2个野扁桃自交不亲和S-RNase基因全长的克隆与序列分析

【目的】克隆新疆野扁桃(Amygdalus ledebouriana Schlecht.)自交不亲和性花柱特异性决定因子编码基因SRNase全长序列,为自交不亲和性的分子调控奠定基础。【方法】以新疆野扁桃花柱为试材,利用RT-PCR和RACE技术克隆S-RNase基因全长,采用BLAST和ORF Finder对核酸序列进行分析,利用CDD、Prot Param、Tmpred、Signal P、Target P、SOPMA、DANMAN、MEGA6和Prot Fun对推导的氨基酸序列进行分析。【结果】克隆到Pt S16-RNase基因和Pt S17-RNase基因,2者均属于RNase T2基因家族,与其他多种植物的S-RNase基因的序列相似度为83%~98%,序列均具有S-RNas蛋白典型结构。Pt S16-RNase基因ORF长690 bp,编码229个氨基酸,Pt S17-RNase基因ORF长678 bp,编码225个氨基酸。预测2个S-RNase蛋白均为亲水性、不稳定的分泌蛋白,二级结构均以α-螺旋、延伸链和无规卷曲为主,在蔷薇科李属植物中具有较高的系统进化一致性,可能的主要功能为水解酶和激素。【结论】获得2个新疆野扁桃自交不亲和性花柱特异性决定因子编码基因S-RNase全长序列。     

2个中亚杏S-RNase基因全长的克隆与序列分析

【目的】克隆中亚杏(Prunus armeniaca)品种自交不亲和花柱S-RNase基因全长序列,为分子手段调控杏自交不亲和性状奠定基础。【方法】以新疆栽培杏品种‘索格佳娜丽’和‘赛买提’为试材,利用RT-PCR克隆2个品种的花柱SRNase基因c DNA片段,RACE技术进行c DNA全长克隆,采用BLAST进行序列比对,Protparam软件分析2个基因的编码蛋白特性,MEGA 5.0构建进化树。【结果】从‘索格佳娜丽’中克隆了S_(52)-RNase(KF951503)基因,从‘赛买提’中克隆了一个新的S_(53)-RNase(KF975455)基因DNA和c DNA全长序列。S_(52)-RNase的DNA全长2 200 bp,c DNA全长765 bp,ORF(开放阅读框)长681 bp,编码226个氨基酸;S_(53)-RNase的DNA全长1 664 bp,c DNA全长907 bp,ORF长732 bp,编码242个氨基酸。BLASTP比对显示:这2个基因都具有保守的RNase-T2基因结构,属于RNase-T2家族。预测相对分子质量分别为26.5 ku和27.5 ku,等电点为9.36和9.03,都属于亲水性蛋白。进化分析表明,S_(52)与李(Prunus salicina,S_7)、S_(53)与大岛樱(Prunus speciosa,S_(13))亲缘关系最近,S_(52)和S_(53)处在2个不同的分支上,表现出较高的序列多态性,表明2个基因亲缘关系较远。【结论】获得了2个中亚杏品种自交不亲和花柱S-RNase基因全长序列。     

中国樱桃泰山干樱S-RNase基因的克隆及序列分析

以中国樱桃品种泰山干樱为试材,利用李属植物C2、C5保守区引物,扩增花柱S-RNase基因,获得4个S等位基因,测序结果表明序列大小分别为:1608、950、796、504bp。根据同源比较发现大小为796bp的等位基因与基因库中登录的S1-RNase为同一基因,其它3个S-RNase基因为首次报道,依序列大小分别命名为S2(1608bp,登陆号EF541168)、S4(950bp,登陆号EF541173)和S6(504bp,登陆号EF541172)。序列分析表明S2-RNase在C3区存在终止密码子,导致翻译提早终止;S4-RNase的C5区前有插入片断;S6-RNase在高变区比其它S等位基因少一个氨基酸残基。氨基酸序列同源性比较分析表明,中国樱桃S-RNase与樱花、扁桃的相似性高。在系统进化树中中国樱桃的4个S-RNase基因的氨基酸序列和樱花、扁桃、甜樱桃、酸樱桃等一起归于李亚科。     

梨自交不亲和基因克隆及其进化分析

【目的】获得梨S-RNase基因全长序列及其进化、遗传多态性情况。【方法】设计特异性引物扩增梨S42-RNase基因组DNA全长序列,利用RT-PCR结合cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术获得其cDNA全长序列。构建梨属植物S-RNase基因编码区和高变区(hyper variable region,HV)内含子的系统发育树。【结果】梨S42-RNase基因编码226个氨基酸,包含由27个氨基酸组成的信号肽,由11、11、6、8、7个氨基酸组成的5个保守区以及HV区插入的335 bp内含子序列。系统进化树显示,梨S-RNase基因编码区和HV区内含子的拓扑结构既相似又有差异。编码区Normalized dN-dS结果显示,除了HV区外还有几个区域存在大量的非同义替换,表明对阳性选择具有很高的敏感性。【结论】梨S-RNase基因编码区和HV区内含子的进化存在一定的关联性,除HV区外还存在其他区域参与梨雌蕊与花粉间特异识别。梨S-RNase基因编码区进化动力源自其编码特异识别蛋白的功能,是平衡选择的结果。HV区的内含子序列表现出很高的长度多态性,进化受到负选择的压力。     

枇杷属植物3个新S基因鉴定及大渡河枇杷分类地位的新证据

【目的】鉴定枇杷属普通枇杷野生种、栎叶枇杷和大渡河枇杷3个种的S-RNase基因型,为利用其优良性状开展种质创新,以及大渡河枇杷分类地位的探讨提供科学依据。【方法】以苹果S-RNase基因高度保守区设计兼并引物对3个种的基因组DNA进行PCR扩增,片段回收、克隆及测序,分别采用BLASTn、BLASTx、DNAMAN和CLUSTALW软件进行同源性检索、序列比对和结构分析。【结果】从参试的3个种中共分离了4个S等位基因,分别为S2-RNase、S26-RNase、S32-RNase和S34-RNase,其中S26-RNase、S32-RNase和S34-RNase为新分离的枇杷S-RNase基因,GenBank登录号分别为:MG765271、MG846012和MG812504。所克隆获得的4个枇杷S-RNase基因与苹果S-RNase基因的氨基酸序列结构相同,具有5个保守区(C1、C2、C3、RC4和C5)和1个高变区(HV)。此外,所获得的4个枇杷S-RNase基因电泳图谱及同源性和进化分析结果表明,大渡河枇杷可能为普通枇杷和栎叶枇杷的杂交后代。【结论】确定了普通枇杷野生种、栎叶枇杷和大渡河枇杷的S-RNase基因型分别为S2S26、S32S34和S26S32。大渡河枇杷S-RNase基因型及S-RNase的同源性和系统进化分析结果支持其可能为普通枇杷和栎叶枇杷杂交后代的结论。     

新疆野扁桃六个新S-RNase基因的克隆和序列分析

以我国闻名于世的珍稀野生果树新疆野扁桃为试材,利用蔷薇科果树自交不亲和性通用引物组合,采用S-RNase等位基因PCR扩增,RT-PCR和RACE等技术方法,克隆了新疆野扁桃不同株系的S-RNase基因,以期为新疆野扁桃自交不亲和分子机理的进一步研究提供基本的资料。结果表明:从新疆野扁桃不同株系中克隆鉴定出了6个新的S-RNase基因,分别命名为PteS_(10)(GeneBank登陆号:KJ755352),PteS_(11)(GeneBank登陆号:KJ755353),PteS_(12)(GeneBank登陆号:KJ755354),PteS_(13)(GeneBank登陆号:KJ755355),PteS_(14)(GeneBank登陆号:KJ755356)和PteS_(15)(GeneBank登陆号:KJ755357);并对这6个新基因进行了序列生物信息学分析,为基于新疆野扁桃自交不亲和特性的遗传改良以及分子调控模式奠定试验基础。     

‘金坠梨’自交亲和性突变机制的初步研究

 自交不亲和性品种鸭梨的芽变品种‘金坠梨’自花授粉能结实, 但其自交亲和性突变机制至今不祥。本研究结果表明, 鸭梨自花授粉结实率仅2% , 自花花粉管在花柱中上部已经停止生长, 而金坠梨自花授粉结实率高达76% , 自花的花粉管能正常生长至花柱基部; 鸭梨花柱能够接受金坠梨花粉并受精结实, 而金坠梨花柱却与鸭梨花粉杂交不亲和; 进一步鉴定出了鸭梨和金坠梨基于S-RNase基因的S基因型, 发现两者S基因型相同, 均为S₂₁S₃₄ ; 通过克隆两品种S-RNase基因cDNA全长序列并进行比较分析发现, 该两品种的1对雌蕊S-RNase基因在核苷酸序列上完全相同, 且S-RNase基因均正常表达, 表达量没有明显差异, 从分子水平上证实了金坠梨在花柱方面和鸭梨并无差异, 可能是花粉S 基因发生突变, 导致了自交不亲和性功能的丧失, 表现出自花授粉能够结实。     

杜梨2个MYB转录因子基因的克隆及序列分析

【目的】克隆杜梨(Pyrus betulifolia Bunge)MYB家族的2个基因(Pb3RMYB和Pb4RMYB),分析其序列特征,为研究其调控的分子机制奠定基础。【方法】利用RT-PCR和RACE技术克隆杜梨Pb3RMYB和Pb4RMYB的c DNA序列全长;利用BLAST和ORF Finder对核酸序列进行分析,利用CDD、Prot Param、TMHMM、Signal P、Plant-m Ploc、SPOMA、DANMAN、MEGA6等软件对氨基酸序列进行分析。【结果】克隆得到Pb3RMYB和Pb4RMYB基因全长,Gen Bank登录号分别为KX272614和KX272615。2者均含有MYB保守结构域,二级结构均以无规则卷曲、α-螺旋、延伸链和β-折叠为主,亚细胞定位分析表明2者均定位于细胞核中。其中,Pb3RMYB属于3R-MYB亚家族,全长2 355 bp,ORF长1 710bp,编码569个氨基酸,蛋白分子质量约为62 077.3 Da,等电点为7.08;BLAST分析表明Pb3RMYB与已报道的其他物种3RMYB具有较高的相似度。Pb4RMYB属于4R-MYB亚家族,全长3 625 bp,ORF长2 913 bp,编码970个氨基酸,蛋白分子质量约为109 600.6 Da,等电点为7.41。【结论】获得了2个杜梨MYB基因Pb3RMYB和Pb4RMYB,分别属于3RMYB和4R-MYB亚家族。     

新疆野扁桃五个自然分布居群S基因型的鉴定及发生频率分析

以新疆野扁桃5个自然分布居群的150个株系为试材,采用生物统计学的方法,研究了新疆野扁桃5个自然分布居群的S基因类型及其发生频率。旨在为新疆野扁桃资源的有效保护与合理利用及该物种自交不亲和性进化机理提供科学依据。结果表明:在受试株系中共鉴定出6个S-RNase基因,S基因型有11种类型,各基因型组成在不同居群中的存在比率是不均等的,有占主导地位的S基因型;还有一些S基因型是某个居群特有的;也有一些S基因型出现的比率很低,变化差异较大;表明S-RNase基因经历了一定的进化历程。     

扁桃SLF基因和S-RNase基因的克隆及表达分析

 以扁桃‘Pioneer’品种为材料, 利用RT-PCR及RACE技术, 克隆了1个新的SLF ( S LocusF-box ) 基因(PdSLF1) 和两个新的S-RNase基因( PdSm 和PdSn) 的cDNA。PdSLF1全长1 331 bp, 编码376个氨基酸; PdSm 全长826 bp, 编码228个氨基酸; PdSn基因全长878 bp, 编码227个氨基酸。与公共数据库中的序列进行相似性比较, 发现这3个基因所编码的氨基酸序列与其它蔷薇科植物相应基因的氨基酸序列均具有较高的一致性, PdSLF1为70.2% ～84.8% , S-RNase为59% ～83.9%。PdSLF1基因在花药中专一性表达, 而PdSm 和PdSn基因在雌蕊中专一性表达。     

‘奥嗄二十世纪’梨自交亲和性分子机制及遗传特性研究

 ‘奥嗄二十世纪’是自交不亲和性梨品种'二十世纪'的自交亲和性花柱突变体,花粉自交不亲和性功能正常,其自交亲和性突变的分子机制及遗传特性目前仍有争议。本研究通过田间自花及相互授粉以及基因组、mRNA转录和蛋白质水平比较,分析‘奥嗄二十世纪’、‘二十世纪’及其后代S-RNase基因的存在与否、表达特性及其在后代中的遗传。结果显示,‘奥嗄二十世纪’花柱S₂-RNase基因的核苷酸序列和表达特性与其原始品种‘二十世纪’的完全一样;而S4-RNase基因信号比其原始品种‘二十世纪’的弱,而且也在花柱中正常表达(包括转录和翻译水平),但表达量低;然而在其自交亲和后代基因组中检测不到S₄-RNase基因。本研究表明,‘奥嗄二十世纪’基因组中存在花柱S₄-RNase基因,但不能遗传给后代。     

苹果花粉中与花柱S-RNase互作的γ-硫堇筛选及鉴定

以‘国光’苹果（S1S2）花粉为材料,成功构建了酵母pGADT7-cDNA文库,转化效率约为1.2×106.μg-1,插入片段大小在300~2000bp之间。通过酵母双杂交方法,用苹果S2-RNase的C2HVC3区筛选文库获得一个长505bp的cDNA片段,经分析发现该cDNA序列上有一个261bp的开放阅读框（ORF）,该ORF编码一个具N端信号肽的多肽,该成熟多肽由64个氨基酸组成,富含带正电荷的赖氨酸和精氨酸,其C端有8个半胱氨酸和一个γ-硫堇功能域,结构预测显示其具有一个α螺旋,3个β折叠,4个二硫键,由此,推断其为苹果γ-硫堇,命名为MdD1。RT-PCR分析发现：MdD1基因在‘国光’苹果叶片、萼片、花瓣、子房、花药和花柱等组织中都有表达,但花药中表达量最高。酵母双杂交结果表明MdD1除了与苹果S2-RNase的C2HVC3区互作外,还与S1-RNase的C2HVC3区,S1、S2-RNase的成熟多肽区存在互作。初步认为：苹果γ-硫堇可能通过与S-RNase非特异性互作,作为花粉非S因子参与自交不亲和反应。     

苹果花粉中与花柱S-RNase互作的γ–硫堇筛选及鉴定

 以‘国光’苹果（S1S2）花粉为材料,成功构建了酵母pGADT7-cDNA文库,转化效率约为1.2 × 106 · μg-1,插入片段大小在300 ~ 2 000 bp之间。通过酵母双杂交方法,用苹果S2-RNase的C2HVC3区筛选文库获得一个长505 bp的cDNA片段,经分析发现该cDNA序列上有一个261 bp的开放阅读框（ORF）,该ORF编码一个具N端信号肽的多肽,该成熟多肽由64个氨基酸组成,富含带正电荷的赖氨酸和精氨酸,其C端有8个半胱氨酸和一个γ–硫堇功能域,结构预测显示其具有一个α螺旋,3个β折叠,4个二硫键,由此,推断其为苹果γ–硫堇,命名为MdD1。RT-PCR分析发现：MdD1基因在‘国光’苹果叶片、萼片、花瓣、子房、花药和花柱等组织中都有表达,但花药中表达量最高。酵母双杂交结果表明MdD1除了与苹果S2-RNase的C2HVC3区互作外,还与S1-RNase的C2HVC3区,S1、S2-RNase的成熟多肽区存在互作。初步认为：苹果γ–硫堇可能通过与S-RNase非特异性互作,作为花粉非S因子参与自交不亲和反应。     

扁桃AcCBF1转录因子的克隆及表达分析

【目的】分离和克隆新疆栽培扁桃CBF1转录因子基因,了解其在扁桃响应环境胁迫和逆境相关激素诱导的表达情况。【方法】以新疆扁桃幼苗为试验材料,对其进行低温、干旱、盐及ABA处理,使用PCR技术从新疆扁桃‘双果’克隆得到CBF1转录因子基因,通过农杆菌将35S-Ac CBF1-GFP融合质粒转化洋葱表皮细胞后在激光共聚焦显微镜下观察结果,并通过实时荧光定量PCR技术分析了SG-Ac CBF1转录因子基因在不同非生物逆境胁迫下的表达情况。【结果】序列分析表明,该基因编码框为729 bp,编码242个氨基酸,蛋白质分子量为27.405 ku,命名为SG-Ac CBF1,GenBank登录号为KM245571。氨基酸序列同源比对分析证实,SG-Ac CBF1属于CBF转录因子家族基因。系统发育树分析表明,SG-Ac CBF1与甜樱桃Pa DREB1的亲缘关系最近。亚细胞定位分析显示,SG-Ac CBF1蛋白定位于细胞核中。实时荧光定量PCR分析结果表明,低温、干旱、盐及ABA均能诱导SG-Ac CBF1基因表达。【结论】SG-Ac CBF1转录因子具有核定位功能,并参与了植物对逆境胁迫的调控。由于该转录因子属于家族基因,因此其对环境胁迫响应的强弱还有待探讨。     

桃SFB2m参与S-RNase泛素化降解途径

【目的】自交亲和特性的产生可由多种因素导致，其中S-RNase被泛素化标记后移动到26S蛋白酶体中被降解这一途径，是显现自交亲和的重要原因。探究桃SFBs在S-RNase泛素化降解过程中的作用，为桃自交亲和机制的研究提供参考。【方法】通过生物信息学方法对PpSFBs和PpSLFLs进行基因定位和共线性分析，使用PCR确定PpSFBs在花器官中的特异表达位置，利用BiFC验证PpSFBs与S-RNase的互作后，通过S-RNase体外泛素化实验和寡核苷酸转染沉默PpSFBs实验来探究PpSFBs在S-RNase泛素化降解途径中的作用。【结果】PpSFBs和PpSLFLs无共线性关系；PpS1/2/4-RNase在花柱中特异性表达，PpSFB1m/2m/4m在花粉中特异性表达，PpSLFL1/2/3在不同桃品种中差异性表达，PpSLFL2在龙1-2-4品种中不存在；通过BiFC技术证明，PpS1/2/4-RNase分别与PpSFB1m/2m/4m和PpSLFL1/2/3互作。体外泛素化实验证明，PpSFB2m具有与PpSLFL2相似的功能，能泛素化PpS2-RNase。寡核苷酸转染实验证明...     

甜樱桃‘拉宾斯’自交亲和性与SFB4′基因的关系研究

甜樱桃品种‘拉宾斯’与‘雷尼’均为S1S4基因型。调查其自花结实率,‘拉宾斯’为31.3%,表现自交亲和;‘雷尼’为0,表现为自交不亲和。将‘拉宾斯’与‘雷尼’相互授粉,‘拉宾斯’为父本时表现亲和,反之不亲和,推断‘拉宾斯’的自交亲和性由花粉侧突变导致;调查花粉萌发率,‘拉宾斯’为58.08%,‘雷尼’为57.82%。鉴定‘拉宾斯’自交后代及其与‘雷尼’杂交后代的S-RNase的基因型,发现所有后代中均出现S4基因型,部分后代中出现S1基因型,证明‘拉宾斯’花粉育性是正常的,其亲和性可能是由S4基因座上花粉侧的基因突变导致。测序发现‘拉宾斯’花粉SFB4′在911 bp处有4个碱基缺失。分析‘拉宾斯’花粉SFB4′与花柱S4-RNase的连锁性,发现两者连锁率为100%。以‘拉宾斯’为父本的带有SFB4′的杂交后代的自花结实率为23.3%~61.4%,表现自交亲和,说明来源于‘拉宾斯’的SFB4′基因与自交亲和性有关。RT-PCR及测序显示‘雷尼’SFB4与‘拉宾斯’SFB4′均能正常转录,但4个碱基缺失导致其C端翻译提前终止,原核表达SFB4和SFB4′蛋白发现SFB4略大于SFB4′,推测是由于SFB4′的翻译提前终止导致的。以上结果表明:‘拉宾斯’的自交亲和性可能是由花粉侧SFB4′C端的氨基酸缺失导致,该缺失可能使其丧失了与S-RNase的识别能力。     

4个枇杷品种S基因型鉴定及新基因S_(31)-RNase序列分析

【目的】鉴定‘黄密’、‘贵妃’、‘早红’和‘软条白沙’4个枇杷品种的S基因型,为其生产栽培合理选择授粉树及杂交育种亲本选择提供科学依据。【方法】以苹果S基因高度保守区设计兼并引物对4个品种的基因组DNA进行PCR扩增,片段回收、克隆及测序,分别采用Blast软件和Bioedit软件进行同源性检索和结构分析。【结果】从参试的4个品种中共分离了4个S等位基因,分别为S2、S5、S6和S31,其中S31-RNase为新分离的枇杷S-RNase基因,Gen Bank登录号为:KC131133。所克隆获得的4个枇杷S-RNase基因均克隆到4个保守区(C2、C3、RC4和C5)和1个高变区(HV),具有与苹果S基因相同的氨基酸序列结构。【结论】确定了参试4个枇杷品种S基因型分别为:‘贵妃’S2-S6、‘黄密’S2-S5、‘早红’S5-S6、‘软条白沙’S6-S31。     

新疆蔷薇科扁桃类植物自交不亲和性的分子机制

蔷薇科扁桃类植物是具有重要经济、研究价值的园艺果树类植物,该类果树植物家族均为自交不亲和性,自花授粉并不能正常结实,在其生长和生产过程中都需要进行异花授粉。扁桃类果树植物的自交不亲和属于配子型自交不亲和类型,是由花粉配子体核基因决定花粉与雄蕊的不亲和反应,即当花粉中的一个S等位基因与花柱中的一个等位基因相同时即表现不亲和。不亲和反应的细胞学特征是花粉管生长在花柱中受阻。该文对植物自交不亲和性方面的分子机制在蔷薇科扁桃类果树作物上的反映研究进展进行了综述,并着重阐述了新疆分布的独特的栽培扁桃和野生扁桃自交不亲和性S-位点基因的研究进展,以期为今后更深入的研究提供了重要的基础。     

香蕉条斑病毒ORF Ⅰ基因克隆及编码蛋白和同源物的生物信息学分析

【目的】探明杆状DNA病毒属病毒的ORFⅠ基因功能。【方法】本研究从香蕉条斑病毒云南分离株(BSV-YN)中克隆了BSV ORFⅠ基因,通过核苷酸和氨基酸序列分析和同源关系分析,确定了BSV-YN的分类地位;对其编码蛋白及同源物的理化性质、氨基酸序列组成、亲疏水性、跨膜区域、信号肽、亚细胞定位、磷酸化位点、同源结构域、蛋白二级和三级结构等进行预测和分析。【结果】BSV ORFⅠ基因片段大小为528 bp,编码175个氨基酸,通过核苷酸和氨基酸序列分析和同源关系分析,确定了BSV-YN属于BSGFV种。生物信息学分析表明,BSV-YN ORFⅠ及同源蛋白都是不稳定的、亲水性蛋白,以丝氨酸和苏氨酸磷酸化为主。这些蛋白二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲组成,无信号肽或跨膜区域。亚细胞定位预测表明,BSV-YN ORFⅠ及同源蛋白主要在细胞核分布,推测它们在病毒感染的宿主细胞核中发挥重要作用。【结论】推测BSV-YN ORFⅠ在病毒感染的宿主细胞核中参与病毒复制、转录等相关过程。本研究为进一步开展该蛋白的功能研究提供科学线索。     

白梨新S基因的克隆

 采用PCR - RFLP检测、DNA序列分析和田间杂交试验, 从白梨中分离鉴定了1个新的S-RNase基因。该S-RNase基因PCR扩增产物大小与S-RNase基因PCR产物相似, 为450 bp左右。但PCR -RFLP和DNA序列分析均表明, 它与S₈-RNase基因存在较大差异, 该基因内含子为252 bp, 而S₈-RNase的内含子为234 bp, 并在高变区中具有10个氨基酸出现替换, 有两个氨基酸出现缺失。而该S-RNase基因却与S₁₂-RNase基因具有较高的相似性, 在HV区中只有1处碱基被替换, 周边区中有10处出现碱基替换或缺失。因此, 继梨S18-RNase基因, 将它命名为S₁₉-RNase基因(AY250987) 。与S 基因型已确定的梨品种的杂交坐果率也说明了该基因是一个新的S-RNase基因。