口蹄疫病毒3D蛋白在T4噬菌体衣壳表面的展示

本文通过PCR技术获得3D基因,使用拼接重叠延伸聚合酶链反应对3D基因内部的EcoRⅠ位点进行定点突变,将突变后的3D基因克隆至原核表达质粒pSOC和T4噬菌体的穿梭质粒pR中,通过PCR及质粒酶切鉴定,分别获得阳性重组子pSOC-3D和pR-3D。将含有3D基因的重组质粒pSOC-3D质粒转化大肠杆菌BL21进行表达,SDS-PAGE检测表达产物。将含有3D基因的重组质粒pR-3D转化T4噬菌体的宿主菌E2,通过同源重组获得重组噬菌体T4-3D,经SDS-PAGE及Western- blot检测,证明展示在T4噬菌体表面的3D融合蛋白能与FMDV感染血清发生特异性反应。     

含禽源启动子的禽流感病毒核蛋白表达载体的构建及其免疫原性的检测

为了研究禽流感病毒核蛋白（nucleoprotein,NP）在鸡体内所引起的免疫反应,将其NP基因从重组质粒pVAX-NP上酶切后亚克隆至含禽源启动子的真核表达载体pCAGGS中,经筛选鉴定后获得重组子pCAGGS-NP,将鉴定正确的阳性重组子体外转染真核细胞,利用间接免疫荧光法检测目的基因的瞬时表达;采用腿部肌肉注射途径将重组子免疫SPF鸡,利用ELISA检测免疫后血清抗NP蛋白抗体效价。结果表明,该重组子无论在体外还是体内均能正确表达禽流感NP蛋白,且所表达的蛋白均具有良好的免疫原性。     

禽流感病毒研究概述

禽流感病毒（avian influenza virus,AIV）可引起禽类的呼吸器官或全身性感染。高致病性禽流感病毒可以直接感染禽类,偶尔也能直接或间接感染人类。禽流感的流行会严重影响畜牧业发展和国际进出口贸易。低致病性禽流感病毒可以经基因突变或基因重配转变成高致病性禽流感病毒。高致病性禽流感病毒是在人群中引发流感的一个潜在危险因素,并会严重地威胁人类健康。因此对禽流感病毒的检测和监测以及对其药物的研发和疫苗的研制,已成为世界各国政府及卫生防疫部门日益关注和积极着手解决的重大问题之一。本文将扼要介绍禽流感病毒的研究现状。     

禽流感病毒的分子生物学特性及其检测技术的研究进展

禽流感（AI）是由A型流感病毒引起的一种禽类感染和/或疾病综合征,在许多国家给家禽养殖业带来巨大的经济损失,而且威胁到人类的健康和安全.从禽流感病毒（AIV）的分子生物学特性及检测技术的最新研究进展进行了概述,重点介绍了禽流感诊断技术的最新研究及进展.     

禽流感病毒、新城疫病毒、猪瘟病毒和口蹄疫病毒多联RT-PCR诊断技术的建立

选择禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒（NDV)、猪瘟病毒(CSFV)和口蹄疫病毒(FMDV)基因组序列高保守区，按照多联PCR引物的设计要求，利用DNAsis计算机软件设计并合成了4对特异性扩增引物，扩增片段大小分别为470、320、200和140bp。以AIV、NDV、CSFV和FMDV的培养物提取RNA并反转录，进行RT-PCR特异性扩增。结果表明，各单项RT-PCR扩增产物与设计的4对引物之间的序列大小一致。在分别建立了各病毒单项RT-PCR及AIV与NDV、CSFV与FMDV二联RT-PCR的基础上，进一步优化各种多联PCR扩增条件，成功建立了上述4种病毒的四联RT-PCR技术。经特异性和灵敏度实验证明，本方法具有高度的特异性和灵敏性，其灵敏度为10pg总RNA。在3h内即可完成样品的检测。     

表达鸡传染性法氏囊病病毒VP2重组鸡痘病毒的构建

含ＩＢＤＶ保护性抗原ＶＰ２的质粒,以ＳｐｈＩ消化,然后用Ｔ４噬菌体ＤＮＡ聚合酶将末端补平,产物纯化后再以ＳａｌＩ消化一次,经再次纯化后与ＳｍａＩ和ＳａｌＩ分步酶切的鸡痘病毒插入载体ｐＦＧ１１７５－１相连,使唤基因顺向插入到载体Ｐ７５启动子下游,得到含ＩＢＤ ＶＰ２基因的重组插入载体ｐＦＧ ＶＰ２。     

湖南湖北两省H_6亚型禽流感病毒表面基因的序列分析

2008年至2009年间,在湖南和湖北两省的活禽市场中分离到了14株H6亚型禽流感病毒,为了解这14株病毒之间的分子特征和差异,我们运用PCR和测序鉴定对这14株病毒的NA基因进行了分型,并对其表面基因HA和NA进行序列测定及序列分析。14株H6亚型病毒中,H6N2亚型12株,H6N6亚型2株。序列测定和进化分析结果显示：DK/HN/284的HA基因与其它13株的HA差异性较大,差异性达到19.4%～20.2%,其余13株毒同源性在94.2%～99.9%;N2亚型NA基因的同源性在91.1%～99.9%,差异性比较大;两株N6亚型NA基因同源性为89.5%,差异明显。这些数据表明：不同毒株呈现一定的地域性差异。与我国周边其它地区的H6亚型禽流感毒株序列进行比较发现,只有DK/HN/284的HA基因与香港早期的毒株可能有着共同的来源,其余都与香港和韩国等的毒株有着较大的差异性,并且各个毒株的HA基因上潜在的糖基化位点和受体结合位点也有所不同,这些数据表明,这些毒株表现出明显的异源性。     

肉鸡H9N2亚型禽流感病毒全基因测序及遗传进化分析

根据GenBank登陆的H9N2亚型禽流感病毒（AIV）的全基因序列,设计11对引物,运用RT-PCR方法扩增A／Chicken／Zhejiang／HJ／2007(H9N2)毒株8个基因片段,并克隆到pMD18-T载体中进行序列测定。基因序列比较及遗传进化分析结果表明,所克隆的8个基因片段均有HJ毒株完整的开放阅读框（ORF）,其血凝素（HA）基因蛋白裂解位点的氨基酸组成为-PSKSSR*G-,为不连续的碱性氨基酸,符合低致病性AIV HA基因裂解位点的序列特征;与QA/HK/G1/97的进化关系较近,处在同一分支。其神经氨酸酶（NA）基因在63、64、65位点上有3个氨基酸（T、E、I）缺失,在遗传进化上属于常见的CK/BJ/1/94（DK/HK/Y280/97）群系。核蛋白（NP）基因整合有同地分离的H5N1亚型流感病毒NP基因片段,进化关系较近。基质蛋白（M）基因与1999年香港感染儿童的两株流感病毒（HK/1073/99和HK/1074/99）进化关系属于同一分支。非结构蛋白（NS）基因与近年来分离的猪源H9N2亚型流感病毒进化关系相近,和1998年首次报道的猪源H9N2亚型流感病毒（SW/HK/9/98）处在同一进化分支。聚合酶蛋白（PA、PB2、PB1）中,PB1从33-47位存在15个连续碱基缺失,是首次报道该基因ORF内存在缺失,从遗传进化上和近年来分离的H5N1亚型流感病毒处在同一分支上;PA基因从遗传进化上和PB1基因类似;PB2基因与常见的流感病毒毒株的遗传进化关系较远,在相应的进化树另成分支。因此,A／Chicken／Zhejiang／HJ／2007(H9N2)是由不同流感病毒基因亚系间发生自然重排的产物。     

禽流感病毒B类等位基因NS1蛋白的原核表达、纯化及热稳定性分析

A型流感病毒的非结构蛋白基因(non-structural protein,NS)在进化上可以分为等位基因A和B,两者之间同源性低于70％;NS1是流感病毒对抗宿主免疫系统的主要毒力因子之一.本研究在序列比对分析的基础上,表达、纯化了本实验室保存的4株B类等位基因禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV) (A/duck/Hunan/S1256/12(H3N8),A/environment/Hunan/S4484/11(H12N7),A/duck/Guangdong/07/00(H5N1)和A/duck/Shanghai/08/01 (H5N1))的NS1蛋白,并对其进行稳定性分析.首先从感染的鸡胚尿囊液中提取病毒总RNA,利用特异引物Uni12反转录获得cDNA,以其为模板PCR扩增得到NS1全长片段,利用BamH Ⅰ和NotⅠ双酶切将其定向插入pGEX6P-1载体,大肠杆菌(Escherichia coli)BL21菌株中诱导表达.该蛋白在纯化过程中稳定性差,沉淀析出.为此,进一步构建NS1蛋白截短突变体(1M-202A,R38A/K41A),并在BL21菌株中诱导表达,经过GE health Glutathione sepharose 4B亲和层析、Source Q阳离子交换柱层析和Hitrap Superdex75分子筛凝胶层析逐步纯化,然后进行SDS-PAGE凝胶纯度分析,并测定OD320,进行蛋白热稳定性分析.结果表明,经进化分析,4株病毒均属于禽流感病毒B类等位基因群,4株病毒NS1蛋白经过全长野生型、全长突变体及截短突变体的逐步优化表达,截短突变体NS1蛋白表达质量相对较高,最终经过逐步纯化获得纯度达到90％以上的蛋白样品,且4株病毒中A/duck/Hunan/S 1256/12(H3N8)NS1蛋白的稳定性最好.研究结果为进一步研究其分子结构与功能提供了基础资料.     

H5亚型禽流感病毒HA基因的克隆、表达及其生物学活性的初步分析

参考GenBank上发表的H5亚型禽流感病毒（Avianinfluenza virus,AIV）血凝素（HA）基因序列设计引物,经RT-PCR扩增HA基因的HA1片段,再将其克隆到原核表达载体PET-28a中,用大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）原核表达,SDS-PAGE和Western blot对表达蛋白进行鉴定.Western blot结果表明,表达蛋白能与H5亚型AIV单特异性血清特异性反应.交叉反应试验表明,此蛋白具有良好的抗原性,可被H5亚型AIV抗体特异性识别且无交叉反应.用变性纯化后的蛋白建立了对AIV抗体检测的间接ELISA,并对236份鸡血清样本进行了实验室检测.检测结果与血凝抑制试验检测结果符合率达到100%.综合研究表明,表达蛋白具有良好抗原性.     

两株H3N8亚型禽流感病毒(AIV)的生物学特性

H3N8亚型流感病毒宿主范围广泛,除了可以感染野鸟和家禽外,还可以感染多种哺乳动物,并且H3N8亚型流感病毒跨物种传播的现象也时有发生,对养殖业和人类生命健康都具有重要威胁.为了解H3N8亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)的生物学特性,本研究对2013年贵州省分离的两株H3N8亚型AIV(A/duck/Guizhou/S 1092/2013(H3N8)(简称DK/GZ/S1092/2013)和A/duck/Guizhou/S1145/2013(H3N8)(简称DK/GZ/S1145/2013))进行了遗传演化分析、小鼠(Mus musculus)感染性实验和受体结合特异性实验.遗传演化分析结果表明,这两株病毒具有明显的遗传多样性,除了血凝素(hemagglutinin,HA)基因位于同一个进化分支外,其他7个基因片段均具有不同起源.感染性实验结果表明,这两株病毒不需要提前适应就可以在小鼠的肺脏和鼻甲内有效复制,对小鼠呈现低致病性,小鼠感染病毒后未出现明显临床症状,目.DK/GZ/S1092/2013仅引起小鼠的体重下降1.8％,DK/GZ/S 1145/2013仅引起小鼠的体重下降0.8％.受体结合特异性分析结果表明,这两株病毒同时具有结合禽源唾液酸(sialic acid,SA) α2,3-Gal受体和人源SA α2,6-Gal受体的能力,具有感染人类的潜在风险.本研究通过对两株H3N8亚型AIV的生物学特性进行系统分析,发现H3N8亚型AIV具有感染哺乳动物的潜在风险.研究结果对于H3N8亚型AIV的综合防控具有重要的指导意义.     

表达伪狂犬病毒gC糖蛋白基因重组腺病毒的构建及其免疫效果

通过双酶切将伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)Fa株gC囊膜糖蛋白基因片段亚克隆到5型腺病毒AdMax系统穿梭质粒pDC316中,得到pDC316-gC。用此质粒与腺病毒DNA辅助质粒pBHGloxΔ E1,3Cre共转染293细胞,包装出重组腺病毒Adv-gC。通过PCR鉴定和病毒空斑纯化,得到纯的高效价Adv-gC病毒液。间接免疫荧光实验证明此重组病毒能表达PRV gC蛋白。该病毒经肌注免疫Balb/c小鼠,能诱导小鼠产生特异的体液和细胞免疫反应。攻毒试验表明,此重组病毒能提供100%的免疫保护。     

H5N1型禽流感病毒血凝素HA1蛋白在苏云金芽胞杆菌细胞表面的展示及其免疫原性

利用苏云金芽胞杆菌S-层蛋白CTC表面展示系统研究在细胞表面展示H5N1型禽流感病毒HA1蛋白的可行性及其免疫原性，为研制既安全有效又能常温长期保藏和运输的禽流感口服基因工程疫苗奠定基础。用部分ha1基因（ha1p）代替S-层蛋白ctc基因中部且位于表面锚定序列slh下游的片段，构建了融合基因ctc-ha1p和 csa-ctc-ha1p；利用电脉冲转化法将含融合基因的重组质粒转入苏云金芽胞杆菌无质粒突变株BMB171中，获得了重组菌株BCCH（含ctc-ha1p，并导入一个载有协助细胞表面展示的csaAB操纵子的质粒）和CH（含csa-ctc-ha1p）。通过血凝和血凝抑制试验以及小鼠免疫学实验证实，2个重组菌株均成功地在细胞表面展示了重组HA1蛋白并具有一定的特异性和免疫原性，其中，CH的效果强于BCCH，说明csa-ctc-ha1p这种融合基因的构建方式更胜一筹。研究结果表明，苏云金芽胞杆菌S-层蛋白CTC表面展示系统可用来研制禽流感口服疫苗。     

禽流感病毒H5亚型金标快速诊断技术方法的建立及试剂盒研制

应用纯化禽流感病毒(AIV)H5抗原免疫Balb/c小鼠,得到2株配对良好的抗AIV H5单抗;采用金标免疫层析法制备AIV H5亚型金标快速诊断试剂盒,并对试剂盒性能进行评价.实验结果表明,AIV-H5金标试剂盒与AIV H5以外其它亚型及其它禽类病毒不发生交叉反应,其灵敏度达1/27,稳定性良好:试剂盒检测人工感染AIV H5的鸡脏器组织,结果除心脏、泄殖腔拭子和喉拭子外,其余脏器均呈阳性,与鸡胚病毒分离培养结果相符;田间试验结果与荧光RT-PCR试剂盒检测符合率达100%.     

T4-type bacteriophage communities estimated from the major capsid genes (g23) in manganese nodules in Japanese paddy fields

The present study compared the capsid gene ( g23 ) of T4-type bacteriophages (phages) in Mn nodules with those in the plow layer soil and subsoils of two Japanese paddy fields by applying the primers MZIA1bis and MZIA6 to DNA extracts from the nodules and soils. The deduced amino acid sequences of the g23 genes in the Mn nodules were similar to those in the plow layer soil and in the subsoils. This result indicated that similar T4-type phage communities developed at these sites and that the diversity of T4-type phage communities was wide enough to cover those in the plow layer soil and in the subsoils. The majority of g23 clones formed several clusters with the clones and phages obtained from far-apart paddy fields, and the sequences of two clones were completely identical to a phage and a clone from other paddy fields at the nucleotide or amino acid level, indicating horizontal transfer of g23 genes between those paddy fields. A clone with a long nucleotide residue (686 bp) and a distribution remote from the other clones in the phylogenetic tree indicated that there were many uncharacterized, novel g23 genes in the paddy fields.     

Change in T4-type bacteriophage communities during the composting process of rice straw: Estimation from the major capsid gene (g23) sequences

Abstract

The present study examined T4-type phage communities in rice straw (RS) under the composting process by analyzing the composition of the major capsid gene (g23) of T4-type bacteriophages. The g23 clones were obtained from RS throughout the composting process from RS materials to composting RS in the curing stage (for 124?days). Most of the g23 clones were phylogenetically closely related to those in rice field soils and rice field floodwaters, and Paddy Groups II and III appeared to characterize the g23 genes in the composting RS. The diversity of g23 genes in the composting RS was highest in the RS material (day 0 after the onset of composting) and in the early thermophilic stage (day 7), and decreased markedly in the middle and curing stages. This change was in contrast to that of the bacterial community, which showed higher diversity in the middle and curing stages. There was no specific clone that characterized any stage during the composting process. These findings indicate that the phage community is not the major controlling agent in determining eubacterial succession and that the thermophilic stage in the composting process efficiently annihilated T4-type phages in the composting pile.