番茄环斑病毒单克隆抗体的制备及检测

将纯化的番茄环斑病毒(Tomato ringspot virus,ToRSV)制剂免疫BALB/c小鼠,末次免疫后第3天取其脾细胞与SP2/0细胞融合,采用选择性培养基、有限稀释法克隆和间接ELISA方法进行筛选,成功获得了2株分泌ToRSV单克隆抗体的杂交瘤细胞株并分别命名为1H8、1D4.用间接ELISA方法对所获得的2个杂交瘤细胞株进行亚型鉴定均为IgG1亚类.间接ELISA效价测定结果1H8为1:105,1D4为1:106.TAS-ELISA实验结果表明此2株杂交瘤细胞所分泌的单克隆抗体均能与本研究室保存的从德国引进的番茄环斑病毒分离物、从美国ATCC引进的番茄环斑病毒分离物PV-100、PV-174、PV-239发生特异性反应,而不与同属其它3种病毒:烟草环斑病毒(Tobacco ringspot virus,TRSV)、南芥菜花叶病毒(Arabis mosaic virus,ArMV)、马铃薯黑环斑病毒(Potato black ringspot virus,PBRSV)发生反应.     

与瓜类褪绿黄化病毒P22蛋白互作的寄主因子的筛选

为阐明瓜类褪绿黄化病毒(CCYV)的侵染机制,筛选与P22互作的寄主因子.采用免疫沉淀技术结合质谱分析共获得128个寄主蛋白.KEGG分析发现,所获得的寄主因子主要参与到寄主体内的碳水化合物代谢、能量代谢以及信号转移等代谢途径中.将所获得的128个基因进行GO分析,发现筛选到的与P22蛋白相互作用的寄主蛋白分为39个功...     

天津地区番茄褪绿病毒的分子检测和鉴定

为明确2014年夏天在天津番茄种植区采集到疑似感染番茄褪绿病毒的番茄样品的侵染病原,利用To CV外壳蛋白和热激蛋白的特异引物进行反转录PCR(RT-PCR)检测,分别扩增得到特异核苷酸片段。序列分析表明,HSP70核苷酸序列与已登录的番茄褪绿病毒日本分离物Tochigi(AB513442)相似性为99.5%,CP氨基酸和核苷酸序列与已登录的番茄褪绿病毒日本分离物Tochigi(AB513443)相似性分别为99.2%和99.3%,表明天津地区的番茄受到To CV侵染,且天津与日本To CV分离物序列相似性最高。由于调查地区番茄黄化曲叶病毒发生普遍,针对To CV阳性样品利用TYLCV特异性引物进行了分子检测,扩增产物序列与TYLCV以色列株系分离物的相似性均在99.0%以上,表明2种病毒在田间发生复合侵染,该研究首次明确天津地区的番茄受到To CV侵染和To CV与TYLCV的复合侵染。     

PVX介导的槟榔坏死环斑病毒CP蛋白在烟草中的表达和纯化

槟榔坏死环斑病毒(areca palm necrotic ringspot virus, ANRSV)是新发现的一种槟榔黄化病致病病毒。本研究利用马铃薯X病毒(potato virus X, PVX)表达载体pgR107,在烟草中表达ANRSV的外壳蛋白(coat protein, CP),旨在分离纯化该蛋白并开展对病毒蛋白的功能研究和利用该蛋白制备多克隆抗体。为方便纯化,将8肽Strep蛋白标签序列融合到ANRSV-CP编码基因的3'端,利用In-Fusion无缝克隆策略将其克隆到PVX载体,构建重组表达质粒PVX-ANRSV-CP-Strep。采用电转化法将质粒PVX-ANRSV-CP-Strep转入根瘤农杆菌GV3101中,通过农杆菌介导注射侵染接种本氏烟,14 d后对收集的16 g表达ANRSV-CP-Strep蛋白、PVX侵染的本生烟草样品进行了蛋白提取,采用SDS-PAGE和Western blot检测ANRSV-CP-Strep蛋白的表达情况。测序结果显示植物病毒表达载体PVX-ANRSV-CP-Strep构建成功。经Strep-Tactin~?XT High Capacity亲和层析柱纯化,SDS-PAGE和Western blot检测结果显示ANRSV-CP-Strep重组蛋白可通过PVX载体在烟草中有效表达,其表达量为22μg/g (鲜叶质量)。本研究为后续利用该蛋白制备多克隆抗体并建立ELISA方法进行病毒检测提供了理论依据。     

广西番茄花叶病毒和番茄褪绿病毒的分子鉴定

为明确引起广西番茄呈现褪绿斑驳和花叶症状的病毒病原,采集4个疑似病毒感染的番茄样品,利用小RNA深度测序、RT-PCR、序列分析、遗传进化树的构建等方法对样品进行鉴定及遗传进化分析。研究结果发现,小RNA数据中的41条contigs分别被注释为番茄花叶病毒(tomato mosaic virus,ToMV)和番茄褪绿病毒(tomato chlorosis virus,ToCV);RT-PCR证实了s RNA的结果,且所有样品均存在ToMV和To CV的复合侵染。通过拼接获得ToMV和ToCV RNA2的近全基因序列,ToMV近全基因序列为6383 bp,命名为ToMV-GX;ToCV RNA2的近全基因序列为8031 bp,命名为ToCV-GX。进化树分析发现,本研究获得的ToMV-GX与ToMV中国山西、内蒙古、呼和浩特3个分离物处于一个分支,说明其具有较近的亲缘关系;ToCV-GX与ToCV中国台湾、广东分离物处于一个大分支,说明具有较近的亲缘关系。上述结果证实,引起广西番茄呈现褪绿斑驳和花叶症状的病原是To MV和ToCV,本研究是ToMV和ToCV复合侵染广西番茄的首次报道。     

天津地区番茄褪绿病毒的分子检测与基因组部分序列分析

为了确定天津番茄产区是否发生了番茄褪绿病毒病,了解该病毒天津分离物的主要基因是否发生变异,对该地区发生的To CV进行了分子检测,并对该病毒的外壳蛋白(CP)和热激蛋白70类似物(Hsp70h)的核苷酸和氨基酸进行了序列分析。结果表明,天津分离物CP蛋白的核苷酸和氨基酸序列与已报道的具有代表性的不同国家的分离物相似性均在97.3%以上。Hsp70h蛋白的核酸和氨基酸序列与已报道的具有代表性的不同国家的分离物相似性均在97.2%以上。表明CP和Hsp70h蛋白是2个最保守的蛋白。这是首次在分子水平上证明番茄褪绿病毒在天津地区为害。     

建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒的检测技术及脱毒方法研究进展

为了弄清目前建兰花叶病毒(CymMV)和齿兰环斑病毒(ORSV)病毒检测和脱毒的研究概况,本研究详细阐述了2种病毒的检测方法、采用的脱毒技术和脱毒效率,分析比较了不同技术存在的弊端,指出现有的脱毒方法已不能满足兰科植物脱毒研究的需要。在此基础上,进一步提出应采用安全、可靠的新型脱毒技术来解决目前兰科植物产业瓶颈问题。超低温脱毒技术是近年来发展迅速的脱毒技术,具有独特优势,目前已在多种植物上成功应用,该方法的应用有望解决2种病毒脱毒方面存在的问题。     

OATP1B1蛋白结构与功能的生物信息学分析

有机阴离子转运多肽1B1 (OATP1B1)是有机阴离子转运多肽OATP超家族的膜转运蛋白,在药物的吸收、分布、代谢、排泄过程中发挥着重要的作用。本研究从美国国立生物技术信息中心(NCBI)数据库中检索OATP1B1膜蛋白的氨基酸序列,运用生物信息学在线分析软件对OATP1B1蛋白的理化性质、保守结构域、跨膜区、信号肽、磷酸化位点、糖基化位点及相互作用蛋白拓扑网络进行了预测分析。结果表明,OATP1B1为疏水性蛋白,分子中存在12个跨膜结构域,无信号肽序列,有多个磷酸化位点和糖基化位点,是高度磷酸化的糖蛋白。蛋白质二级结构软件在线预测显示,无规则卷曲占46.16%,α-螺旋占34.15%,延伸链占17.66%,β-转角占2.03%。对其相互作用蛋白的拓扑网络预测发现,OATP1B1主要参与胆汁酸,胆汁盐,甲状腺激素等的转运,与药物转运进肝细胞密切相关,另外还参与胆汁分泌。本研究可为研究OATP1B1的药物转运、代谢、排泄机制和联合用药提供理论基础。     

建兰花叶病毒(CymMV)和齿兰环斑病毒(ORSV)的脱除研究

本研究的主要目的是通过茎尖培养的技术手段来探索蝴蝶兰病毒的脱除问题,为建立工厂化无毒苗培养体系提供技术支撑。长期的工厂化生产,使蝴蝶兰经常感染各种病毒,导致叶片产生枯斑、褪绿、坏死等现象,使花朵畸形变色。其中建兰花叶病毒(CymMV)和齿兰环斑病毒(ORSV)是最常见的2种病毒。实验取已检测出含有CymMV和ORSV病毒的蝴蝶兰植株花梗,进行诱导丛生芽的培养,对丛生芽进行继代增殖形成组培苗用于脱毒处理。切取组培苗的茎尖顶端分生组织进行培养,茎尖长度在1~6 mm之间,随着茎尖长度的增加,成活率上升,脱毒率明显降低。取2~3 mm组培苗茎尖,经0、10、20、30、40 mg/L的三氮唑核苷浸泡15 min处理和在含有相应浓度的三氮唑核苷培养基中培养30天后,继代培养形成再生植株。实验采用ELISA法对脱毒前的蝴蝶兰植株以及脱毒后的再生植株进行2种病毒检测,通过显色反应判断是否含有病毒病原。实验结果表明,蝴蝶兰脱毒苗的成活率随着三氮唑核苷浓度的增加而降低,当其浓度达到40 mg/L时,茎尖顶端分生组织出现严重的透明和褐变现象,未获得再生植株。而试管再生苗的脱毒率则随着三氮唑核苷浓度的升高而增加。在添加30 mg/L的三氮唑核苷进行化学抑制病毒的处理后,可以比单纯使用茎尖培养的方式脱毒率提高22.3%。     

猪嵴病毒福建株结构蛋白VP 基因的克隆与生物信息学分析

为丰富猪嵴病毒结构的分子流行病学数据,明确福建株猪嵴病毒结构蛋白VP的特征,研究运用RT-PCR方法设计特异性引物,对猪嵴病毒结构蛋白进行分段扩增后进行克隆测序,并将测序结果进行拼接后进行生物信息学分析。结果表明,所扩增福建株猪嵴病毒含有完整的结构蛋白VP,其基因全长为2529 bp,编码有843个氨基酸,理论等电点为5.34,理论分子质量为89.603 kD,不稳定系数为37.71,最大疏水指数为2.522,最小疏水指数为-2.622。其和XX株猪嵴病毒结构蛋白核苷酸同源性最高,仅为86.7%,与swine/S-1-HUN/2007/Hungary株猪嵴病毒结构蛋白核苷酸同源性最低,为83.7%。从遗传进化上看,猪嵴病毒结构蛋白在遗传进化上呈现2个独立的分支,中国猪嵴病毒分离株在2个遗传分支上均有分布。     

赤桉EcNha1蛋白结构预测与生物信息学分析

为了深入预测赤桉Nha1的蛋白结构与生物学功能,本研究使用生物信息学的方法对其进行分析。结果显示:该基因所编码蛋白的氨基酸残基数为365个,该蛋白的分子式为C_(1756)H_(2730)N_(504)O_(648)S_8,分子量为41.5 kD,蛋白等电点pI为4.27,带正电残基(Arg+Lys)为41个,带负电残基(Asp+Glu)为105个,不稳定系数为76.45,脂肪系数为59.48,总平均亲水性系数为-1.270;Nha1蛋白含有一个保守域Leo1;二级结构显示该蛋白主要由56.44%的无规则卷曲、25.21%的α-螺旋、15.89%的延伸链和2.47%的β-转角组成;三级结构的预测结果显示含有α-螺旋和β-转角;该蛋白定位于细胞核中,不存在信号肽序列,为非分泌性亲水蛋白,没有跨膜蛋白,共有19个磷酸化位点;进化树分析表明EcNha1蛋白是赤桉蛋白LEO1的同源体。结果为后续深入了解植物Nha1基因作用机制和赤桉EcNha1基因生物学功能研究提供参考。     

牛ANGPTL2基因结构与功能的生物信息学分析

以牛的血管生成素样蛋白2(Angiopoietin-like protein2,ANGPTL2)基因为研究对象,运用生物信息学方法对其编码的蛋白质结构、理化性质及功能结构域进行分析。结果表明:牛ANGPTL2基因cDNA全长21 141 bp,最长开放阅读框为1 482 bp,编码493个氨基酸;序列比对结果显示,牛的ANGPTL2基因与人、家犬、鸭嘴兽、原鸡、斑马鱼、家马、小家鼠、野猪的核苷酸序列同源性分别为25.3%,24.7%,24.2%,24.3%,24.8%,24.9%,25.3%,25.5%;牛AN-GPTL2基因编码的氨基酸序列与上述其他动物的同源性分别为98.0%,96.8%,9.1%,6.3%,6.9%,51.9%,94.5%,98.2%;系统进化分析结果显示,在人、野猪、家犬、家马等动物中,牛的ANGPTL2基因与野猪的进化关系最为密切,亲缘关系最近;牛ANGPTL2蛋白中α螺旋较多,含有一个跨膜区。     

类猪圆环病毒因子P1 VP2蛋白二级结构与B细胞表位预测

旨为预测类猪圆环病毒因子P1 VP2蛋白的B细胞表位.采用生物信息软件和互联网服务器,预测VP2的二级结构,分析VP2表面特性(亲水性、可塑性、可及性和抗原性),综合预测VP2的B细胞抗原表位.结果表明,P1 VP2蛋白肽链的6-18和80-92区段为预测的B细胞表位优势区.多参数方案综合预测P1 VP2蛋白的B细胞抗原表位,为进一步鉴定表位及设计疫苗奠定了基础.     

长绿期金银木耐寒性与叶片组织结构的关系

为了研究长绿期金银木的叶片组织结构与耐寒性关系,在连续多年观测落叶时间,统计绿期天数的基础上,对长绿期金银木、金银木的叶片进行了解剖构造的观测与比较.结果发现:品种的耐寒性与叶片组织结构紧密度(CTR值)呈正相关,与海绵组织厚度的指数(SR值)呈负相关.单一组织的数量(如叶片总厚度、栅栏组织厚度或海绵组织厚度)往往会随样品所处生态条件和生理状态的不同而发生变化,而叶片组织结构的紧密度具有相对的稳定性.长绿金银木叶片角质层厚度与其耐寒性密切相关,反映了金银木品种耐寒性遗传上的差异.CTR、SR值及叶片角质层厚度都可作为耐寒性的鉴定指标.     

基于生物信息学与生物技术开发植物分子标记的研究进展

各种序列数据库的迅猛增长与生物信息软件的不断开发使基于序列资源的标记开发更加便捷,各类分子生物学技术的涌现及高通量检测平台的建设为实验室开发分子标记提供了强有力的技术支持.本文从生物信息学角度概述了SNP、SSR等分子标记开发的方法、特点及应用现状,并介绍了利用分子生物技术开发SSR、SRAP、TRAP标记的手段及从RAPD、AFLP等标记向单位点特异性PCR标记(如SCAR、CAPS、dCAPS等)转化的进展.最后,对不同植物标记开发策略的选择及以上各种技术在功能标记开发中的应用前景作了展望.     

小麦矮腥黑粉菌效应蛋白g10613的基因克隆与生物信息学分析

本研究重点分析小麦矮腥黑粉菌的g10613基因编码效应蛋白的生物学功能。根据小麦矮腥黑粉菌基因组测序结果,筛选出编码效应蛋白基因g10613作为主要研究对象。将效应蛋白基因g10613成功克隆,并运用多种生物信息学数据库,解析了该蛋白的理化性质、保守结构域、跨膜区、亲疏水性以及信号肽。结果表明：g10613基因全长330 bp,共编码109个氨基酸;它所编码的效应蛋白质没有明显的家族结构特征;该蛋白质中亲水的氨基酸数量更多,是偏亲水蛋白质;在跨膜区分析中,它存在一个跨膜区,处于0～23氨基酸的位置。     

芍药查尔酮异构酶基因(CHI)克隆、密码子偏好性分析以及蛋白结构功能预测

为了丰富芍药CHI基因研究的基础数据,首先利用RACE技术对芍药CHI基因的CDS区进行克隆,并通过EMBOSS软件分析序列的密码子偏好性,其次利用生物信息学软件和在线数据库对芍药CHI进行蛋白结构与功能预测。结果表明,克隆获得芍药CHI基因c DNA序列长度为898 bp(Gen Bank序列号:JN119872),芍药CHI基因偏好使用以A/U结尾的密码子,28种偏好密码子(RSCU1),其中偏好性较强的有UUG、UGU、CAU、AGA、AGG、CGG(RSCU≥2),在密码子的使用频率上,芍药CHI基因与酵母、大肠杆菌等模式生物基因组的差异均大于拟南芥基因组。芍药CHI为非跨膜亲水的稳定蛋白,无信号肽,属于非分泌蛋白;主要分布在细胞质(45.0%)和微体(42.5%)中;无糖基化位点,14个磷酸化位点,其中第20位氨基酸处存在一个典型的磷酸激酶PKC,含有1个异构酶Chalcone保守结构域;二级结构包括α螺旋(39%)、延伸链(20%)、β-转角结构(13%)和无规则卷曲(27%);三级结构呈β-三明治折叠形成的倒置花束。发现了一个异构酶催化活性区域和一个重要的特异性蛋白质激酶PKC位点,为今后深入研究CHI基因功能提供有利的基础资料,此外,拟南芥真核表达更适合作为芍药CHI基因的外源表达系统。     

不同转基因棉的抗虫性与Bt毒蛋白含量关系研究

转单价 Bt基因棉和转双价 ( Bt+ Cp TI)基因棉对棉铃虫抗性的时空动态及其 Bt毒蛋白含量变化表明 ,无论是单价 Bt基因还是双价 ( Bt+Cp TI)基因 ,对棉铃虫均有明显的抗性 ,呈现明显的时空动态变化。单价 Bt基因在花铃期以前抗性不如双价 ( Bt+ Cp TI)基因 ,在花铃期单价 Bt基因棉花营养器官的抗性稍好于双价 ( Bt+ Cp TI)基因 ,但生殖器官的抗性不如双价 ( Bt+ Cp TI)基因。转单价 Bt基因棉和转双价 ( Bt+ Cp TI)基因棉的 Bt毒蛋白含量时空动态变化趋势与各自的抗虫性相一致。但转双价 ( Bt+ Cp TI)基因棉的Bt毒蛋白表达量在棉株各生育期同一器官及同一生育期不同器官均比转单价 Bt基因棉略低 ,说明 Cp TI基因对棉铃虫也有一定的抗性