兔病毒性出血症病毒重组蛋白VP60间接ELISA抗体检测方法的建立与应用

为建立一种快速的兔病毒性出血症病毒抗体检测方法,本研究以原核表达的重组VP60蛋白作为诊断抗原,建立了检测兔病毒性出血症病毒抗体的VP60-ELISA诊断方法。该方法检测3种常见兔病(兔轮状病毒、仙台病毒和魏氏梭菌)的阳性血清均为阴性;检测灵敏度为1:12800;批内、批间重复性试验的变异系数分别小于4.9%和6.9%。本研究建立的RHDV VP60-ELISA检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,为RHDV的抗体检测及流行病学调查等快速诊断提供了一种技术手段。     

兔病毒性出血症病毒间接ELISA抗体检测试剂盒的研制及其临床应用

为了建立一种快速的兔病毒性出血症病毒抗体检测方法,本研究参照已发表的RHDV基因序列,RT-PCR扩增了长约510bp的VP60基因片段,连接PGEX-4T-1表达载体后获得了以包涵体形式表达的重组VP60蛋白。重组蛋白纯化后,经免疫印迹检测证明具有良好的抗原性和特异性。以该蛋白作为诊断抗原,建立了检测兔病毒性出血症病毒抗体的VP60-ELISA诊断方法。该诊断方法具有良好的敏感性、特异性和重复性,为RHDV的快速诊断、免疫兔群抗体监测和实验兔等级检测提供了一种快速、简便的血清学诊断方法。     

兔病毒性出血症病毒 VP60蛋白基因研究进展

兔病毒性出血症病毒（RHDV）是引起兔病毒性出血症（RHD）的病原,严重威胁着世界养兔业的健康发展。在RHDV的感染和免疫研究方面,RHDV 的衣壳蛋白VP60作为具有重要免疫原性的主要结构蛋白备受关注,论文对V P60蛋白基因的结构特征、核苷酸变异情况及在诊断方法建立和疫苗预防研究等方面进行了综述,为RHDV防控相关研究提供有用的参考资料。     

基于兔出血症病毒衣壳蛋白优势抗原区的间接ELISA方法建立

为建立一种检测兔出血症病毒（Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV）抗体的间接ELISA方法,首先扩增了VP60的优势抗原区A（31～250 aa）和B（470～579 aa）两个片段,然后应用融合PCR方法将A、B片段连接起来,克隆至pET-30a（＋）,转染BL21感受态细胞,进行原核表达。用Western blot方法对表达产物（AB）的免疫原性进行鉴定,再以纯化的AB为诊断抗原,通过对抗原-抗体反应条件的多重优化,建立检测RHDV抗体的间接ELISA方法。试验结果表明,本研究成功表达了RHDV VP60的优势抗原区（AB）,重组蛋白的分子量约为36 kDa,该蛋白能与RHDV抗体发生特异性反应。以纯化的AB为包被抗原,成功建立了检测RHDV抗体的间接ELISA方法。经过对部分田间样品的检测和应用,证明该方法具有特异性强、重复性好、敏感性高等优点。本研究为将来开展RHDV的流行病学调查和疫苗研究等提供了良好的技术手段。     

兔瘟重组VP60蛋白间接ELISA抗体诊断方法的建立

为建立一种快速的兔病毒性出血症病毒抗体检测方法,参照已发表的RHDV基因序列,采用RT-PCR扩增了长约510 bp的VP60基因片段,连接PGEX-4T-1表达载体后获得了以包涵体形式表达的重组VP60蛋白。重组蛋白纯化后,经免疫印迹检测证明具有良好的抗原性和特异性。以该蛋白作为诊断抗原,建立了检测兔病毒性出血症病毒抗体的VP60-ELISA诊断方法。该方法具有良好的敏感性、特异性和重复性,为RHDV的快速诊断、免疫兔群抗体监测和实验兔等级检测提供了一种快速、简便的血清学诊断方法。     

兔病毒性出血症

兔病毒性出血症(Rabbit HaemorragicDisease,RHD),又称兔瘟,是1984年春首先发生在苏南的一种兔的急性传染病,以传播迅速、发病率和死亡率高为其特征。在约两年的时间内,本病几乎传遍全国各养兔地区,使我国     

用Dot—ELISA检测兔出血症病毒抗体的研究

建立了敏感、特异、稳定的检测兔出血症病毒抗体的Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ，其敏感性比ＨＩ试验高１００倍以上。结果表明，当抗体效价在１：１６０时，攻毒保护率为５０％，在１：３２０以上时保护率为１００％。据母源抗体的动态检测结果，仔兔３０日龄时应进行首次免疫。     

ELISA验证兔铁蛋白重链与RHDV VP60相互作用

为验证本实验室前期实验中初步鉴定的兔铁蛋白重链(FTH)与兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白(VP60)具有相互作用关系,本研究采用RT-PCR技术从兔肝脏扩增编码FTH基因,并将其克隆至pET-32a(+)中转化大肠杆菌BL21 (DE3)pLysS中进行表达.重组FTH蛋白(rFTH)经IPTG诱导获得表达,采用Ni-NTA Agarose纯化rFTH.利用纯化的VP60作为ELISA包被抗原检测FTH与VP60的相互作用.结果表明,ELISA检测的OD490nm值与FTH蛋白量呈正相关.本研究进一步验证了FTH与VP60具有相互作用关系.     

鸭坦布苏病毒抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立快速检测鸭坦布苏病毒(DTV)的血清学方法,本研究利用纯化的DTV奉贤株(FX2010)作为包被抗原,建立了检测DTV血清抗体的间接ELISA方法,并且对各种检测条件进行了优化。优化后确定的抗原最适包被浓度为1.675μg/孔,抗原最佳包被条件为37℃放置2 h后,4℃下过夜,血清的最佳稀释度为1∶200,酶标抗体最适稀释度为1∶2 000。在优化条件下,阴阳性临界值判定标准为0.432。用建立的间接ELISA方法对禽流感病毒、新城疫病毒、网状内皮增生病病毒、I型鸭肝炎病毒、呼肠孤病毒、禽白血病病毒阳性血清进行了检测,均无交叉反应,表明该方法具有良好的特异性。批内和批间重复试验的最大变异系数分别为2.9%和3.9%,显示该方法具有很好的稳定性。用间接ELISA方法对140份疑似鸭坦布苏病血清样品进行检测,有108份样品呈现阳性,而琼扩试验只有32份呈阳性结果,而且用该方法检测的阳性样品包括了琼扩试验的阳性样品,证明该方法具有较高的敏感性和特异性。本研究快速检测DTV抗体间接ELISA的建立为该病的诊断和流行病学调查提供了新的方法。     

兔出血症病毒和巴氏杆菌双重PCR检测方法的建立及应用

参照GenBank公布的兔出血症病毒(RHDV)VP60、巴氏杆菌kmt基因序列,设计两对引物,分别用于扩增RHDV的VP60和巴氏杆菌kmt基因的目的片段。通过正交试验,对反应各组分浓度与组合、反应退火温度及反应参数进行优化,最后建立了RHDV、巴氏杆菌双重PCR检测方法并进行临床应用。结果显示:本试验建立的双重PCR检测方法能够特异性地检测RHDV及巴氏杆菌,最低核酸检出限分别达到70 pg和62pg。检测兔源大肠杆菌、葡萄球菌和链球菌,结果均为阴性。用本方法对临床送检的104份病料进行检测,结果检出RHDV与巴氏杆菌混合感染1份,巴氏杆菌单独感染10份,双重PCR检测结果与临床病原分离结果完全一致。表明本试验建立的兔出血症病毒和巴氏杆菌双重PCR检测方法具有良好的临床应用价值。     

兔出血症病毒西藏野毒分离株的鉴定

对西藏农牧学院分离的一株兔出血症病毒(RHDV)西藏野毒进行血凝性、特异性和致病性进行鉴定。结果表明,此株RHDV野毒血凝价高达10240以上;RHDV抗血清可特异性抑制该株病毒对人“O”型红细胞的凝集;西藏株RHDV的最小致死量为10^-5／mL,是一株具有高致病力的RHDV强毒株。     

重组N蛋白间接ELISA检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体

用纯化的猪繁殖与呼吸综合征病毒重组N蛋白作为包被抗原，建立了检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的间接ELISA方法，并确定了ELISA最佳工作条件：抗原包被浓度为0．27μg/ml，37C1h加4C过夜，血清(1：40)和酶标免抗猪IgG(1：400)分别在37℃温育30min，底物溶液37℃显色15min。经重复性试验、交叉试验、阻断试验等试验结果表明该方法重复性好、特异性强、灵敏度高；与美国IDEXX试剂盒相比较，特异性和敏感性分别为97．6％和92．1％，无显著性差异。用已建立的方法检测临床血清样本187份，总阳性率为30．5％。     

猪伪狂犬病毒间接ELISA抗体检测方法的建立

为了满足我国现阶段猪伪狂犬病病毒(PRV)高频突变引发新疫情诊断的需求,本实验通过生物信息学分析比较,设计合成了针对PRV g B糖蛋白高度保守的抗原优势表位区肽段,命名为g B872。以此肽段为包被抗原,经条件优化建立了新型的PRV-g B间接ELISA抗体检测方法。该ELISA方法检测结果显示,其仅对PRV血清检测为阳性,而与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒(O型)、猪细小病毒、猪圆环病毒2型等主要猪源病毒阳性血清均无交叉反应,表明该方法具有较强的特异性;最低检测下限血清稀释度为1∶128,高于IDEXX PRV/ADV g B抗体检测试剂盒检测下限稀释度(1∶4),表明该方法敏感性高;批内、批间重复性试验结果显示,变异系数均低于10%,重复性良好。利用该方法与Bio Chek PRV-g B抗体检测试剂盒检测90份临床血清样品,对比结果分析显示,两者阳性符合率为100%,阴性符合率为97.67%,总体符合率为97.78%;同时,采用该方法与IDEXX-g I(gE)和IDEXX-g B试剂盒分别对野毒感染血清和疫苗免疫血清同时检测,该方法可以准确识别野毒阳性血清和疫苗免疫阳性血清,与IDEXX两种试剂盒的结果一致。本研究建立的间接ELISA检测方法对PRV疫苗免疫效果评价、流行病学调查及防控提供了可靠的方法。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒重组N蛋白间接ELISA方法的建立

用纯化的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重组核衣壳(N)蛋白作为包被抗原,建立了PRRSV抗体检测的间接ELISA方法,并优化确定了ELISA最佳工作条件:重组抗原包被浓度为13.3 μg/mL,37℃1h或4℃过夜;5％脱脂乳37℃封闭2h;血清1:40稀释,37℃作用90 min;酶标二抗1∶4000稀释,37...     

猪脑心肌炎病毒重组抗原间接ELISA诊断方法的建立与应用

以猪脑心肌炎病毒VP1重组蛋白为抗原,建立了检测猪脑心肌炎病毒(EMCV)血清抗体的间接ELISA诊断方法。经优化后抗原最适包被浓度为2μg/mL,血清最适稀释度为1∶50,其作用时间为90 min,酶标抗体最适稀释度为1∶20 000,最适作用时间为30 min。判定标准为OD450≥0.427为阳性,OD450≤0.35为阴性,介于二者之间为可疑。该重组蛋白与PRRSV、猪瘟、PCV2、FMDV抗体反应呈阴性,证明具有良好的特异性。应用该方法检测了来自我国不同地区的26家猪场的156份临床血清,结果证明我国部分规模化猪场已有猪脑心肌炎疾病存在。     

兔出血症病毒TP株VP60基因DNA免疫小鼠的实验研究

为评价兔出血症病毒(RHDV)VP60基因在小鼠体内诱导产生体液免疫和细胞免疫情况,本研究构建了RHDV VP60基因的真核表达质粒pcDNA-VP60,并将其免疫小鼠。利用ELISA方法检测特异性抗体和小鼠外周血细胞因子水平,MTT法和流式细胞术(FACS)检测小鼠外周血T淋巴细胞增殖情况和T淋巴细胞亚群的动态变化。抗体检测结果显示,重组质粒免疫组抗体水平在免疫后5周～6周达到峰值,而且与对照组比较差异显著(p<0.05);细胞因子检测结果显示,重组质粒免疫组血清中IFN-γ、IL-2、IL-4因子水平随免疫时间延长而升高,并且能够维持较高水平,与对照组比较差异显著(p<0.05);T淋巴细胞检测结果显示,重组质粒免疫组T淋巴细胞明显增殖,CD4+T淋巴细胞数量免疫后明显增高,与对照组比较差异显著(p<0.05);所有检测指标显示重组质粒免疫组和灭活苗免疫组比较均无显著差异(p>0.05)。以上结果表明pcDNA-VP60重组质粒可以诱导小鼠产生特异性体液免疫和细胞免疫,为研制预防兔病毒性出血症的候选DNA疫苗提供了实验依据。