不同光周期条件下日本牙鲆尾部神经分泌系统转录组分析

为发掘日本牙鲆响应光周期变化的重要功能基因,采用新一代高通量测序RNA-seq技术分析8L∶16D、12L∶12D和16L∶8D等3个光周期条件下日本牙鲆尾部神经分泌系统(caudal neurosecretory system,CNSS)的基因表达变化。转录组测序结果显示,3个样品分别产生了5 807 622、6 147 140和6 116 872个Clean reads。分别对8L∶16D、12L∶12D和16L∶8D条件下的文库进行两两比较,共获得200个差异表达基因。GO分类分析表明,差异表达基因属于生物学过程、细胞定位和分子功能的42个类别。KEGG Pathway显著性富集分析差异表达基因共涉及29条代谢途径,包括糖酵解/糖异生、钙离子信号转导、血管平滑肌收缩和光信号转导等通路。上述结果不仅加深了对鱼类尾部神经分泌系统功能的认识,也为进一步探索硬骨鱼类光信号转导机制提供了多方面多层次的信息。     

团头鲂尾部神经分泌系统的超微结构及其在人工催产过程中的变化

在团头鲂尾部神经分泌系统的神经分泌细胞及其轴突中,可观察到三种不同类型的颗粒(即电子致密颗粒、电子致密度较低的颗粒和电子透明颗粒)。细胞质中线粒体、高尔基复合体和粗面内质网都比较发达,游离核糖体较多。在尾垂体的无髓神经纤维之间有时还可观察到桥粒结构。在性腺Ⅲ期至Ⅵ期,上述的细胞器变化不大,但三种颗粒的数量和分布却有明显的差别。根据团头鲂尾部神经分泌细胞和神经血管复合体超微结构的变化看来,人工催产有促进尾垂体电子致密颗粒中的分泌物向血管内释放的作用。     

牙鲆脑中促性腺激素释放激素受体的克隆和鉴定

GnRH（gonadotropin-releasing hormone）是下丘脑-垂体-性腺轴中重要的十肽信息分子,在所有的脊椎动物的生殖神经内分泌调控中具有重要的作用。GnRH成熟的十肽沿着轴突被运送到下丘脑正中隆起（median eminence）末端,然后进入下丘脑垂体门脉循环（hypothalamo hypophyseal portal circulation）（四足动物）或直接通过轴突末梢（大多数硬骨鱼）把信号传递给刺激性腺的细胞,与特异性受体结合,刺激促性腺激素（GtHs,gonadotropins）的合成与释放,参与脊椎动物繁殖的起始和维持正常生殖功能。伴随着GnRH的研究,研究者对鱼类GnRH受体的研究也越来越感兴趣,牙鲆（Paralichthys olivaceus）是中国重要的海水养殖鱼类,本研究从牙鲆脑组织中克隆得到全长的Type Ⅰ GnRH受体,并对其组织特异性表达作了分析,为牙鲆的神经生殖内分泌研究奠定了一定的基础。在本研究中,以海水养殖牙鲆为材料,从牙鲆脑组织中采用巢式PCR、5′-和3′-RACE技术克隆得到了1671bp牙鲆促性腺激素释放激素受体（GnRH-R）全长cDNA序列,包括147bp的5′-UTR、1248bp的开放阅读框和276bp的3′-UTR,GenBank登录号是DQ011872。牙鲆GnRH-R和其他物种GnRH-R的氨基酸序列的多序列比对结果显示,其存在许多保守的特征,牙鲆GnRH-R显示有3个主要的功能区域：1个N端胞外结构域（1～44个氨基酸残基）、1个大的跨膜结构域（45～324个氨基酸残基）和1个C端细胞质区域（325～415个氨基酸残基）。空间结构预测显示牙鲆GnRH-R跨膜区域包含7个高度保守的跨膜α螺旋（45—64、76—95、114—135、156—176、207—224、267—286、305—324）,这些α螺旋是受体锚定到细胞膜上必需的。氨基酸序列系统进化分析表明,牙鲆GnRH-R与琥珀鱼GnRH-R1具有高度同源性（85％同源性）。已知的硬骨鱼GnRH—R基因的系统进化分析表明,存在两种类型的GnRH-R基因：Type Ⅰ GnRH—R和Tpye Ⅱ GnRH-R基因。在牙鲆GnRH—R的氨基酸序列中,具有Type Ⅰ GnRH—R共有的典型基序：CAFVT（TMⅢ）和DlLEGKVSHSLTH（TMⅦ开始的序列处）,表明克隆得到的牙鲆GnRH-R属于Type Ⅰ GnRH—R。GnRH-R跨膜α螺旋之间的区域形成了胞内或胞外loops,这些区域参与受体信号转导和肽选择性功能上。牙鲆GnRH-R在TMⅢ的细胞质边界处具有一个保守的DRQSA／（DRXXXI／V）基序,这个基序被认为参与G蛋白偶联信号转导和GnRH肽诱导受体的激活;另一个保守的区域是位于TMⅦ内的NPXXY或DPXXY基序同样存在于牙鲆中（DPVIY）,这个基序参与到一些GPCRs（包括GnRH-R）的内在化（internalization）,同时这个基序特别是基序中的Tyr残基对于受体激活和信号转导起到关键作用。在第三个胞内loop中,鱼类GnRH—R有个保守的Ala残基（在牙鲆中为Ala^250）,其也在G蛋白偶联和受体内在化方面具有重要作用。在哺乳动物或非哺乳动物GnRH-R中,在第一个和第二个胞外loop之间由2个Cys形成1个保守二硫桥,是受体的正确折叠必需的。和其他的GnRH-R一样,牙鲆GnRH-R在第一个和第二个胞外loop之间存在由2个Cys（Cys^112和Cys^190）可以形成的潜在的二硫桥。这个二硫桥的完全缺失将会影响受体的结构完整性和降低鱼类GnRH—R对GnRH肽的选择性。GnRH-Rs的NH2-末端区域不是很保守,但含有糖基化位点,是GnRH—Rs表达、GnRH—Rs穿梭到细胞胞表面或受体稳定必需的。将mouse的GnRH—R糖基化位点引进到人GnRH-R中,可以增加受体的数量,但不影响受体结合力或肽选择性。牙鲆Type Ⅰ GnRH—R中在NH2-末端含有3个潜在的糖基化位点（N^11SSW、N^15GSS和N^22WTA）,此外,在第一个胞外loop和第二个胞外loop中分别存在1个糖基化位点（N^100ITV和N^178VTI）,牙鲆Type Ⅰ GnRH—R含有的糖基化位点比哺乳动物要多,牙鲆糖基化位点的数目是否／怎样影响牙鲆GnRH-R的表达、降解率或亲和力,应该进一步研究。在牙鲆GnRH-R的第一个胞内Ioop中,存在1个和tGnRH-R Ⅲ基序（^80KRKSH^84）一致的基序（^69KRKSH^74）,这个基序是Gs识别基序（BBXXB,B代表碱性氨基酸,X代表任何一种氨基酸）。已经证明这个基序和cAMP产生相关,cGnRH-Ⅱ能通过cAMP-PKA途径提高stbGnRH-R在COS7细胞中的活性。和其他非哺乳动物GnRH-Rs相似,牙鲆GnRH-R含有1个C-末端细胞内尾巴。这种胞内尾巴是鱼类GnRH-Rs功能必需的,在第三个胞内loop中,牙鲆GnRH-R含有2个PKC磷酸化位点（^233SKR^235和^262TLK^264）;在C端尾巴中,存在1个PKC磷酸化位点（^402TAR^404）。牙鲆GnRH-RC-末端尾巴中含有鱼类GnRH-R具有的Src同源区3（SH3）结合区域（PxxP序列）（^340PPAP）,能够潜在地传送偶联的能力到丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）,GnRH通过PKC和PKA调控GtHα和LHβ转录,二者都集中于MAPK水平。RT—PCR分析表明,GnRH-R在牙鲆脑和垂体有表达,暗示牙鲆GnRH-R参与到生殖行为如产卵行为;RT-PCR也检测到牙鲆GnRH-R在卵巢和睾丸中有表达,其能与牙鲆cGnRH-Ⅱ和sbGnRH在卵巢中共表达,GnRH肽在卵巢中具有自分泌／旁分泌功能,对牙鲆卵巢中的GnRH受体可能起到调控作用。[中国水产科学,2006,13（4）：536—546]     

促甲状腺激素释放激素(TRH)对大西洋牙鲆促生长作用

针对促甲状腺激素释放激素(TRH)对大西洋牙鲆的促生长作用进行了试验,将TRH分别以3μg/g和8μg/g的比例添加至颗粒饲料中,通过口服连续10天给药,在试验的第30天和第50天检测各组试验鱼的体重增长率。结果显示8μg/g组试验鱼体重增长明显,2次测量其增长率较对照组分别提高114.21%和70.77%,3μg/g组仅提高24.44%和2.63%。使用SPSS软件对各组试验鱼体重增长率进行差异性分析,8μg/g组试验鱼增重率和对照组存在差异显著(P0.05),3μg/g组牙鲆增重率与对照组无显著性差异(P0.05)。     

不同剂量促卵泡素对超排效果的影响

用两种不同剂量的FSH进行超排处理,结果表明用9mg的FSH处理,头均获得胚胎6.2枚、可用胚3.8枚;分别比8mg处理组多3.4枚、1.8枚(P<0.05)。表明用9mgFSH进行超排处理效果较好。     

黄颡鱼促卵泡激素受体基因的克隆及其在雌鱼生殖周期中的表达

为研究黄颡鱼促卵泡激素受体(FSHR)基因的克隆以及该基因在卵巢发育周期中的表达情况,实验首先采用SmartTMRace技术,获得了黄颡鱼促卵泡激素受体基因cDNA全长序列,该基因全长2 340 bp,编码661aa,具有G蛋白偶联受体超家族(G protein-coupled receptor,GPCR)的7个跨膜螺旋区(transmembrane domain)。经分析发现,得到的FSHR基因序列具有9个富含亮氨酸的重复性序列(LRRs);5个潜在的N-端糖基化位点;蛋白激酶C(proteinkinase C,PKC)磷酸化位点(403Y)位于第一个包外环,C-末端(C-terminal domain)G蛋白偶联区域,存在3个蛋白激酶C磷酸化位点(634S,643S,632T)。这些区域可能与FSHR的功能有密切关系。RT-PCR发现,FSHR基因在卵巢和脑中大量表达,在其他组织中均存在少量或微量的表达;在繁殖周期中,卵巢FSHR基因表达从Ⅲ期～Ⅳ期处于较高水平,在Ⅵ期时下降。研究推测,卵巢中FSHR基因参与黄颡鱼卵母细胞成熟及卵黄蛋白的积累过程。     

镉对鲤血清促性腺激素和生长激素的影响

采用ＣｄＣｌ２浸没法处理鲤,研究镉对鲤血清促性腺激素（ＧｔＨ）和生长激素（ＧＨ）水平的影响,结果表明,较镐浓度镉（ＣｄＣｌ２９ｍｇ／Ｌ）处理引起血清ＧｔＨ水平降低,ＧＨ水平升高,提高水中钙浓度,能使由镉引起的ＧｔＨ水平的降低恢得取正常水平,并对镉引起的ＧＨ水平升高起延迟作用,镉处理使鲤对ＬＨＲＨ－Ａ刺激ＧｔＨ分泌的反应性下降,提高水中钙浓度也不能恢复正常,实验结果提示,镉引起的ＧｔＨ和ＧＨ的变化可     

鱼类促性腺激素抑制激素及其受体的研究进展

促性腺激素抑制激素是2000年由日本学者首次从鹌鹑脑中分离出的一种新型下丘脑神经肽,通过其受体介导参与机体的生长、生殖以及摄食等生理过程。迄今,只在金鱼、斑马鱼、星点东方鲀、罗非鱼以及斜带石斑鱼等几种鱼中鉴定出促性腺激素抑制激素。目前,鱼类促性腺激素抑制激素的生理学功能研究相对较少,且存在争议。鱼类促性腺激素抑制激素及其受体的表达调控以及其他生理学功能仍有待进一步研究。本研究简要总结鱼类促性腺激素抑制激素及其受体的研究进展,并对促性腺激素抑制激素的生理学功能进行概括讨论,旨在加深对鱼类促性腺激素抑制激素的认识和了解,为进一步研究做铺垫。     

不同培育方式对台湾海峡野生牙鲆亲鱼产卵的影响

本文用2种不同培育方式对台湾海峡野生牙鲆亲鱼培育与促熟的效果进行了比较。结果表明,土池培养的亲鱼移入土池网箱中培育促熟,当性腺发育成熟时再从土池网箱移到室内水泥池产卵是亲鱼促熟产卵的较佳方式。     

施氏鲟促卵泡激素受体基因cDNA的克隆、表达及调控

为研究促卵泡激素受体基因(FSHR)在施氏鲟(Acipenser schrenckii)性腺分化过程中的表达、分布及调控作用,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和RACE技术克隆得到施氏鲟促性腺激素(FSHR)基因的全长cDNA序列,并对其编码氨基酸序列的特征、基因表达及调控作用进行了分析。结果显示:施氏鲟FSHR基因的cDNA全长为2 696 bp,编码661个氨基酸,属于含有信号肽、跨膜结构且分泌到细胞外的疏水性蛋白。氨基酸同源性及进化分析表明,施氏鲟与小体鲟(A.ruthenus)FSHR序列一致性最高,亲缘关系最近。PCR结果显示,FSHR mRNA的表达具有广泛性,各组织中均有表达,但在性腺、垂体中的表达量较高,显著高于其他组织中的表达量。LHRH-A注射实验显示:不同浓度组中,施氏鲟性腺组织中FSHR mRNA的表达量呈先升高后降低的变化趋势;与对照组相比,1μg/kg组在诱导3 d时性腺组织中FSHR mRNA的表达量达到最高,极显著高于3μg/kg和5μg/kg组。与性腺组织中FSHR mRNA表达模式不同,垂体中FSHR mRNA的表达呈升高后降低趋势,3μg/kg组在注射后第3天达最大值。综上结果表明,LHRH-A可通过调控FSHR的表达参与施氏鲟的早期性腺发育。     

牙鲆的胚胎发育

在牙鲆胚胎玻璃化冷冻中,为了准确选择胚胎的冷冻时期,掌握胚胎发育进程,同时为牙鲆苗种培育提供一定的依据,对海水工厂化养殖牙鲆的胚胎发育进行了研究。牙鲆受精卵培养在14-16℃、盐度29．9的海水中,利用Olympus显微镜对牙鲆胚胎发育过程连续观察,对各个胚胎时期的发育时间进行了记录,并对每一时期的特征用Olympus照像机进行了拍摄。实验记录了从受精卵到出膜后5d的29个具体发育时期的特征和发育时间,拍摄了30张具有代表性的胚胎和鱼苗图片,将牙鲆胚胎发育划分为卵裂期、囊胚期、原肠期、神经胚期、肌节期、尾芽期、心跳期、胚体转动期、出膜前期、出膜期10个连续的典型时期。在此培养条件下牙鲆胚胎历时93h完成整个胚胎发育,孵化出膜,再经96h的胚后发育卵黄囊完全吸收,之后进入变态期,向成鱼转化。     

牙鲆的养殖与饲料

介绍了牙鲆亲鱼、苗种及养成各阶段的养殖方式、养殖条件发展情况，讨论了微颗粒饲料、硬颗粒饲料、膨化颗粒饲料、软湿颗粒饲料、鲜杂鱼生鲜料、粉末饲料等多种饲料在牙鲆的全养殖过程的应用情况，总结了牙鲆配合饲料及营养研究的进展情况，列出了行业标准中的牙鲆饲料的营养要求。     

牙鲆脑垂体早期发育的组织学观察

垂体作为鱼类最重要的内分泌器官之一,在生长、发育、生殖以及其他一些内分泌相关生理活动中起重要作用。作者采用组织学方法观察了牙鲆的脑垂体发生,对不同发育时期的腺垂体细胞进行了初步鉴定。结果表明,孵化后1d仔鱼的间脑下方可见一实心细胞团,于孵化后3d迁移至间脑后方的漏斗体下,与来自漏斗体的神经内分泌细胞及其神经纤维结合共同形成脑垂体,前者形成腺垂体,后者则主要形成神经垂体。孵化后8d腺垂体分为中间部(Pars intermedia,PI)和外侧部(Pars distalis,PD)两部分。孵化后14d腺垂体分化为前外侧部(Rostral pars distalis,RPD)、中外侧部(Proximal pars distalis,PPD)和PI共3部分,为\"前后型\"脑垂体。稚鱼变态期间及变态完成后的幼鱼,各部分从\"前后型\"排列开始向\"背腹型\"排列转变。孵化后14d的牙鲆仔鱼中,PPD细胞多呈强嗜酸性,至变态完成后一直是PPD的主要细胞;PI靠近神经纤维的细胞呈强嗜碱性。孵化后42d的牙鲆幼鱼RPD中,与神经垂体相邻的少量细胞呈嗜碱性,而其下方细胞则呈嗜酸性。根据成体牙鲆激素分泌细胞的染色特征对上述各细胞类型进行了推测。     

牙鲆人工育苗试验

2000年12月20日至2001年2月15日在日本静冈栽培中心进行牙鲆人工育苗试验。4.3万粒受精卵经50多h后,共计孵出仔鱼2.9万尾。在水温17-18℃,pH8.0-8.2,海水比重1.021的条件下,经55d培育,共育出平均全长25mm的鱼苗1.6万尾,育苗成活率的55%。     

Channel Catfish,Ictalurus punctatus,Immunity to Saprolegnia sp.

ABSTRACT

The Japanese flounder, Paralichthys olivaceus, is one of the most common finfish cultured in Japan and Korea. Despite the relatively high production of fingerlings, some problems remain, mainly related to the larval feeding and cost of maintaining microalgae and rotifers. In order to determine the effects of different diets on the Japanese flounder larval growth and survival, a series of experiments was carried out related to the size and nutritional value of different live feeds. The larvae culture conditions were at 10 or 20 larvae/L in 50 to 2,000 L tanks, with aeration and with or without “green water,” and a temperature range of 18.5 to 22.5°C. The live foods used were microalgae (Chlorella ellipsoidea and Nannochloris oculata), baker's yeast, experimental n-yeasts, oyster trochophore larvae, three strains of rotifer Brachionus plicatilis (L-type, S-type and U-type) and Artemia nauplii. Variations were detected in size, dry weight, and chemical composition of the three strains of rotifers used. The maximum number of rotifers ingested by flounder larvae increased steadily from 7 individuals, at first feeding (3.13 mm), to 42 individuals at 5.25 mm of total length (6 days after first feeding). There was a relationship between larval total length and size of the rotifers ingested. The effect of rotifer size on larval growth and survival appeared to be limited to the first two days of feeding. Of the diets tested in the growth and survival of larval flounder during 14 days after hatching, rotifers fed on C. ellipsoidea and raised in green-water gave the best results. Rotifers cultured on enriched N. oculata and n-yeasts did not support larval growth and caused higher mortalities. The n-yeasts used as rotifer enrichment appeared to satisfy, partially, the nutritional requirement of 7-day-old flounder larvae, as did n-yeast squid wintering oil the requirements of 14-day-old larvae. From 7-9-days after hatching and throughout the second 14-day period, rotifers and Artemia cultured on N. oculata improved the survival of flounder compared with those fed on rotifers cultured on C. ellipsoidea. Moreover, the larval growth did not vary significantly between both microalgae-rotifer feedings. No clear relation was found between total protein, lipid, amino acids and fatty acids of live feeds with the growth and survival of flounder larvae, although the total lipid was higher in C. ellipsoidea than in N. oculata. The Artemia nauplii San Francisco strain appeared to be more suitable for the growth and survival of flounder larvae, than the Utah strain. The nutritional value of Artemia nauplii (Utah strain) for flounder larvae remained unchanged despite the use of either microalgae as nauplii enrichment.     

基于牙鲆RNA-seq数据中SSR标记的信息分析

通过对牙鲆(Paralichthys olivaceus)进行转录组测序(RNA-seq),利用Micro SAtellite(MISA)软件对1~6个碱基重复、碱基数在10 bp以上的微卫星进行鉴定。结果表明,牙鲆转录组水平上,共发现42 183个SSR位点,分布在26 457条Unigene上,发生频率为27.12%,平均密度为339个/Mbp。获得的SSR一共有216种重复基元,其中二核苷酸重复基元类型数量最多,共有17 570个,占所鉴定SSR总数的41.65%。同时用SPSS statistics 20.0软件对牙鲆转录组SSR的多态性进行了评估。     

养殖褐牙鲆细胞色素b基因序列的初步研究

对养殖褐牙鲆(Paralichthys olivacews)的线粒体DNACytb基因的部分序列进行测定,测得的目的DNA片段的长度为410bp,其A(104bp)、T(119bp)、C(117bp)、G(70bp)4种碱基平均含量分别为25．4％、29．0％、28．5％、17．1％。在28个褐牙鲆个体中共出现了3种单倍型。白化褐牙鲆出现的第1种和第3种单倍型个体数分别为10尾(占白化褐牙鲆样本数的如90．91％)和1尾(9．09％);6尾黑化褐牙鲆均出现第1种单倍型(100％);正常褐牙鲆出现的3种单倍型尾数分别为7尾(占正常褐牙鲆样本数的55．56％)、2尾(22．22％)和2尾(22．22％);测得的序列与既知序列间在第6bp、第19bp和第402bp碱基处出现差异。由于褐牙鲆Cytb基因的高度同源性,研究其白化、黑化和正常状态时出现的序列差异,对于寻找褐牙鲆白化机理研究的分子标记意义重大。     

鳗弧菌L-18株的限铁条件和铁调节外膜蛋白的免疫效果研究

利用Western-blot技术,对鳗弧菌L-18株的OMPs和IROMPs的免疫反应性进行了分析,并通过免疫牙鲆比较二者免疫保护力的差异,以期从IROMPs方向探索开发鳗弧菌新型鱼用疫苗,并为研究其免疫原理提供重要的科学依据。结果表明,培养基中加入不同浓度的联铁剂,鳗弧菌L-18株的生长和铁载体的表达出现规律性变化,其中加入100~130μmol·L-1 2,2’-联吡啶为最适合限铁条件,此时铁载体的表达量最高且生长受抑制程度较小。在此条件下,菌株表达出74.3ku和77.4ku的IROMPs,其中77.4ku蛋白具有免疫反应性,为重要抗原。用全菌灭活疫苗、OMPs、IROMPs分别腹腔注射免疫牙鲆7周后攻毒, IROMPs疫苗的相对免疫保护力达到75.9%,远高于OMPs疫苗的51.8%。相对于OMPs,IROMPs的抗体效价显著提高,接近全菌疫苗组的水平,而血清杀菌活力没有显著变化。关键词：鳗弧菌;铁调节外膜蛋白;牙鲆