猪伪狂犬病病毒疫苗株Bartha—K61在犬科动物体内的安全性评价及免疫实验

为了对猪伪狂犬病病毒（PRV）疫苗株Bartha—K61在犬科动物体内的安全性和免疫原性作出评价,通过3种免疫途径（肌肉注射、滴鼻免疫和口服免疫）对犬进行免疫（2mL,6×10^8PFU／mL）,并在免疫结束后通过组织病理切片、免疫组化、临床表现、产仔性能、排泄物中病毒存留情况进行了检测。结果发现,在PRV易感器官内未发现病毒抗原,且疫苗接种犬体温正常,精神状态良好,产仔正常,无任何不良症状,排泄物中亦无病毒粒子残留;同时,通过对免疫后犬只的细胞免疫水平、体液免疫水平和中和试验的检测发现,3种免疫途径均可有效地刺激机体产生免疫应答,且中和抗体水平达到较高水平。从而证明,PRV Bartha-K61在犬科动物体内安全有效,为以PRV为载体表达犬科动物疫病的抗原基因重组活载体疫苗的研制提供了科学依据。     

猪伪狂犬病病毒HNX株在免疫猪群中水平传播能力的研究

为研究猪伪狂犬病病毒(PRV)HNX株水平传播的能力及PRV活疫苗的保护效力,本研究通过以颈部肌肉接种PRV HNX株(2 m L 107 TCID50)的未免疫猪作为病毒的传染源,同居感染未免疫猪和Bartha-K61株活疫苗免疫猪,通过检测抗PRV的g B和g E蛋白抗体、中和抗体及干扰素水平等评估疫苗保护力,并利用荧光定量PCR方法检测同居感染猪排毒情况。结果显示Bartha-K61株活疫苗能够快速诱导免疫猪产生抗g B蛋白的抗体,但疫苗诱导产生的交叉保护中和抗体水平较低。同居感染期间,免疫猪和未免疫猪均出现典型的临床症状,体温明显升高。荧光定量PCR方法结果显示,疫苗免疫能够减少免疫猪排毒,但不能阻止排毒,也不能阻止野毒感染。本研究结果表明Bartha-K61株活疫苗阻止PRV HNX株水平传播的效力是有限的,有必要更换疫苗病毒株。同居感染期间,每组感染猪均表现敏感,表明PRV HNX株病毒具有较强的水平传播能力。     

高剂量高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒TJM-F92疫苗株对低剂量伪狂犬病毒Bartha-K61疫苗株的免疫干扰研究

为研究高剂量高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)TJM-F92疫苗株对低剂量伪狂犬病毒(PRV)Bartha-K61疫苗株是否存在免疫干扰作用,本研究对其从体液免疫水平、免疫攻毒保护水平及病理学变化等方面进行评价。结果表明,二联免疫组抗体消长规律与低剂量PRV Bartha-K61株免疫对照组抗体消长规律相一致,二联免疫组中高剂量PRRSV TJM-F92株未抑制低剂量PRV Bartha-K61株抗体生成;二联免疫组与低剂量PRV Bartha-K61免疫对照组对PRV JL1株强毒攻击保护率均为5/5;免疫病理学研究结果表明,两组免疫组攻击PRV JL1株强毒后各组织器官病理变化轻微;二联免疫组与低剂量PRV Bartha-K61免疫对照组均可对PRV强毒攻击产生良好的保护效果。综上,高剂量PRRSV TJM-F92株对低剂量PRV Bartha-K61株无免疫干扰作用。     

伪狂犬病病毒GD1406变异株的抗原性分析

为了解近年来广东省伪狂犬病病毒(PRV)变异情况,本研究从猪场收集Bartha-K61活疫苗免疫后的猪血清559份,经ELISA筛选出326份gB抗体阳性且gE抗体阴性的猪血清,进行中和试验,分析血清中的疫苗抗体对Bartha-K61株和临床分离到的PRV GD1406野毒株的中和能力。进一步应用小鼠进行交叉免疫保护性试验。结果显示,187份gB阳性且gE阴性的猪血清样品对Bartha-K61株和PRV GD1406野毒株的平均中和抗体滴度分别为1:57和1:13,并且免疫Bartha-K61株使小鼠免受PRV GD1406野毒株致死性攻击的保护率仅为20%,而免疫PRV GD1406野毒株使小鼠免受Bartha-K61株致死性攻击的保护率为100%,免疫灭活PRV GD1406野毒株使小鼠免受PRV GD1406野毒株致死性攻击的保护率为40%。根据试验结果推测,PRV GD1406野毒株与Batha-K61株之间存在抗原差异性,现用疫苗不能有效抵抗PRV变异株攻击。本研究结果将为PRV的防控提供实验依据,为研制PRV新疫苗提供新的思路。     

猪伪狂犬病毒gB、gC和gD蛋白多抗制备及交叉中和抗体效价测定

为研究猪伪狂犬病毒(PRV)主要免疫原性基因的抗原变异情况,本研究构建了PRV变异株JS-2012和弱毒疫苗株Bartha-K61的g B、g C和g D基因重组真核表达质粒。通过基因枪途径免疫新西兰大白兔,对制备的兔源多克隆抗体进行交叉中和抗体效价的测定。结果显示,JS-2012和Bartha-K61株的g C蛋白和g D蛋白多抗对PRV JS-2012变异株、SC经典强毒株和Bartha-K61弱毒疫苗株的交叉中和效价均无显著差异;而两个病毒株的g B蛋白多抗对JS-2012和SC株的中和效价较低,分别为1∶29.0~56.7和1∶56.2~137.0,对Bartha-K61株以及其他毒力基因缺失弱毒疫苗株的中和效价较高,分别为1∶75.0~490.0和1∶198.6~986.9,差异显著,推测该结果可能与PRV毒力基因缺失有关。本研究为进一步鉴定PRV流行株的抗原变异奠定基础。     

伪狂犬病病毒疫苗株SA738侵染BHK-21细胞诱导其凋亡及Caspase3表达情况分析

旨在深入了解猪伪狂犬病病毒疫苗株PRV SA738侵染BHK-21细胞后,诱导细胞凋亡,细胞凋亡的时间及相关细胞凋亡因子表达情况。通过测定传统疫苗毒株Bartha-K61株和实验室人工筛选的gI-/gE-/PRV SA738病毒株滴度,分别利用2株疫苗毒株侵染BHK-21,采用原位双荧光染色法检测细胞凋亡,用分光光度法测定细胞凋亡因子Caspase-3表达情况。结果表明,低剂量gI-/gE-/PRV SA738疫苗毒株和Bartha-K61疫苗毒株均延迟侵染细胞的凋亡。缺失疫苗毒株gI-/gE-/PRV SA738延迟侵染细胞的凋亡时间比Bartha-K61疫苗毒株时间长,但侵染细胞增殖速度下降。细胞凋亡后期最终细胞死亡,正常细胞细胞死亡后无凋亡小体。gI-/gE-/PRV SA738疫苗毒株和Bartha-K61疫苗毒株侵染细胞凋亡后期凋亡小体形成,并检测到膜结构。在病毒侵染早期细胞内关键凋亡细胞因子Caspase3表现为上调。Caspase-3参与了病毒侵染过程中细胞凋亡的调控。     

猪伪狂犬病病毒灭活疫苗对猪伪狂犬病病毒流行毒株和经典毒株的免疫保护效果评估

为评估猪伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）灭活疫苗（HN1201-ΔgE株）免疫后对PRV流行毒株和经典毒株的保护效果,本研究对试验猪分别免疫PRV灭活疫苗（HN1201-ΔgE株）和PRV活疫苗（Bartha-K61）,免疫后第0、7、10、14、17、21、24和28天采血测定PRV gB抗体,并分别使用PRV流行毒株HN1201株和经典毒株闽A株测定免疫后第0、7、14、21和28天血清的中和抗体水平,于免疫后第28天分别使用HN1201株和闽A株攻毒并观察,之后测定体温,测定攻毒后第7和14天PRV gE抗体,及攻毒后0~8 d的排毒情况。结果显示,HN1201-ΔgE免疫组较Bartha-K61免疫组gB抗体和中和抗体产生早,且抗体水平较高。两个免疫组试验猪在攻毒后虽然均无明显临床症状,且免疫组织化学检测（IHC）组织中的病毒抗原均为阴性,但HN1201-ΔgE免疫组试验猪脏器未见任何病理损伤,Bartha-K61免疫组试验猪部分脏器具有病理损伤。与未免疫对照组相比,2个免疫组试验猪在HN1201株和闽A株攻毒后,gE抗体转阳时间晚且排毒率低,HN1201-ΔgE免疫组gE抗体水平整体均低于Bartha-K61免疫组,攻毒后排毒检测中,Bartha-K61免疫组于2个毒株攻毒后第3~5天可检测到排毒,而HN1201-ΔgE免疫组全程未检测到排毒。研究结果表明,灭活疫苗（HN1201-ΔgE株）对PRV流行毒株和经典毒株均可提供完全保护。     

我国猪伪狂犬病变异株研究概况

伪狂犬病(Pseudorabies,PR)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的、严重危害养猪业的一种烈性传染病。在过去的几十年里,我国通过在猪群中广泛使用Bartha-K61株基因缺失弱毒疫苗,使PR得到了有效控制。但自2011年以来,在全国范围内,许多Bartha-K61疫苗免疫猪群出现了PR疫情。研究证实,该疫情是由PRV变异株引起的,与以往毒株相比,PRV变异株致病性明显增强,且Bartha-K61疫苗不能对猪只提供完全的免疫保护。目前针对PRV变异株的疫苗正在研制中,其中基因缺失活疫苗能够对当前流行的PRV变异株提供完全的免疫保护,这些疫苗大多处于转基因安全评价阶段。在诊断方法上,已经建立了能够有效区分Bartha-K61疫苗株、PRV经典强毒株和当前流行的变异株的三重荧光定量PCR方法。利用安全有效的基因缺失疫苗和配套的鉴别诊断技术,并结合有效的生物安全防控措施,对PR进行净化,是未来必由之路。本文对我国当前PR的流行病学、诊断方法、疫苗研制和防控策略等进行了简述和讨论。     

伪狂犬病病毒Qihe547分离株主要保护性抗原基因序列的变异分析

2012年以来伪狂犬病(PR)在全国多省份暴发。为了解流行PR病毒(PRV)主要保护性抗原基因的变异情况,本研究从山东齐河地区经PRV Bartha-K61疫苗株免疫猪群中分离到一株PRV命名为Qihe547株,并采用PCR方法对该病毒分离株编码主要保护性抗原糖蛋白gB、gC和gD基因进行扩增及测序分析。结果显示,该病毒株与新近PRV分离株同属基因Ⅱ型。与Bartha株相比,Qihe547分离株在gB的优势抗原表位区(aa59~aa126)、gC膜外区(aa23~aa453)和gD主要抗原表位区,潜在的抗原位点及O-糖基化位点存在明显变异,推测这些变异可能影响Qihe547分离株的抗原性,利于病毒逃避宿主免疫反应,也可能是Bartha-K61疫苗诱导产生的中和抗体不能完全中和病毒的原因之一。本研究为PRV的有效防制及其疫苗研制提供了相关的数据。     

猪伪狂犬病病毒HDDJ株的分离鉴定

广东省某猪场常规免疫猪伪狂犬病疫苗(Bartha-K61株)的母猪流产,疑似为猪伪狂犬病病毒感染。为确定发病原因,将流产胎儿的脑、淋巴结、肺脏研磨混合液接种Vero细胞,形成稳定细胞病变(CPE),并测定其细胞半数感染量(TCID50),通过PCR鉴定、测序比对、进化树分析,确定感染病毒及基因型,动物回归实验判定病毒致病性。结果表明,分离毒株为PRV中国变异株,命名为HDDJ株,与猪伪狂犬病疫苗Bartha-K61株亲缘关系较远。