用PCR鉴定大肠杆菌O157:H7

根据大肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ７的编码ｅａｅ蛋白的ｅａｅ Ａ基因和大肠杆菌编码Ｈ７抗原的ｆｌｉＣ基因的核苷酸序列,合成了２对窦核苷酸引物,建立了一个检测大肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ７的ＰＣＲ方法,对１１株已知大肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ７（ＮＭ：无运动性）株和其他不同属的４２株已知肠道致病菌的检测结果表明,该方法只从大肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ７（ＮＭ）株的ＤＮＡ中产生预期的扩增产物,而从其他菌株的ＤＮＡ中未扩增出任何ＤＮＡ不     

检测冻肉中大肠杆菌O157：H7的两种方法比较

大肠杆菌O157：H7属于肠出血性大肠杆菌（enterohemorrhagic E．coli，EHEC），是EHEC的主要血清型。感染大肠杆菌0157：H7可使人息腹泻、出血性结肠炎，也可引发溶血性尿毒综合征及血栓形成性血小板减少性紫癜等严重并发征。笔者运用胶体金免疫（Colloidal gold immunoassay，GIA）检测卡和荧光PCR技术，对东莞市108份冻肉中的大肠杆菌O157：H7进行了检测，并对2种方法的检测效果进行了分析比较。     

致病性大肠杆菌O157：H7研究概述

概述了致病性大肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ７的生物学特性、流行病学、诊断、治疗和预防等,并加以分析。揭示了大肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ７感染对人类的危害,以及加强对该病进行研究和防治的重要性。     

动物性食品中O157：H7大肠杆菌污染及防止措施

O_(157):H_7大肠杆菌(Eschericha coli O_(157):H_7)是肠出血性大肠杆菌的最主要的一种血清型。对人的致病性很强。该菌污染动物性食品后随食物进入人体,引起出血性肠炎,导致出血性肠炎。 1.国内外流行情况 近年来由于O_(157):H_7大肠杆菌污染食品导致食用者感染的情况较为多见。在1982年美国发生了两起该菌食物中毒事件,有19人死亡,该事件是由当地一家快餐店售出的汉堡包中牛肉饼受O_(157):H_7大肠杆菌污染所致。在1983年美国西部地区也发     

控制大肠杆菌O157：H7对食品、水源等的污染

大肠埃希菌O157：H7感染性腹泻是人类新发生的传染病，已成为世界关注的公共卫生问题。大量研究证实，家禽、家畜是大肠埃希菌O157：H7的重要宿主。近年来，由肠出血性大肠杆菌O157：H7引起的食源性疾病的暴发、流行呈逐年上升的趋势。它能引起出血性肠炎、溶血性尿毒综合症、血栓性血小板减少性紫癫等临床症状，致病性强、死亡率高，对人体的健康造成很大的威胁。     

闽西地区猪源大肠杆菌O157：H7的分离与鉴定

大肠杆菌(E.coli O157)是一种新型的致病性大肠杆菌，能引起人类出血性腹泻和溶血性尿毒综合征，该菌无侵袭力，也不产生肠毒素，但能产生一种毒力甚强的细胞毒素，引起盲肠、阑尾和升结肠黏膜上皮细胞坏死、黏膜充血、水肿和出血，还可进入血液。并通过血脑屏障，损伤血管内皮细胞而引起血栓     

一株产志贺毒素Ⅱ且山梨醇阳性的大肠杆菌O157：H7的分离与鉴定

在上海某猪场采集6份腹泻猪粪便样品和2份病死猪小肠内容物样品,增菌后经麦康凯培养基和伊红美兰培养基分离得到32株疑似大肠杆菌,通过PCR方法分析O157特异基因rfbE和血清学鉴定,分离获得一株肠出血性大肠杆菌O157：H7。PCR检测该菌株的毒力因子携带情况,结果表明其只携带志贺毒素Ⅱ,而不携带志贺毒素I、紧密素和溶血素等毒力因子;生化试验发现该菌株与大多数O157：H7特性不同,可分解山梨醇;毒力试验和耐药性试验表明该菌株毒性较强,且耐药性很强,对大多数抗生素不敏感。     

牛源大肠杆菌O157：H7的分离及毒力基因鉴定

从2个牛场采集新鲜粪便,增菌后,免疫磁珠富集,涂布筛选性培养基,挑取可疑菌落用rfbE/fliC二重PCR和血清学方法鉴定。设计毒力基因stx1、stx2、eae、hlyA和tccp相应引物,针对O157：H7对分离株进行PCR鉴定。口服攻毒链霉素处理的BALB/c小鼠明确分离株致病性。结果显示,成功分离到7株出血性大肠杆菌O157：H7,并且有1株迟缓性发酵山梨醇麦康凯培养基。毒力基因检测显示,其中6株毒力因子表型为stx1-stx2＋eae＋hlyA＋tccp＋,另有1株表现型为stx1＋stx2＋eae＋hlyA＋tccp＋,各分离株tccp基因均为阳性,但携带的重复片段数量有差异。所采集样品中肠出血性大肠杆菌O157：H7的检出率高达12%。1×1010 CFU同剂量口服接种经PBS洗涤的5株O157：H7分离株全菌,小鼠存活率有差异分别为40%,50%,60%,20%,50%,各分离株在小鼠体内排菌时间也有差异分别为攻毒后7,9,13,13,15d。     

家兔出血性大肠杆菌O157：H7的感染试验研究

以出血性大肠杆菌O157：H7对家兔进行试验感染,观察了大肠杆菌O157：H7对家兔的影响,通过玻片凝集试验分析了粪中大肠杆菌O157：H7的变化,结果表明,大肠杆菌O157：H7可导致兔的肠道反应和腹泻,在腹泻期排出的菌体最高,并可维护较长时间的带菌,说明家兔依然是志贺样毒素大肠杆菌的易感性动物、应引起高度重视。     

大肠杆菌O157:H7 rfbE基因和fliC基因的克隆与序列分析

根据已发表的E．coli O157：H7 EDL933株的rfbE基因和fliC基因，设计了两对引物，分别对两个O157：H7，菌株的rfbE基因和一个菌株的fliC基因进行PCR，并将PCR产物克隆于pMD18-T栽体质粒。测序结果表明，获得到了与理论相符的582bp rfbE基因片段和802bp fliC基因片段。一株菌的rfbE基因存在无意义突变（两个）。而另一株菌fliC基因有一个有意义突变（aac→gac）     

补充氯酸钠可降低牛体内大肠杆菌O157：H7的数量

牛是食源性大肠杆菌O157：H7的天然贮藏库。因此，在屠宰前先减少大肠杆菌O157：H7的数量，可降低人类感染这种急性致病菌的几率。当可以利用硝酸盐厌氧生长的细菌(例如大肠杆菌)与氯酸盐接触时，细胞内的硝酸盐还原酶在将硝酸盐转变为亚硝酸盐同时也将氯酸盐转变为亚氯酸盐，从而导致细菌死亡。由于氯酸盐只对具有硝酸盐还原能力的细菌起作用，这就意味着可以采用补饲氯酸盐的方法减少屠宰前牛体内的大肠杆菌O157：H7数量。饲喂育肥型高谷物日粮的实验牛(n=8)被人为地感染3株大肠杆菌O157：H7后，分别给饮用添加2．5mM硝酸钾与100mM氯化钠(对照，n=4)和2．5mM硝酸钾与100mM氯酸钠(氯酸盐处理，n=4)的水。24h后氯酸钠处理组的瘤胃内所有大肠杆菌O157：H7株的数量下降了2个数量组(104到102)，粪便中的数量则下降了3个数量级(106到103)。氯酸盐处理组瘤胃中总肠杆菌和大肠杆菌数从106减少到104，在其余的胃肠道段(回肠、盲肠、结肠和直肠)也降低了2个数量级。氯酸盐处理组减少了整个肠道中大肠杆菌O157：H7的数量，但没有改变可培养的厌氧菌总数或瘤胃发酵模式。因此，采用屠宰前补饲氯酸盐的方法来减少大肠杆菌O157：H7数量是可行的。     

猪源大肠杆菌O157:H7广西分离株的鉴定

为了解大肠杆菌O157:H7是否在猪场存在,采集有拉稀症状猪的粪便,接种到新生霉素mEC增菌肉汤,增菌培养后转接到O157:H7显色培养基上,对可疑菌株用因子血清和PCR方法做进一步鉴定,实验结果证实得到5株大肠杆菌为O157:H7血清型。动物试验发现,5个分离菌株对小白鼠的致死率为33.3%—100%之间。调查结果证实广西猪群中存在强致病性的O157:H7血清型大肠杆菌。     

肠出血性大肠杆菌O157：H7主要保护性抗原单克隆抗体的研制及特性分析

以基因重组技术构建工程菌株表达肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7主要保护性抗原紧密素和志贺毒素的融合蛋白。融合蛋白采用凝胶分离电洗脱法回收纯化,用纯化的蛋白抗原免疫BALB/c小鼠,细胞融合后获得的3株杂交瘤细胞株1G2、3C6、1B10,能分别稳定分泌针对紧密素、志贺毒素Stx1和Stx2的单克隆抗体。3株单抗分别制备腹水并纯化,ELISA检测效价分别为1∶6.4×105、1∶1.2×106、1∶3200。Western-blot检测表明,3株单抗与融合蛋白发生特异性反应。应用3株单抗均可特异性检出EHECO157∶H7,而3株单抗与其他不产生紧密素和志贺毒素的大肠杆菌不反应。     

用PCR鉴定大肠杆菌O157∶H7

根据大肠杆菌Ｏ１５７∶Ｈ７的编码ｅａｅ蛋白的ｅａｅＡ基因和大肠杆菌编码Ｈ７抗原的ｆｌｉＣ基因的核甘酸序列,合成了２对寡核苷酸引物,建立了一个检测大肠杆菌Ｏ１５７∶Ｈ７的ＰＣＲ方法。对１１株已知大肠杆菌Ｏ１５７∶Ｈ７（ＮＭ;无运动性）株和其他不同属的４２株已知肠道致病菌的检测结果表明,该方法只从大肠杆菌Ｏ１５７∶Ｈ７（ＮＭ）株的ＤＮＡ中产生预期的扩增产物,而从其他菌株的ＤＮＡ中未扩增出任何ＤＮＡ产物。该方法从基因水平直接确定大肠杆菌的血清型,特异性强,克服了以往血清学方法有非特异性反应的缺陷,为检测和鉴定大肠杆菌Ｏ１５７∶Ｈ７（ＮＭ）提供了一个新方法。     

西宁市售动物性食品中肠出血型大肠杆菌O157：H7的检测

对西宁市售的动物性食品羊肉(20份)、牛肉(20份)、猪肉(20份)、鸡肉(20份)、牛奶(20份)、卤肉(10份)进行了大肠杆菌O157:H7检验,各样品先用mEC肉汤增菌,然后在选择性培养基TC-SMAC、MUG-LST培养此菌,经微量生化实验初步鉴定。结果是从110份样品中分离出1株大肠杆菌O157:H7,总检出率为0.9%;说明在西宁市售动物性食品中检出了大肠杆菌O157:H7。     

从长春地区牛肉和猪肉中检出产vero毒素大肠杆菌O157:H7

用分离培养法、生化反应鉴定、胶乳凝集试验和聚合酶链式反应（ＰＣＲ）对长春地区市售的４０份牛肉和３０份猪肉样品进行了调查,结果从２份牛肉（５％）和１份猪肉（３．３％）样品中检出了产ｖｅｒｏ毒素大肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ７。     

牛源大肠杆菌O157:H7的分离鉴定

为调查新疆部分地区E.coli O157：H7的感染情况和菌株致病性,从新疆阿克苏、伊犁、塔城3个地区的牛场采集新鲜粪样564份,对E.coli O157：H7进行分离与鉴定。利用E.coli营养肉汤（EC肉汤）对样品进行增菌后,用山梨醇麦康凯培养基（SMAC）平板选择性培养,再经过4-甲基伞形酮-β-D葡萄糖醛酸苷培养基（MUG）的筛选,对疑似菌株进行生化和PCR鉴定,并将分离鉴定到的菌株进行小鼠攻毒试验。结果显示,从伊犁地区采集的样品中共分离出2株E.coli O157：H7（Y166和Y226）,其检出率为0.88%;小鼠攻毒试验中,Y166和Y226试验组小鼠在48 h内全部死亡,具有一定致病性;从阿克苏、塔城所采样品中未分离到E.coli O157：H7。