓜cDNA-AFLP分析体系的建立

选用新疆甜瓜伽师和皇后为试材,研究了影响cDNA-AFLP反应体系的几个关键因素,建立了适合于甜瓜的cDNAAFLP反应体系.结果表明:适用于甜瓜cDNA-AFLP分析的RNA可以用Trizol试剂提取的总RNA,双链cDNA合成应用置换法,双链酶切用Vsp Ⅰ、Taq Ⅰ和EcoR 、Mse Ⅰ,效果均能达到目标.相比较而言,Vsp Ⅰ、Taq Ⅰ酶切组合更为理想.酶切cDNA用量、连接产物、预扩增产物稀释倍数参照常规AFLP技术中的常用即可满足要求.检测采用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染显色,操作较文献介绍的变性胶方法简单、方便.实验得到了较为理想的甜瓜mRNA指纹图谱,建立的反应体系可以应用于甜瓜差异基因表达分析等方面的研究.     

山女鳟（Oncorhynchus masou masou）AFLP体系建立的研究

山女鳟（Oncorhynchus masou masou）是一种优良的冷水性养殖鱼类,为了进行山女鳟养殖群体的遗传管理,本研究构建了山女鳟的AFLP分析体系,试验采用两组酶切组合酶切山女鳟基因组DNA,并对酶量及酶切时间、预扩增模板用量、预扩产物稀释倍数进行了优化。结果表明,100ng DNA用3U的EcoRI在37℃酶切3h后,再分别用3U的TaqI和Tru9I在65℃酶切4h连接效果最佳,取3μL连接产物进行预扩增,将预扩增产物稀释50倍进行选择性扩增,可以得到清晰的扩增图谱;对两组酶切组合进行对比发现,EcoRI-Tru9I组合扩增的条带数多于EcoRI-TaqI组合,但后者的多态性位点比例高于前者。     

马铃薯种质遗传多样性分析的AFLP反应体系优化与引物筛选

本试验主要对AFLP反应体系进行优化,并用该体系筛选适用于马铃薯种质资源遗传多样性分析的引物。酶切连接、预扩增和选择性扩增体系的优化结果表明,建立的马铃薯AFLP反应体系为:模板DNA160ng,37℃酶切连接12h;预扩增体系中dNTP浓度为0.2mmol/L,TaqDNA聚合酶用量为1U;选择性扩增体系中预扩增产物稀释20倍,引物终浓度为2.5ng/μL。利用优化后的AFLP反应体系,以5个马铃薯品种为试材筛选选择性引物,可以从81对引物组合中选出16对条带丰富且多态性较高的引物组合。本研究为种质资源鉴定、马铃薯遗传多样性以及马铃薯抗病性研究等奠定了良好的基础。     

茶树cDNA-AFLP银染技术体系的建立

为了挖掘安白茶白化期相关的差异基因,建立并优化了茶树叶片cDNA-AFLP扩增反应体系,进行cDNA-AFLP分析。在安吉白茶叶片cDNA-AFLP的试验中,分别对20 μL预扩增和选择性扩增反应体系中的4种反应条件影响因子进行不同梯度优化的研究,包括引物、Mg2+、dNTP及Taq DNA聚合酶的用量。PCR预扩增20 μL反应体系中,引物75 ng/20 μL,Mg2+ 2.0 mM,dNTP 0.2 mM,Taq DNA聚合酶1 U时预扩增效果较好;PCR选择性扩增20 μL反应体系中,引物75 ng/20 μL,Mg2+ 2.5 mM,dNTP 0.2 mM,Taq DNA聚合酶1.5 U时选择性扩增效果较好。通过试验,获得较为理想的预扩增和选择性扩增体系。     

萝卜抽薹性研究的AFLP体系建立与优化

摘要：本研究以萝卜‘春雪总太’为优化材料,对AFLP体系的酶切时间,相关酶、Mg2+、dNTPs的用量,模板稀释倍数以及扩增循环数等6个重要影响因素进行摸索和优化,建立了适合萝卜抽薹紧密连锁基因研究的AFLP分子标记体系。结果表明：在20μL酶切体系中,将400ng的样品DNA用各0.2μLEcoR I和MseI 37℃双酶切10min, 65℃灭活10min;向 5μL酶切产物中加入EcoR I接头和MseI接头各0.5μL,用0.5μL的T4连接酶在20μL的体系中22℃连接过夜;向5μL稀释5倍后的连接产物中加入预扩引物各0.6μL,Mg2+1μL,dNTPs1.5μL,Taq酶0.2μL,ddH2O补齐至15μL,预扩增35个循环;取5μL稀释20倍后的预扩增产物,其他成分用量同预扩增相同,用ddH2O补齐至15μL进行选择性扩增。并将此优化体系在秋白、秋青、春白、秋红、水萝卜五种生态型的16份萝卜材料上进行了验证,电泳条带清楚,多态性强。     

苹果MSAP技术体系的优化及其应用

为建立适合苹果的MSAP(Methylation Sensitive Amplification Polymorphism)反应体系,以‘嘎啦’为材料对MSAP技术中的关键因素进行优化筛选,并用于苹果叶片和愈伤组织的甲基化模式分析。经过不同因素水平摸索,结果表明：600 ng基因组DNA用EcoRⅠ,HapⅡ或MspⅠ各10 U,37℃保温12 h,即可酶切完全。最佳预扩增体系为：酶连产物1 μL、上下游引物各3 μL、2×PCR mastermix 10 μL（Taq酶1 U、dNTPs 5 mM、Mg2+ 30 mM）和ddH2O 3 μL。20 μL选择性扩增体系中,含有60倍稀释的模板DNA 2 μL、上下游引物各3 μL、2×PCR mastermix 10 μL（Taq酶1 U、dNTPs 5 mM、Mg2+ 30 mM）和ddH2O 2 μL。在该体系下选用2对引物对苹果叶片和愈伤组织进行甲基化模式分析,获得了清晰、重复性好的银染指纹图谱。平均每对引物可获得特异性条带12条,共获得特异性条带91条,表明该体系可用于苹果不同发育阶段DNA甲基化模式分析。     

蓖麻标雌/单雌/两性系花序MSAP反应体系的建立

为了建立Lm型雌性系蓖麻不同发育时期的标雌/单雌/两性系花序MSAP反应体系,提取不同类型不同发育时期的花序基因组DNA,混合成基因池;用EcoRⅠ和HpaⅡ/MspⅠ的组合,12 h可将DNA酶切完全;16℃条件下,将酶切产物与EcoRⅠ、HpaⅡ/MspⅠ接头过夜连接;连接产物用于预扩增。优化后的预扩增反应体系为10×PCR Buffer 2.5μL、d NTPs(10 mmol/L)2.5μL、Mg2+(25 mmol/L)2.0μL、模板2.0μL、E0扩增引物(10pmol/μL)1.5μL、H0扩增引物(10 pmol/μL)1.5μL、LA Taq(5 U/μL)0.25μL、dd H2O 12.75μL。预扩增产物稀释10倍后用于选择性扩增。优化后的选择性扩增体系为10×PCR Buffer 2.5μL、d NTPs(10 mmol/L)2.0μL、Mg2+(25mmol/L)4.0μL、模板3.0μL、EX扩增引物(10 pmol/μL)1.0μL、H/MX扩增引物(10 pmol/μL)1.0μL、LA Taq(5U/μL)0.30μL、dd H2O 11.2μL。