色氨酰-tRNA合成酶基因WRS1调控水稻种子发育

【目的】氨酰-tRNA合成酶（aminoacyl-tRNA synthetases, aaRSs）与遗传信息传递密切相关,已发现植物中aaRSs家族蛋白在维持翻译功能之余,还参与配子发生与胚发育、质体的早期发育以及免疫信号的感知与病害防御等生物学过程。本研究利用水稻胚乳发育缺陷突变体,分析水稻色氨酰-tRNA合成酶（WRS1）在胚乳发育中的作用,证明WRS1基因编码一个影响水稻胚乳发育的关键因子。【方法】本研究通过甲烷磺酸乙酯（ethyl methane sulfonate, EMS）诱变籼稻（Oryza sativa subsp. indica）品种N22,筛选到一个稳定遗传的水稻粉质胚乳突变体（wrs1）,图位克隆获得目标基因。对wrs1成熟种子进行形态学观察以及淀粉相关理化性质测定,利用细胞学切片分析wrs1发育中胚乳的结构,利用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR, qRT-PCR）和GUS活性染色分析基因表达模式,通过qRT-PCR比较野生型与突变体花后12 d胚乳中淀粉合成相关基因表达情况,免疫印迹检测野生型与突变体成熟种子中淀粉合成酶蛋白积累情况,使用全自动氨基酸分析仪测定游离氨基酸含量。【结果】 wrs1突变体幼苗表现出明显的发育滞后且逐渐蔫萎死亡,从杂合突变体（WRS1wrs1）中分离到的粉质籽粒呈现明显的腹部皱缩,粒厚、千粒重下降,同时总淀粉含量下降,糊化淀粉的峰值黏度和崩解值均低于野生型。wrs1突变体发育胚乳中复合淀粉颗粒变小,排列疏松。WRS1定位于第12染色体长臂约183 kb的区间内,测序发现编码色氨酰-tRNA合成酶（tryptophanyl-tRNA synthetase, WRS）基因的第6外显子上发生单碱基替换,导致一个保守位置上的甲硫氨酸被替换。wrs1突变体中大部分淀粉合成相关基因表达量下调,且野生型与突变体间基因表达的变化与相应蛋白积累的差异存在不一致的趋势。wrs1突变体籽粒中蛋白质积累降低,而游离氨基酸含量显著升高。【结论】 WRS1编码色氨酰-tRNA合成酶,该基因突变后通过影响氨基酸稳态和蛋白质合成,造成淀粉合成相关基因异常表达从而影响淀粉的合成与积累,导致种子发育缺陷。     

水稻糖质胚乳突变体Sug-11籽粒灌浆过程的淀粉合成关键酶活性及其与淀粉理化特性关系

以水稻糖质胚乳突变体Sug-11与其野生型对照中花11为材料,通过对两者籽粒中可溶性总糖、蔗糖含量和淀粉含量以及有关淀粉品质理化指标的比较,结合籽粒灌浆过程中糖类物质含量、淀粉合成代谢关键酶活性和相关同工型基因转录表达水平的动态测定,从籽粒淀粉合成代谢角度,对水稻糖质突变体Sug-11的籽粒糖类含量变化和千粒重下降的生理原因进行了分析。结果表明,Sug-11糖质突变体与其野生型在灌浆初期的可溶性糖和蔗糖含量差异并不明显,随着籽粒灌浆进程,两者间的籽粒糖分含量差异在灌浆中后期逐步趋于明显;与野生型相比,Sug-11糖质胚乳突变体的稻米直链淀粉含量和直链淀粉碘蓝值显著下降,而淀粉溶解度和支链淀粉碘蓝值则显著升高,糖质胚乳突变对稻米淀粉的理化特性也产生了明显的影响;在籽粒淀粉合成代谢的几个关键酶中,Sug-11糖质突变体籽粒中的DBE活性及其在灌浆过程中的动态变化与其野生型存在明显差异,揭示了胚乳糖质突变体Sug-11籽粒中淀粉积累减少、糖分含量增加主要是由籽粒灌浆中后期的PUL转录表达水平和DBE活性的大幅下降所引起的,而Sug-11的籽粒灌浆不良和千粒重下降等现象,则与其ADPGase活性在籽粒灌浆前期的显著下降存在一定的联系。     

两个垩白突变体的鉴定及突变基因的图位克隆

【目的】研究两个水稻垩白突变体胚乳垩白的形成机制,为稻米品质改良提供理论基础。【方法】以从中花11的EMS突变体库中筛选出的两个稳定遗传的垩白突变体eb6、eb7为材料,对其进行农艺性状、稻米理化性质和遗传学分析,并利用eb6与南京11衍生的F2群体对控制垩白的基因进行图位克隆。同时对候选基因的表达模式及淀粉合成相关基因在突变体及野生型中表达情况进行了分析。【结果】与野生型相比,两个突变体胚乳中央部位呈现白色且不透明,淀粉复合颗粒形状不规则且排列疏松,而突变体胚乳边缘部位与野生型无异,都为半透明状,淀粉复合颗粒呈多面体且排列致密。相对于野生型,突变体eb6、eb7成熟种子中的直链淀粉含量和胶稠度显著降低,蛋白质含量显著升高。RVA谱分析显示突变体淀粉黏滞性明显低于野生型。同时,支链淀粉聚合度分析显示突变体eb6中聚合度(DP)小于16的短链显著增加,DP为16~23的中长链显著减少。遗传分析表明突变体eb6、eb7胚乳垩白表型由单隐性核基因控制,并且它们为一对等位突变体。利用突变体eb6与南京11杂交衍生的F2群体将突变体基因定位在第1染色体长臂上物理距离86.6 kb的区间内。该区间包含22个开放阅读框(ORF),其中ORF13编码腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶大亚基2(Os AGPL2)。序列分析发现eb6与eb7分别在Os AGPL2第3、第7外显子上发生1个单碱基替换,并分别导致一个氨基酸替换。RT-PCR及原位杂交结果显示,Os AGPL2主要在水稻发育中的籽粒中表达。同时Os AGPL2的突变导致了多个淀粉合成相关基因在水稻籽粒灌浆过程中的表达模式发生改变。【结论】突变体eb6、eb7籽粒胚乳出现严重垩白表型为Os AGPL2突变所致。本研究进一步证明了Os AGPL2在调控水稻籽粒胚乳中淀粉的合成、淀粉复合颗粒的形成及稻米理化性质的平衡中起着重要的作用。     

水稻粉质皱缩胚乳突变体fse4的表型分析与基因克隆

【目的】水稻种子主要以淀粉形式储藏能量。淀粉合成需要多种酶类和调控因子参与，机制较为复杂。本研究利用水稻胚乳发育缺陷突变体，克隆和鉴定新的调控淀粉合成相关基因，旨在为研究淀粉合成及其调控提供理论依据。【方法】从化学诱变剂甲基亚硝基脲（1-methyl-1-nitroso-urea, MNU）处理的宁粳3号(Ningjing 3, WT)突变体库中筛选到一个能稳定遗传的胚乳粉质皱缩突变体，命名为fse4 (floury and shrunken 4 )。与籼稻品种Dular杂交获得F1种子（F2），通过图位克隆的策略确定FSE4候选基因。利用杂合植株（FSE4fse4）分离出的粉质种子，观察形态学特征，分析其理化性质。使用扫描电镜和半薄切片技术观察胚乳结构。使用qRT-PCR和免疫印迹分析淀粉合成相关基因表达模式和淀粉合成相关酶类的蛋白积累量。利用全自动氨基酸分析仪测定成熟胚乳各氨基酸含量。【结果】突变体fse4籽粒宽度、厚度以及千粒重显著下降，同时胚乳中总淀粉、总蛋白、直链淀粉含量亦显著下降，而脂肪含量显著上升；淀粉黏度、崩解值和消减值显著低于野生型。突变体fse4中多为单粒型淀粉颗粒，且排列分散。FSE4定位于第5染色体长臂约252 kb的区间内，测序发现编码Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶基因 （Delta 1-pyrroline-5-carboxylate synthetase, P5CS）第1外显子上发生单碱基替换，导致一保守的氨基酸发生变异。突变体fse4中大部分淀粉合成相关基因表达量下调，多种淀粉合成相关蛋白积累量减少。突变体fse4米粉中多种氨基酸含量发生显著变化，游离氨基酸含量是其野生型的3.6倍。此外，外源喷施脯氨酸能部分恢复突变体fse4种子萌发缺陷表型。【结论】FSE4编码脯氨酸合成关键限速酶P5CS，该基因对胚乳中氨基酸的合成及代谢起重要的调控作用，并影响淀粉的合成与积累。     

鸟苷酸激酶OsGK1对水稻种子发育至关重要

【目的】对水稻粉质皱缩突变体fse2进行表型分析及基因克隆,为阐明水稻淀粉合成机制以及胚的发育奠定基础。【方法】fse2来自粳稻品种滇粳优1号的MNU(N-甲基-N-亚硝基脲)诱变突变体库。本研究考查了突变体fse2籽粒的理化性状,利用扫描电镜和半薄切片观察了淀粉颗粒的结构;构建了fse2与N22的F₂群体,通过图位克隆及转基因互补验证确定目标基因;通过qRT-PCR以及GUS活性染色对FSE2进行组织表达分析;免疫印迹分析了突变体中淀粉合成相关基因以及线粒体基因的蛋白变化。【结果】fse2籽粒粉质皱缩,千粒重显著下降;胚乳中淀粉颗粒变小变圆,排列松散,不能形成正常的复合淀粉颗粒;突变体中总淀粉、直链淀粉含量均显著下降,脂肪含量显著上升,突变体淀粉的糊化特性发生明显改变。FSE2编码一个线粒体和质体双定位的鸟苷酸激酶(guanylate kinase),命名为OsGK1。OsGK1在各器官中组成型表达,并在花后6 d的胚乳中表达水平最高。突变体胚乳中淀粉合成相关蛋白水平显著降低,尤其是AGPS2b和PHOI。此外,突变体fse2的胚发育严重受损,导致种子纯合致死;线粒体定位的AOX积累显著增强,而野生型中几乎检测不到,表明线粒体呼吸途径受损。【结论】由于OsGK1的功能缺陷,导致水稻种子中线粒体和造粉体发育异常,进而产生了胚致死以及胚乳粉质皱缩的表型,因此OsGK1对水稻种子的发育至关重要。     

水稻粉质胚乳突变体flo7的理化性质及基因定位

淀粉约占水稻胚乳干物质总量的80%,胚乳中淀粉的组分与含量以及颗粒结构决定了稻米品质。从粳稻品种日本晴(Nipponbare)组培后代中获得了一个稳定遗传的粉质胚乳突变体flo7(floury endosperm 7)。该突变体胚乳表现为白色不透明粉质状,同时突变体种子粒长有所增加,而粒宽、粒厚和千粒重均显著降低。与野生型相比,在灌浆过程中突变体flo7籽粒中干物质的积累量减少,而葡萄糖、果糖等游离糖含量增加。突变体flo7成熟种子的直链淀粉含量和胶稠度显著下降,而碱消值显著增加。胚乳横截面扫描电镜分析发现,突变体flo7胚乳中淀粉颗粒形状不规则,排列疏松。遗传分析表明flo7粉质状胚乳突变表型符合单隐性核基因控制的遗传分离规律。以突变体flo7和南京11杂交衍生的F2群体为材料,利用简单重复序列(SSR)和插入缺失(Indel)分子标记,将flo7定位在第12染色体长臂末端C2-11和C5-15之间,物理距离为95.1kb,该区间内包含13个开放阅读框(ORF)。在籽粒灌浆过程中利用实时荧光定量PCR分析淀粉合成相关基因的表达,发现在突变体中多个淀粉合成相关基因表现出不同程度的上调和下调,表明FLO7在水稻种子中淀粉的合成与调控中起着重要作用。     

小麦淀粉合成关键酶基因和相关蛋白表达对不同施磷量的响应

为深入研究磷素在小麦淀粉产量和品质形成过程中的作用,以新疆冬小麦主栽品种新冬20号为试验材料,研究0 kg·hm^-2（CK）、105 kg·hm^-2（LP）和210 kg·hm^-2（HP）3种施磷（P₂O₅）量对小麦籽粒灌浆特性、淀粉合成关键酶(AGPase和GBSS)活性和基因表达、胚乳可溶性蛋白和淀粉粒结合蛋白含量及谱带特征、胚乳微观特性等的影响。结果表明,籽粒灌浆后期磷肥对粒重的促进作用逐渐增强;低磷（LP）条件下, agp1、 agp2、 gbss1、 gbss2基因表达量显著提高;3个处理下AGPase活性的变化趋势基本一致;籽粒灌浆中期（14～21 d）,低磷处理的GBSS活性显著高于CK;不同磷处理对淀粉粒结合蛋白和胚乳可溶性蛋白含量的影响显著,但对蛋白谱带特征的影响较弱。扫描电镜结果显示,不同磷处理的胚乳淀粉粒形态未发生明显变化;与CK和高磷（HP）处理相比,低磷处理下籽粒胚乳横断面蛋白基质较少,淀粉粒与蛋白质结合较疏松。说明常规施磷（低磷）条件下,淀粉合成关键酶基因（agp和gbss）相对表达量提高或酶活性变化可影响籽粒淀粉合成及胚乳中蛋白与淀粉粒的嵌合度,并最终造成粒重的增加和淀粉特性的变化。     

白粉病对小麦品种西农979籽粒淀粉合成关键酶基因表达的影响

为了揭示白粉病对花后小麦籽粒淀粉合成的影响机制,以小麦品种西农979为材料,利用实时荧光定量PCR技术研究白粉病不同发病程度对小麦籽粒淀粉合成相关酶基因表达的影响。结果表明,随着感病程度的增加,小麦籽粒的腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因AGPase、淀粉分支酶基因SBE和可溶性淀粉合成酶基因SSS的表达均被抑制,其酶活性下降;束缚态淀粉合成酶I基因GBSSⅠ的表达量和酶活性均高于对照;去分支酶基因DBE的表达量与对照相比没有明显变化,但其酶活性在病害高峰期高于对照;支链淀粉含量和总淀粉含量显著降低,而直链淀粉含量增加。由此可知,白粉病通过改变籽粒淀粉合成相关酶基因的表达及活性而影响淀粉的积累。     

不同小麦品种籽粒淀粉合成酶基因的表达及其与淀粉积累的关系

为探寻不同专用类型小麦籽粒品质调控的途径,以不同专用类型小麦品种为材料,比较了其籽粒淀粉合成酶基因表达、淀粉合成酶活性以及淀粉积累速率动态特征,并分析了三者之间的相关性。结果表明,整个灌浆期间,籽粒淀粉合成酶基因（AGPase1、GBSSI、SSSIII、SBEI）相对表达量、淀粉合成酶（AGPase、GBSS、SSS、SBE）活性及直、支链淀粉积累速率均表现为强筋小麦中优9507〉中筋小麦淮麦18〉弱筋小麦宁麦9号〉糯小麦Wx11。相关分析表明,AGPase1、SSSIII、SBEI基因的相对表达量最大值与AGPase、SSS、SBE活性峰值均呈极显著正相关;GBSSI基因相对表达量最大值与GBSS活性峰值相关不显著;4种淀粉合成酶基因相对表达量最大值均与籽粒直、支链淀粉及总淀粉积累速率峰值呈极显著正相关;4种淀粉合成酶活性与籽粒直、支链淀粉及总淀粉积累速率均呈极显著正相关。     

玉米ae基因的研究进展

ae基因是一种胚乳突变基因。玉米ae突变体的表现型为玻璃状、无光泽胚乳。ae基因编码淀粉分枝酶Ⅱb(SBEⅡb)是SBEⅡb的结构基因,ae基因定位在玉米第5条染色体长臂上,在玉米中是单拷贝基因。在ae突变体胚乳中,SBEⅡb的活性缺失,子粒的表观直链淀粉含量增加,同时支链淀粉的α-l,6糖苷键分支点的数量降低。本文对ae基因的结构、功能、特性等作了一个较全面的综述,对其做更深入的研究,以改良淀粉品质。     

Phenotypic Analysis and Gene Cloning of Rice Floury Endosperm Mutant fse4

【Objective】Starch is the main energy reserve of rice endosperm. The biosynthesis of starch is complex, requiring a large number of synthetic enzymes and regulators. Screening rice endosperm defective mutants and cloning the underlying genes will lay theoretical basis for starch biosynthesis and its regulation. 【Method】 A stable genetic floury and shrunken endosperm mutant termed as fse4 (floury and shrunken4) were obtained from the mutant library of Ningjing 3 (WT), which was induced by N-methyl-N-nitrosourea (MNU). An F2 mapping population was generated by crossing the fse4 mutant with Dular (an indica rice variety) and the gene was finally isolated. The floury seeds segregated from the fse4 heterozygous plants were used to observe the morphological features, and the physicochemical properties of the brown rice flour were analyzed. The endosperm structure was observed with a scanning electron microscopy by the semi-thin section technology. The expression of starch synthesis related genes during grain filling was determined by qRT-PCR; Immunoblotting was used to detect the accumulation of proteins related to starch synthesis. The amino acids contents of each mature endosperm were determined with the fully automatic amino acid analyzer.【Result】The 1000-grain weight and grain size were significantly reduced in fse4. Compared with WT, the contents of total starch, amylose and total protein were signi?cantly lower in fse4, while the lipid content was signi?cantly higher. The starch viscosity, breakdown viscosity and setback viscosity of the fse4 mutant were lower than WT. The endosperm of the mutant had many single dispersed starch granules with large spaces between each other. Using 1568 recessive individuals, FSE4 was narrowed down to a 252 kb region. Sequencing revealed a single base substitution in the first exon of the delta 1-pyrroline-5-carboxylate synthetase (P5CS), resulting in a conserved amino acid variation. Most of the genes related to starch synthesis were downregulated in fse4 and the protein accumulation related to starch synthase were reduced. The contents of various amino acids in fse4 rice flour were increased or decreased, the total free amino acids contents in fse4 seeds was 2.6 times higher than those in WT. Exogenous proline was applied during the germination of fse4 seeds, and the embryonic lethal phenotype was partially recovered.【Conclusion】FSE4 encode the key rate-limiting enzyme P5CS of proline synthesis, which plays an important role in the biosynthesis and metabolism of amino acids in endosperm and affects the accumulation of starch.     

玉米自交系齐319空间诱变系的生物学效应分析

以两份玉米子粒类型空间诱变系SP-M1、SP-M2以及野生型玉米自交系齐319为试验材料,对田间农艺性状、穗部性状、子粒的营养品质性状和胚乳内部显微结构进行分析。结果表明,与野生型相比,两个诱变系在株高、穗位高、粒长、百粒重等田间农艺性状和穗部性状上发生显著或极显著变异,且变异方向不同,SP-M1和SP-M2赖氨酸含量显著高于野生型,SP-M2淀粉含量显著高于野生型,蛋白质含量显著低于野生型。2个诱变系与齐319在胚乳边缘组织、胚乳内部组织、淀粉粒、基质蛋白等结构存在差异,淀粉粒的组成比例和排列顺序是影响胚乳超微结构差异的主要原因。     

Tryptophanyl-tRNA Synthetase Gene WRS1 Regulates Rice Seed Development

【Objective】Aminoacyl-tRNA synthetases (aaRSs) are closely related to the transmission of genetic information. Besides translation, aaRSs in plants participate in gametogenesis and embryo development, early plastid development, immune signal perception and disease defense. In this study, we used a rice endosperm defective mutant to analyze the function of tryptophanyl-tRNA synthase (WRS1) during seed development, proving that WRS1 gene encodes a key factor affecting rice endosperm development. 【Method】In this study, a stably-inherited rice floury endosperm mutant (wrs1) was screened from the mutant library of indica cultivar N22 (Oryza sativa subsp. indica) induced by ethyl methane sulfonate (EMS). Map-based cloning and complementation test identified the target gene. Morphological observation and starch physicochemical properties of wrs1 mature seeds were analyzed. Semi-thin sections were prepared to observe the developing endosperm structure with a scanning electron microscope. qRT-PCR and GUS staining were performed to analyze the expression of WRS1. The expression of starch synthesis related genes in the endosperm at 12 days after flowering was determined by qRT-PCR, and these protein expression levels in mature seed were detected by immunoblotting. The free amino acid contents of mature seeds were measured with a fully automatic amino acid analyzer. 【Result】The seedlings of wrs1 were featured by obvious delay in development and finally withered and died. The floury grains isolated from the heterozygous mutant (WRS1wrs1) showed shrunken belly, decreased grain thickness and thousand-grain weight. Total starch contents, the peak viscosity and breakdown viscosity of pasting starch were lower in wrs1. The compound starch granules in developing endosperm of wrs1 were smaller and loosely arranged. WRS1 was restricted to the 183 kb region of the long arm of chromosome 12. Sequencing revealed a single base substitution in exon 6 of the tryptophanyl-tRNA synthetase gene (WRS1), resulting in a substitution of methionine. The expression of most starch synthesis-related genes in wrs1 was down-regulated, while these proteins showed different accumulation levels. The contents of proteins in wrs1 grains were decreased, while free amino acids contents were significantly increased. 【Conclusion】WRS1 encodes tryptophanyl-tRNA synthase. Mutation of this gene affects amino acid homeostasis and protein synthesis in rice endosperm, resulting in abnormal expression of the genes in starch synthesis pathway which affects starch synthesis and accumulation, and eventually lead to seed development defects.     

利用分子标记定位玉米小粒突变体mn7基因的研究

利用甲基磺酸乙酯(EMS)对玉米自交系郑 58进行诱变，获得 1个可以稳定遗传的小粒突变体mn7(miniature 7)。mn7成熟子粒表现为体积变小、子粒偏白、胚乳发育缓慢，百粒重降低 60.2%，粒长、粒宽、粒厚均极显著降低。mn7突变体的子粒在授粉后 15 d即可观察到明显小于野生型的子粒。对其自交后代和回交后代的遗传分析表明，该性状受隐性单基因控制。用mn7纯合体与自选玉米自交系 19HL3012杂交构建的包含 348个个体的 F₂分离群体，将该基因定位于玉米第 7染色体上 bin7.02区域内分子标记 umc2327和 SYM232之间 5.8 cM的范围内，距umc2327为 4.4 cM，距 SYM232为 1.4 cM。初步的生物信息学分析表明， mn7可能是 1个新基因或新等位基因。