玉米光敏色素A1与A2在各种光处理下的转录表达特性

光敏色素是一类红光/远红光受体, 它们在植物体内有非活性形式的红光吸收型(Pr)和活性形式远红光吸收型(Pfr) 2种状态, 通常其活性形式负责调控植物的种子萌发、株高、开花时间和避荫性等生长发育过程。在禾本科中, 光敏色素只有PHYA、PHYB和PHYC三个基因亚家族, 古四倍体化造成的玉米光敏色素基因有6个成员, 即PHYA1、PHYA2、PHYB1、PHYB2、PHYC1和PHYC2。光敏色素A参与抑制下胚轴的伸长、促进张开子叶和花青素的积累、阻断持续远红光条件下的变绿。为了评价ZmPHYA1和ZmPHYA2对光的响应能力及其功能差异, 本研究采用实时定量PCR技术分析玉米自交系B73和Mo17中ZmPHYA1和ZmPHYA2对不同光照处理响应的表达模式。结果表明玉米光敏色素A主要在叶片和花丝中表达, 并且ZmPHYA1转录丰度是ZmPHYA2的2~8倍; 玉米自交系B73和Mo17中胚轴在黑暗、远红光和蓝光条件下较红光和白光下更长。ZmPHYA1和ZmPHYA2的转录水平在持续远红光和蓝光条件下均较高; 并且均较迅速响应黑暗到远红光和蓝光光质转换, 但是前者的丰度显著高于后者, ZmPHYA1在远红光下更重要, 而ZmPHYA2在蓝光下更重要。ZmPHYA1和ZmPHYA2同样响应于黑暗到红光和白光的转换, 并且ZmPHYA1和ZmPHYA2表达模式基本一致。ZmPHYA1和ZmPHYA2的表达均能响应长日照和短日照处理, 但是ZmPHYA1转录丰度高于ZmPHYA2的2~5倍。以上结果表明, ZmPHYA1和ZmPHYA2的转录能有效地响应各种光处理, 可能ZmPHYA1在作物改良上比ZmPHYA2更有效。本研究为进一步了解ZmPHYA1和ZmPHYA2基因功能以及评价二者的光反应能力提供了理论基础。     

小麦光敏色素基因TaPhyB3的克隆和表达分析

从小麦品种中国春中克隆了编码光敏色素基因B的脱辅基蛋白,将其定位于4D染色体的长臂上,并命名为TaPhyB3。TaPhyB3的开放阅读框为3501bp,编码一个128kD、具有1165个氨基酸的蛋白质。它与水稻、玉米和拟南芥在氨基酸水平上的一致性分别为93%、90%和73%。对不同光线处理7d小麦植株表达的分析表明,TaPhyB3在黑暗中表达最低、在白光下的表达水平最高,在远红光、红光、蓝光和白光下的表达水平分别是黑暗中的2.2、7.7、7.4和37.3倍。组织特异性表达分析表明,TaPhyB3在小麦幼苗所有组织中都表达,叶片中的表达水平是根的11.4倍。推测TaPhyB3的表达水平与小麦的光形态建成的程度呈正相关。     

杨树PePIF3基因的克隆与表达分析

生物节律基因直接影响植物的生长发育,光敏色素相互作用因子3(phytochrome-interacting factor3,PIF3)属碱性螺旋-环-螺旋转录因子家族,是生物节律中的一个关键因子,在分子水平上对植物所受到的环境变化起协同调控作用。本研究以‘南林895’杨(Populus deltoides×P.euramericana’Nanlin 895’)为材料,通过克隆获得杨树Pe PIF3基因,分别为Pe PIF3-1和Pe PIF3-2序列,长度为1686 bp和2142 bp,编码561个氨基酸和713个氨基酸,且均为亲水性蛋白。对Pe PIF3进行多序列比对分析,发现其与毛果杨和胡杨同源性最高。组织特异性分析显示PePIF3在杨树幼叶中表达量最高,在柄、茎和根组织中表达都较低。对自然条件下的杨树成熟叶中PePIF3的生物节律性变化规律分析发现其在黑暗中不断累积,上午表达量达最高,以后呈下降趋势。在全黑暗条件下,14 h前PePIF3-1和Pe PIF3-2二者的表达量变化趋势相似,但14 h后二者的表达量呈相反变化趋势。     

陆地棉(Gossypium hirsutum)光敏色素B基因(GhPHYB)克隆及其生物信息学分析

本研究依据已公布的雷蒙德氏棉基因组测序结果,采用同源克隆的方法,以陆地棉TM-1幼苗为材料,利用RT-PCR技术克隆得到陆地棉光敏色素B基因(Gh PHYB)的c DNA序列。结果显示:该基因ORF全长3 582 bp,编码1 194个氨基酸;通过与已知的拟南芥光敏色素B氨基酸序列比对及蛋白结构预测,发现该基因包含植物光敏色素完整的结构,与烟草、拟南芥、水稻、小麦和玉米的氨基酸序列相似性分别为87.2%、77.9%、74.5%、74.5%和54.6%。同时,本研究还构建了Gh PHYB基因的RNAi干涉载体用于转化棉花,并通过构建棉花PHYB RNAi突变体了解陆地棉PHYB基因对棉花株型、开花期、产量、棉纤维品质、抗逆性等方面的调控作用。研究结果可为该基因今后应用于棉花生产奠定基础。     

2个玉米ZmCRY1a基因的克隆及其响应光质处理的表达模式

隐花色素(Cryptochrome, CRY)是植物蓝光的主要受体,参与其调节生长发育及生物钟过程。为研究隐花色素在玉米光形态建成及生物钟调控方面的作用,本研究利用同源克隆的方法得到玉米自交系B73的2个ZmCRY1a基因的cDNA序列,分别命名为ZmCRY1a1和ZmCRY1a2。这2个基因的编码区(coding DNA sequence, CDS)序列长度都为2124个核苷酸,编码707个氨基酸。生物信息学分析表明ZmCRY1a1和ZmCRY1a2推测的氨基酸序列均包含DNA photolyase、FAD binding和Crytochrome C结构域;与拟南芥及其他常见作物的CRY比对并构建系统发育树显示,这2个基因与水稻OsCRY1a氨基酸序列一致性最高,而与拟南芥和大豆等双子叶植物的CRY1氨基酸序列一致性相对较低。利用实时荧光定量PCR分析了ZmCRY1a1和ZmCRY1a2在不同器官及响应光质、光质转换及长日照与短日照处理的表达模式。在检测的器官中,ZmCRY1a1的表达丰度均高于ZmCRY1a2;这2个基因在成株期叶片中表达丰度最高,分别是根中ZmCRY1a1的52.1和6.2倍。相对于黑暗下,二者在各种持续光质中的表达丰度均较高,尤其在蓝光和远红光条件下。尽管是作为编码蓝光受体的基因,2个ZmCRY1a的表达却能强烈地响应远红光和红光转换处理。同样二者也能响应不同光周期处理,长日照条件下,ZmCRY1a1的转录在一个光周期内共出现5个峰值,而ZmCRY1a2的转录只有4个峰值;短日照条件下,2个ZmCRY1a的表达出现了极其相似的模式,均在进入黑暗后10 h和14 h时出现2个最高峰。由此推测2个ZmCRY1a可能在玉米光形态建成与开花调节中发挥重要作用。     

大豆谷氨酰胺合成酶基因的分类及根瘤特异表达GmGS1β2基因功能的初步分析

从Phytozome数据库中获得包括大豆在内的12种植物的谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase, GS)氨基酸序列,利用MEGA5.10软件进行多序列比对、构建进化树。进化分析表明,植物GS可以分成胞质型(GS1)和质体型(GS2)两大类,GS1可进一步分成分5个亚类,包括双子叶植物为主的I、II和III亚类、低等植物类(IV)和单子叶植物类(V)。这5亚类中,第II类是豆科植物特有的一类,大豆的4个GS1 (GmGS1β1/2和GmGS1γ1/2)属于该亚类;利用qPCR在大豆盛花期分析GS1基因的组织表达特异性,结果表明不同类型GmGS1基因在表达部位和表达丰度上存在较大差异,而同一类基因之间具有相似的表达规律;4个豆科植物特有的GS1基因在大豆根瘤中都有较高的表达量,其中位于大豆第18染色体上的GmGS1β2基因表达丰度最高;利用原核表达系统体外表达GmGS1β2蛋白,诱导出分子量大小与理论预测值一致的目标蛋白,酶活性分析表明GmGS1β2可以与底物发生催化反应,具有谷氨酰胺合成酶活性,推测该基因在大豆根瘤氮素同化代谢中具有重要作用。     

条锈菌诱导的小麦MBF1转录辅激活因子基因的克隆及其特征分析

应用电子克隆和RT-PCR方法,从小麦叶片中分离出一个条锈菌诱导的编码MBF1基因的cDNA序列,暂被命名为TaMBF1a。TaMBF1a包含一个完整的429 bp的开放阅读框,编码142个氨基酸,具有MBF1保守结构域;小麦TaMBF1a氨基酸序列与水稻OsMBF1相似性达92%,与拟南芥AtMBF1a相似性达80%。TaMBF1a编码的蛋白可能是核蛋白,且该基因在小麦根、茎、叶组织中表达量基本一致。在小麦与条锈菌的亲和、非亲和互作中,TaMBF1a基因均受条锈菌诱导高水平表达,且非亲和组合表达量高于亲和组合。外源植物激素水杨酸、乙烯、脱落酸也可诱导该基因快速上调表达,表明TaMBF1a可能通过水杨酸、乙烯等信号途径参与小麦对条锈菌的防御反应。     

小麦光敏色素互作因子TaPIF4基因的克隆与表达分析

为研究小麦光敏色素互作因子TaPIF4基因的结构、特性以及在小麦中的具体功能,从小麦中克隆TaPIF4基因并进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析该基因在48 h内的节律表达及在低温、干旱、高盐和脱落酸(ABA)处理条件下的表达模式,推测其可能参与的生物学过程。结果表明,TaPIF4基因的开放阅读框为1 053 bp,编码350个氨基酸,所编码的蛋白在C端含有1个b HLH结构域。TaPIF4蛋白的b HLH结构域保守程度高,在进化关系上与粗山羊草的PIF4-like蛋白最近。TaPIF4基因的表达具有昼夜节律性,在光照条件下表达量低,在黑暗条件下表达量高。TaPIF4基因在外源ABA处理下表达被明显抑制;在干旱处理下,短时间内其表达量升高,之后下降;冷处理下,表达模式与干旱处理相反;盐处理下,其表达无明显规律。推测TaPIF4基因可能参与植物ABA、干旱、低温胁迫的信号通路。     

小麦TaSnRK2.9蛋白激酶基因克隆与生物信息学分析

为了揭示小麦TaSnRK2.9基因的结构特点和功能特性,为该基因的研究和应用提供基础,根据已报道的水稻蛋白激酶SAPK9基因（GenBank登录号AB125310.1）序列信息,利用RT-PCR技术克隆了小麦TaSnRK2.9基因,并对其进行生物信息学分析。结果表明：小麦TaSnRK2.9阅读框为1092 bp,编码363个氨基酸,与水稻SAPK9亲缘关系最近,属于第三亚家族;亚细胞定位预测TaSnRK2.9定位在细胞质中;基因表达谱分析发现TaSnRK2.9在根、茎、叶、花等器官和组织中都有表达,并且在叶中的表达量最高。TaSnRK2.9的克隆为研究其在小麦中的功能提供基本信息和指导。     

番茄SlWRKY6基因克隆及其在重金属胁迫下的表达分析

为了揭示SlWRKY6基因与植物重金属胁迫的相关性,通过RT-PCR的方法从番茄中克隆得到SlWRKY6基因,该基因序列号为:NM_001365762.1。生物信息学分析结果表明,该基因含有一个长度为1 342 bp的完整开放阅读框,编码447个氨基酸残基。该基因编码的蛋白含有一个WRKY结构域,属于典型的GroupⅡ亚家族成员。系统进化分析表明,与番茄SpWRKY31氨基酸序列之间的亲缘关系最近。组织特异性分析表明,SlWRKY6基因在番茄的不同组织中均有表达,在老叶中表达量最高。实时荧光定量PCR分析结果表明,SlWRKY6基因在3种重金属(CdCl_2、CuCl_2、HgSO_4)胁迫下均上调表达,且在Cd和Cu胁迫下番茄根部的表达量较高。CdCl_2胁迫下,SlWRKY6基因在番茄根中受胁迫诱导显著高于叶中;CuCl_2胁迫下,番茄叶中SlWRKY6基因表达量在3 h时达到最大值后降低,而根中的SlWRKY6基因水平随着浓度增加而下降;HgSO_4胁迫下,根部和叶片该基因的表达量显著高于对照(0 h),并随着HgSO_4胁迫时间延长,SlWRKY6基因相对表达量在番茄根和叶中呈现相反的趋势。综上,本研究获得了SlWRKY6基因的编码区序列,并初步阐述了番茄SlWRKY6基因在3种重金属胁迫下的表达情况,为筛选番茄中响应重金属胁迫功能基因的研究提供了研究基础。     

γ-氨基丁酸促进拟南芥开花的机理研究

为了探讨γ-氨基丁酸(GABA)对拟南芥植物开花的影响机制,以3种不同浓度（1 mmol/L,5 mmol/L和10 mmol/L）的GABA采用隔天喷施的方法,处理7天龄的拟南芥幼苗至4周龄,以双蒸水作为对照,观察拟南芥的开花时间的变化。结果表明,在长日照（16 h光照/8 h黑暗）和短日照（8 h光照/16 h黑暗）条件下,GABA能不同程度地促进拟南芥早开花2~5天。运用荧光定量PCR技术,对开花途径的开花抑制因子基因Flowering Locusc C（FLC）、自主开花途径基因FCA(FLOWERING TIME CONTROL PROTEIN FCA)和花序分生组织特征基因LEAFY（LFY）的表达进行研究。与对照相比,GABA处理下调FLC的表达2~5倍,而促进FCA（1.5~6倍）和花序分生基因LFY（3~11倍）的表达。初步的实验结果表明,GABA对拟南芥开花的促进作用有可能通过上调FCA的表达,抑制FLC从而促进LFY的表达而最终促进植物提早开花。     

沙冬青C2H2型锌指蛋白基因AmZFP1的克隆与表达分析

为了研究强抗逆植物沙冬青寒旱诱导表达基因AmZFP1(Zinc finger protein 1)的生理功能,通过转录谱分析,从中鉴定出一个受寒旱诱导的ZFP全长cDNA序列并命名为AmZFP1。利用半定量RT-PCR方法对AmZFP1进行了表达分析,结果表明,在室内正常培养的沙冬青幼苗中该基因有较高表达量,在低温或干燥处理2~48 h其表达量明显上调,尤其以干燥处理上调速度更快且上调幅度略高;在野外自然生长植株的嫩叶、花蕾和幼嫩果荚中AmZFP1均有较明显的表达,而在嫩枝和根中检测不到其转录本;在野外植株的嫩叶中,AmZFP1在严冬季节高表达,而在春、夏、秋温热季节表达水平低或很微弱。利用RT-PCR方法克隆到AmZFP1编码区cDNA(816 bp),推测其编码蛋白含有2个典型C2H2型锌指结构域及一个核定位信号。此外成功将该cDNA片段构建到植物表达载体p3300-353T上,为下一步深入开展该基因功能研究奠定了基础。     

LED effect on free radical-scavenging activity of barley leaf

Barley leaf grown under light-emitting diode (LED) light was prepared and investigated for its free radical scavenging activity. LED light such as red, far-red, blue, blue-red, green, yellow, UVA, and white and also fluorescent light and dark conditions were also used in this study. Length and weight of barley leaves were measured and the Hunter color value, DPPH radical scavenging activity, and ABT radical-scavenging activity of barley leaf extracts were estimated. Extraction of barley leaf was performed by using a 70% ethanol solution. Length of barley leaf grown with red and green LED was 9.9 and 12.6 cm, respectively. Hunter L* and a* values of extracts of barley leaf grown under dark conditions were higher than those of other LED light-treated samples. The DPPH radical scavenging activity of extracts of barley leaf grown with blue, UVA, and under dark conditions were 41.40, 36.23, and 43.57%, respectively. ABT radical scavenging-activity of extracts of barley leaf grown under LED of red, far-red, blue, blue-red, green, yellow, and white were 5.46, 6.10, 6.00, 5.93, 5.74, 6.32, and 5.94 μmol TE g⁻¹, respectively.     

高粱光敏色素A基因的克隆、蛋白结构与长短日照诱导表达模式

光敏色素是一类红光/远红光受体,对植物光形态建成、外部形态和生理功能等方面起着重要的调节作用。为明晰光敏色素A在调控高粱光形态建成发育过程中的作用,本研究比较分析光温敏感程度不同的高粱品种Btx623、Rio、Tx430和LH645的PhyA基因序列和PHYA蛋白的保守结构域,利用qRT-PCR明确长短日照条件处理下PhyA基因的表达模式。结果表明,Btx623、Rio和Tx430之间PhyA基因序列存在非同义突变,LH645在PhyA基因的第7个外显子上插入了5 bp碱基序列;高粱PhyA蛋白中含有1个PAS-2结构域、1个GAF结构域、1个Phytochrome结构域、2个PAS结构域、1个组氨酸激酶A结构域和1个类似组氨酸激酶的ATP激酶结构;遗传进化树分析表明,单子叶和双子叶植物PhyA蛋白明显聚为2大类,高粱PhyA、谷子PhyA和玉米PhyA1、PhyA2聚为一个亚类,相互间亲缘关系较近,与水稻PhyA同源性相对较远;在短日照(SD)条件下各时期PhyA基因转录水平变化显著,Rio PhyA基因转录水平较Btx623和Tx430变化明显,LH645 PhyA基因转录变化不显著,在长日照(LD)条件下Rio PhyA基因转录水平低于Btx623和Tx430,LH645 PhyA基因转录水平变化不显著。以上结果表明,PhyA受光周期诱导,推测其在高粱光形态建成中起重要调控作用。本研究为进一步解析PhyA基因功能及其在调控高粱光形态建成发育过程中的作用提供理论基础。     

中棉(Gossypium arboreum)光锈导基因Gacab启动子在转基因烟草中的功能缺失分析

分离了金华中棉(Gossypiun arboreum var. jinhua)光诱导基因cab 5'上游的调控序列1 009 bp,并对其功能进行了分析,证明获得的这一DNA片段具有驱动光诱导表达的功能。为了进一步分离具有最大转录活性的最小光诱导启动子,根据光诱导表达调控元件所在的位置,构建了Gacab P和197 bp、504 bp、779 bp的5'端缺失体,并将这些缺失体分别与gus (uid A)基因融合,构建植物表达载体。用农杆菌介导法转化烟草,获得转基因烟草。GUS组织化学分析表明,转基因烟草的T1代种子在光下培养时,只有Gacab P驱动gus基因在转基因烟草的叶片表达,其他3个启动子驱动gus基因在转基因烟草的整个植株中均有表达;当转基因烟草的T1代种子在暗中萌发及培养时,Gacab P驱动gus基因在转基因烟草中无表达,其他3个启动子驱动gus基因在转基因烟草的整个植株中均有表达。GUS定量分析表明,–504 ~ –1 bp的启动子缺失体启动活性最高,比CaMV35S启动子高0.6倍。上述结果表明只有全长的Gacab启动子具有光诱导和绿色组织特异表达特性,且–504 ~ –1 bp的启动子缺失体启动活性最高。     

花生AhSOS2基因的克隆及功能初探

SOS2 (Salt Overly Sensitive 2)作为植物中一类重要的耐盐相关基因, 在调控细胞内离子平衡及参与植物对盐害的响应及适应过程中具有重要作用。本研究通过RACE的方法, 从花生叶片中分离到一长1462 bp、包含1341 bp开放阅读框(ORF)的cDNA片段, 生物信息学分析显示, 该基因属SOS2类基因, 被命名为AhSOS2(GenBank登录号为HG797656), 编码446个氨基酸, 为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。对基因表达特性的荧光定量PCR分析显示, AhSOS2在花生中为组成型表达; 且受盐胁迫及干旱诱导。经250 mmol L^-1 NaCl处理后, 该基因在花生幼苗茎中被诱导表达, 表达量约是对照茎中的30倍; 而在30% PEG-6000模拟干旱处理下, 该基因在花生幼苗叶中表达量也明显升高。综合以上结果, 显示AhSOS2可能参与并调控花生对逆境的抗性及耐受性。目前, 已成功构建了AhSOS2的植物双元表达载体pCAMBIA1301P-AhSOS2并获得转基因植株, 初步功能分析显示, 过表达AhSOS2基因的转基因水稻对盐胁迫的耐受性提高。预期这方面的工作对于解析花生对盐害、干旱等逆境的适应及防御机制, 进而指导花生抗性育种及品质改良具有重要意义。     

粗胫翠尺蛾视蛋白基因的克隆及灯光对其表达量的影响

灯光防控技术在国内荔枝和龙眼主要产区被推广应用,为了探究该项技术对于荔枝龙眼梢期头号害虫——尺蛾的视觉刺激响应的影响,笔者以粗胫翠尺蛾为研究材料,利用转录组测序结果和RACE技术获得2个视蛋白基因,并通过RT-qPCR技术分析2个视蛋白基因的发育模式以及在光照处理后的表达变化。结果表明,扩增得到TiLW和TiUV视蛋白基因分别编码374个和378个氨基酸,其序列二级结构主要由α-螺旋和随机卷曲组成,均包含不同数量的视蛋白家族所特有的多个保守氨基酸位点。在粗胫翠尺蛾整个发育周期的不同发育阶段中,均可检测到2个视蛋白基因,但两者在不同发育阶段的表达水平有差异。在光照处理后,成虫头部TiLW和TiUV的表达量均受到不同程度的影响。与对照组相比,光照处理后24 h,TiLW在雌、雄虫头部分别上升12.96倍和降低8.61倍,而TiUV在雌雄虫头部分别上升1.75倍和降低3.10倍。TiLW和TiUV参与粗胫翠尺蛾在光照刺激下的应激过程,光刺激可引起粗胫翠尺蛾2个视蛋白基因表达变化。