澳洲坚果优良单株的DNA分子标记鉴定

选用一组高效SSR引物,用于澳洲坚果杂交优株及诱变优株的DNA分子标记数据采集。从早期设计并筛选的SSR标记中挑选多态性高、重复性好、在染色体上分布均匀的9对引物,经PCR扩增,利用毛细管电泳,对1份化学诱变优株、52份杂交优株及13个亲本共66份材料进行电泳检测。1对引物在66份材料中存在较高的数据缺失率,最终选取7对SSR引物用于后续数据的采集。将7个亲本选为参照品种,并设置了7个亲本的两组平行试验,建立了53份优良单株及其亲本的分子标记数据库,可为其新品种登记提供技术支持。     

杨树抗逆转录因子基因内SSR标记的开发

利用直接测序法开发小叶杨抗逆转录因子基因内一套新的核基因组SSR标记。通过对3个抗逆转录因子共21个成员在36个小叶杨基因型个体中的序列比较分析后共检测到31个SSR多态性位点,SSR出现的频率为1/1916bp。在小叶杨自然群体中,SSR多态性位点的碱基重复呈现出2～5碱基形式,基元重复次数变异范围为3～20次,其中以二碱基重复的位点较多,占总数的51.6%。在此基础上,依据SSR位点两侧的保守序列,设计31对SSR位点PCR扩增引物对。利用设计的引物检测所开发的SSR位点在杨属内22个基因型个体中PCR扩增的有效性及SSR位点的保守性。PCR扩增结果显示,93.5%的SSR位点能够在杨属内至少4个派内有效扩增,每对引物组合可检测到SSR多样性位点数3～12个,平均6个。基于抗逆转录因子基因内开发的SSR标记位点为分子标记辅助小叶杨抗逆性状育种提供工具。     

丽江油橄榄品种表型及SSR标记的多样性及聚类分析

基于表型性状及分子标记对丽江不同油橄榄品种进行遗传多样性分析,对品种鉴定及育种工作均有重要意义。以云南丽江主要栽培的19个油橄榄品种为试验材料,利用14个表型性状(5个叶片性状和9个果实性状)及20个SSR引物荧光标记进行多样性及聚类分析。结果表明,各品种油橄榄表型性状存在显著差异,20个SSR位点共检测到124个等位基因变异,平均每个位点等位基因数为6. 2个,利用表型性状及SSR荧光分子标记可完全把19个品种油橄榄完全区分开。由此可知,云南油橄榄选育品种及引种品种均具有高水平遗传多样性,对于表型性状相似的油橄榄品种需结合SSR标记进行品种鉴定。     

基于桤木属转录组测序的SSR分子标记的开发

[目的]基于转录组数据开发适用于桤木属树种的SSR标记,揭示其在转录组序列中的分布类型及特征,为桤木属树种分子标记辅助育种提供有利工具。[方法]利用Micro SAtellite(MISA)软件对所有转录组序列进行SSRs搜索,并对SSR位点的数量、分布特征进行统计分析。设计100对SSR引物,采用琼脂糖凝胶电泳和毛细管电泳分离检测方法对3种不同倍性桤木属植物(12份材料)进行遗传多样性检测,确定引物多态性及通用性。[结果]85 769条Unigenes序列中发现8 678个SSR位点,分布在8 298条Unigenes中发生频率为9.67%,转录组序列中平均每14.04 kb长度就有一个SSR位点分布。其中,二核苷酸重复类型数量最多,占65.87%。根据转录组Unigenes序列,利用Primer 3软件共设计出4 531对符合要求的引物,挑选出的100对SSR引物中,获得18对多态性高、稳定性好的SSR引物。[结论]本研究可扩增出多态性位点的引物重复单元以二、三核苷酸重复为主。基于桤木属转录组序列的SSR标记开发是可行的,开发的引物为桤木属遗传多样性分析、分子育种、遗传图谱构建和功能基因的挖掘提供了丰富的候选分子标记。     

油料植物光皮树SSR-PCR反应体系优化及引物筛选

建立稳定可靠的SSR-PCR反应体系、筛选具有多态性SSR引物,是木本油料植物光皮树分子标记辅助育种与良种选育的重要基础研究。为给SSR标记技术在光皮树遗传图谱构建、亲缘关系鉴定及分子育种等方面的应用研究奠定基础,利用"Cf-05"正反向引物,采用L16(45)正交试验设计和单因素试验相结合的研究方法,对影响光皮树SSR-PCR反应体系的主要因素(模板DNA、引物、d NTPs、Mg~(2+)、Taq聚合酶浓度及退火温度)进行了试验分析。试验结果表明,光皮树SSR-PCR总体积为15μL的最佳反应体系为:模板DNA用量37.5 ng,正反向引物浓度均为0.6μmol·L~(-1),d NTPs浓度为0.3 mmol·L~(-1),Mg~(2+)的浓度为1.5 mmol·L~(-1),Taq聚合酶用量为1.5 U,最佳退火温度为50℃。运用优化了的光皮树SSR-PCR反应体系,可从71对引物中筛选获得11对能适用于光皮树的SSR引物。研究结果表明,试验所建立的反应体系可进一步用于光皮树SSR遗传多样性分析、遗传图谱构建和分子标记辅助育种等方面的研究中。     

松属近缘种形态和分子鉴定及其亲缘关系探讨

松属(油松组)树种是我国重要的造林树种,但其种子和幼苗难以区分。通过比较种子的千粒质量、种子形状、颜色、幼苗子叶数、幼苗下胚轴颜色和苗高,结合ISSR和SSR标记技术,鉴定松属(油松组)11个近缘种,并对其亲缘关系进行探讨。研究结果表明:通过种子和幼苗的形态比较鉴定,可准确鉴定油松和加勒比松;ISSR和SSR标记则可把油松组的11个树种中的10个准确鉴定出来,仅有高山松由于遗传背景的复杂性没有发现种特异性引物(位点)。利用5对SSR引物获得的41个种间多态性位点构建的10个树种的近缘种亲缘关系与传统的研究结果基本一致。系统聚类分析在相似系数0.60处将10个树种分为3个类群:马尾松和赤松聚为第1个类群;云南松、思茅松、高山松、油松聚成一小类,和另一小类即黑松、樟子松聚成第2个类群;第3类群为火炬松和加勒比松,它与前2个类群亲缘关系较远,相似系数仅为0.42。     

磁珠富集法快速制备油茶基因组微卫星标记

利用磁珠富集高效微卫星分离法,设计生物素标记的寡核苷酸（AG）15与（AC）15作为探针,快速分离油茶微卫星序列并建立其SSR分子标记体系。从获得的52份具微卫星序列的克隆测序结果中,成功开发40对油茶SSR引物,序列开发引物成功率在76.9%;对扩增结果进行比较分析后,共得到14对具有清晰扩增条带的SSR引物,占总引物的35%;进一步利用18个油茶无性系开展引物多态性检测,显示6对SSR引物具良好的多态性。研究结果可为油茶遗传学研究提供新的分子标记工具,同时为山茶属其他重要经济树种的相关研究提供很好的借鉴。     

黄藤2个NAC基因的分子特征及其SSR分子标记开发

【目的】棕榈藤是重要的森林植物,纤鞭是其重要的攀援器官,也是重要的分类依据。研究黄藤NAC(NAM,ATAF和CUC)转录因子基因的分子特征并开发SSR分子标记,以期为棕榈藤的分子育种和辅助分类提供参考依据。【方法】以黄藤为材料,借助转录组数据,采用同源克隆的方法从黄藤中分离NAC基因,采用生物信息学方法进行基因结构、蛋白性质与结构分析和SSR位点预测,采用实时定量PCR技术分析基因的组织表达特性,利用PAGE电泳和测序技术分析SSR分子标记在不同棕榈藤样品中的通用性和多态性。【结果】从黄藤叶片中获得了2个NAC同源基因DjNAC3(Gen Bank登录号:KU556738)和DjNAC4(Gen Bank登录号:KX579750),二者的开放阅读框长度分别为729 bp和1 326 bp,对应的基因组序列为850 bp和1 441 bp,均包含2个外显子和1个内含子。DjNAC3和DjNAC4编码的蛋白分别为242 aa和441 aa。蛋白结构分析表明,DjNAC3和DjNAC4具有典型的NAC转录因子结构特征,属于NAC家族的CUC亚家族,但二者之间的相似系数仅为23.6%,表明它们在黄藤生长发育过程中可能具有不同的功能。DjNAC3和DjNAC4在不同组织中的表达模式存在明显差异,DjNAC3在发育成熟纤鞭中的表达丰度最高,叶片中的表达丰度最低,而DjNAC4则在发育成熟的钩刺中表达丰度最高,而发育初期的钩刺中最低。在DjNAC3和DjNAC4的基因组序列中分别包含1个SSR位点,其中前者的SSR位点位于内含子区域,为(TA)6,后者的SSR位点位于第1个外显子区域,为(GCA)5。根据DjNAC3和DjNAC4中SSR位点旁侧序列设计引物,以黄藤和另外20个不同棕榈藤样品的基因组DNA为模板进行扩增,PAGE电泳结果分析表明,引物具有较高的通用性,且扩增产物具有多态性。6个样品的测序结果证实,用DjNAC3设计引物的扩增产物测序获得的SSR位点序列存在着一定的差异,既包括SSR类型变异、重复次数变化等多态性,又有SSR位点缺失的现象;而根据DjNAC4设计引物扩增获得的SSR位点序列差异主要为重复次数的变化。【结论】黄藤DjNAC3和DjNAC4基因的基因结构、表达模式、SSR位点等均存在明显的差异,这表明它们在黄藤生长发育中可能具有不同的功能,二者所包含的SSR分子标记具有通用性和多态性,可以作为分子标记应用于棕榈藤的辅助分类和分子辅助育种。     

利用微卫星标记鉴别油茶品种

为发展可靠的油茶品种遗传真实性鉴定技术,以浙江红花山茶等油茶品种为试材,利用聚丙烯酰胺凝胶电泳对大量油茶SSR引物进行筛选,获得了电泳指纹清晰、基因型容易判定且多态性信息含量高的引物组合10对,提出了详细的用于油茶品种鉴别的试验操作流程。通过针对性的试验实例,验证了所开发引物应用于油茶品种遗传鉴别的有效性。     

分子标记法和形态学特征对杏仁栽培种及野生种基因型的遗传关系构建的辨别

应用23个形态学特征,19个扩增片段长度多态性(AFLP)引物组合,80个随机扩增多态DNA(RAPD)引物和32个简单序列重复(SSR)引物对,比较三种分子标记法在29个杏仁栽培种和3个野生种遗传关系构建中的信息景和效率.根据预期杂合度的评价,与AFLPs和RAPDs相比,SSRs具有较高水平的多态性和较大的信息量.AFLPs预期朵合度值最低,但其辨别效率值最高,因为AFLPs能揭示每个反应中的大量条带,导致各种类型的多样性指数均较高.三种分子标记法对杏仁基因型的辨别效率均较高,只是SSRs无法辨别‘Monagha'和‘Sefied'杏仁基因型.三种分子标记法基因型相似性相关系数统计上显著,但SSR数据要低于RAPDs和AFLPs的值.尽管三种分子标记法树形图拓扑结构存在一些差异,但相似性水平均较高.SSRs、RAPDs和AFLPs的系统树图及其综合数据都能依据地理散布反映大多数栽培种的关系.AMOVA检测到每个地理组中栽培种和野生种的变异.辅助程序分析表明,实验所应用的标记物数量足以保证基因相似性估计的可靠性和标记法间的比较是有意义的.     

基于SSR荧光标记的白蜡核心种质构建

白蜡为中国北方重要的盐碱地造林树种,研究其遗传多样性,进一步构建核心种质,对白蜡优异种质的筛选及开发利用具有重要作用,为广泛开展白蜡种质资源的保存评价、挖掘优异基因资源提供核心材料,同时也为白蜡育种提供优良基因资源。本研究运用SSR标记的方法,选取田间表型性状差异较大的4个白蜡品种华雄、鲁蜡5号、金叶白蜡和金枝白蜡,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳从500对SSR引物中筛选出扩增条带清晰、多态性好、扩增稳定的42对引物。从筛选出的每对引物5′端添加荧光标记后,采用毛细管法通过DNA分析仪检测202个样品不同等位变异的扩增片段,从42对SSR引物中筛选出17对扩增稳定的引物,建立基于高通量荧光SSR标记的白蜡种质鉴定体系。研究了来自全国22个地区的具有代表性的202份白蜡种质资源的遗传多样性,通过R语言包Genetic Subsetter构建出了40份白蜡核心种质。结果表明:选用的17对引物都表现出多态性,共检测出142个等位变异,平均每对引物等位基因数为8.353个;平均有效等位基因数为3.342;平均多态性信息含量为0.635。可见白蜡属植物种间变异较大,具有丰富的遗传多样性。构建了40份白蜡核心种质,占原始种质的20%,t检测表明,所构建的核心种质遗传多样性丰富,其代表的遗传多样性指标与原始种质资源差异不显著,说明获得的核心种质资源能够充分、最大程度地代表原始种质。研究结果为白蜡种质资源的收集、保护、评价及利用提供了宝贵的理论依据和物质基础。利用17对高效引物构建了白蜡属植物SSR高通量鉴定体系,构建的40份白蜡核心种质能够最大程度的代表其遗传多样性。     

运用ISSR标记鉴定宝巾花辐射突变体

采用ISSR分子标记鉴定宝巾花(Bougainvillea spectabilis)辐射突变体,建立了宝巾花的ISSR-PCR反应体系,筛选出适宜的退火温度。结果发现从14条ISSR引物中筛选出7条具有多态性的引物进行PCR扩增,引物UBC880对样品j、k、l扩增出多态位点,片段大小在350 bp左右,其余引物均未扩增出明显的多态位点。由此说明,运用ISSR分子标记可初步鉴定宝巾花表型突变体。     

基于SSR的刺槐无性系遗传多样性分析和指纹图谱构建

【目的】对山东省刺槐无性系进行遗传多样性分析和指纹图谱构建,为刺槐新品种选育、遗传改良和品种鉴定提供可靠的依据,为中国其他省市刺槐遗传资源保存、评价与利用提供参考。【方法】采用荧光SSR引物进行PCR扩增,产物经毛细管电泳仪进行检测;利用所得结果分析49个无性系遗传多样性并构建其指纹图谱;采用非加权组平均法(UPGMA)进行基于亲缘关系的无性系聚类分析。【结果】8对SSR引物共检测到51个等位基因,每个位点的等位基因为2~15个,平均每对引物扩增出6.375个多态性等位基因。不同位点的PIC值变化范围很大,在0.092~0.879之间,平均PIC值为0.509 8。使用组间平均数联结法进行UPGMA聚类分析,结果表明49份无性系没有严格按照不同区域聚类到一起,无性系分组与现有栽培区没有明显的规律。来自临沂的‘鲁刺8’和‘鲁刺13’、青岛的‘鲁刺40’和‘鲁刺42’以及日照的‘鲁刺10’和‘鲁刺86’亲缘关系最近。本研究所使用的9对引物中,其中2对Rply109和rops16可以区分开45份无性系,鉴定率达到91.84%。检测到22个刺槐无性系在1个或者2个位点得到3个等位基因,表明这些无性系可能是发生自然变异的多倍体。【结论】山东省刺槐具有较高的遗传多样性。无性系分组与现有栽培区没有明显的规律。引物Rply109和rops16对49份无性系的分子鉴定率为91.84%,可作为刺槐指纹图谱构建和分子鉴定的高效分子标记。利用SSR标记构建的指纹图谱可为刺槐遗传资源管理、品种鉴定和知识产权保护奠定坚实的基础,同时为刺槐的引种和遗传育种亲本选择提供科学的理论依据。     

97个山杏无性系的遗传多样性及SSR指纹图谱

【目的】山杏是北方半干旱地区重要的生态经济型树种,种质资源异常丰富,形态鉴定与分类难度大。利用SSR分子标记研究山杏优选无性系的遗传多样性并构建指纹图谱,以期为山杏种质鉴定提供科学依据。【方法】根据山杏简化基因组测序结果,合成600对SSR引物,利用4个山杏无性系进行引物筛选,选出155对扩增条带清晰的引物,对97个山杏优选无性系进行PCR扩增。应用引物组合法构建指纹图谱,采用非加权组平均法(UPGMA)进行聚类分析。【结果】利用155对SSR引物对97个山杏无性系进行扩增,共扩增出933个等位基因,每个位点的等位基因数为3~11个,平均为6.019个;各位点的多态性信息含量(PIC)为0.476~0.885,平均值为0.681,具有较高的多态性。50个山杏无性系在59个位点上具有特异等位基因,89个无性系在131个位点上具有特异基因型。采用5对引物(L56、X47H、L79H、P40H和X47)的组合可区分全部97个无性系,构建了指纹图谱。对97个山杏无性系进行亲缘关系分析,无性系间的遗传相似系数变化范围为0.669~0.943,平均值为0.757;基于遗传相似系数进行聚类分析,将97个无性系分为5大类,第1大类和第2大类下又分为3个亚类,分类结果与无性系的来源区域有明显的相关性。【结论】从600对SSR引物中筛选出155对,其扩增位点多态性较高、重复性较好。发现89个山杏无性系具有特异基因型,其中50个既具有特异基因型也具有特异等位基因。应用引物组合法构建了基于5对SSR引物扩增位点的山杏无性系指纹图谱。供试山杏无性系遗传差异较小,亲缘关系较近。研究结果可为山杏种质鉴别提供科学依据,也为山杏的育种工作奠定基础。     

利用RAPD和ISSR分析百日草自交系间的种质遗传多样性

首次运用RAPD与ISSR技术分析了百日草20个自交系的种质遗传多样性.结果表明：从供试材料中147条RAPD引物和44条ISSR引物筛选到具有多态性的RAPD引物12条,ISSR引物9条.RAPD引物共扩增出147条带,多态性位点数为100,多态性位点比率为68.03%,平均多样性指数为0.3559,有效等位基因数为1.4169;ISSR引物共扩增出128条带,多态性位点数为97,多态性位点比率为76.38%,平均多样性指数为0.4013和有效等位基因数为1.4728.试验表明,RAPD、ISSR及两种分子标记整合后的结果较为相似,呈极显著的正相关.聚类结果将20个自交系基本分为2类：一类群来源虹越种子集团公司;另一类群来源甘肃酒泉种子集团公司,分类与原产地相关.RAPD与ISSR标记是研究百日草种质遗传多样性有效的工具,在分析百日草的亲缘关系特别是系谱关系时,ISSR是一种多态性和重复性优于RAPD的分子标记.两种分子标记整合后既能鉴定出自交系的系谱先后关系,也能反应来源相同自交系的亲缘关系.     

杜仲基因组微卫星特征及SSR标记开发

为全面解读杜仲的遗传背景,本研究在基因组测序(数据未公布)的基础上,通过MISA软件搜索杜仲基因组(26 947/854 758 160 bp)中的完整型(1～7核苷酸重复)及复合型SSR序列,共查找出25 694个Scaffolds含有488592个SSR位点,占总Scaffolds的95.3％.从SSR位点分布密度上讲,平均每1 749 bp出现1个微卫星,其中单核苷酸重复单元的SSR含量最多,约占总数的54.34％,其次为二核苷酸(20.47％),而复合模式、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸和七核苷酸重复分别占20.29％、23.89％、0.77％、0.13％、0.10％和0.01％,并发现SSR中均以含A、T的重复类型占主导地位.根据SSR位点设计并合成引物290对,162对SSR引物扩增出清晰的目的条带,其中16对引物多态性高、稳定性好,在8份杜仲资源中共检测到84个等位基因,平均每个SSR位点检测到5.25个等位基因.本研究对于进一步利用SSR分子标记分析杜仲遗传多样性、遗传图谱构建、杜仲雌雄株早期鉴定等具有较高的应用价值.     

黑莓杂交优株的SSR指纹图谱鉴定

运用SSR分子标记技术,对来自相同或不同亲本的6个黑莓潜力杂交组合优株进行了分子鉴定,确定指纹图谱。结果表明,78对SSR引物中共有25对在4个亲本品种中具有多态性。将各自在不同杂交组合亲本中具有多态的引物用于优株鉴别,发现Kiowa×Arapaho组合中的3个优株有12对亲本间呈多态的引物可以鉴别,优株10-2n-1有6对扩增为杂合带型,10-2n-2和10-2n-5均有5对,其余则偏父本或母本一方,且有5对引物可以区分3个优株;来自Chester×Kiowa组合的优株10-5n-2在18对多态引物中多扩增为双亲重组类型,推测其性状可能多介于双亲之间;来自Hull×Kiowa组合的优株10-6n-1-1和10-6n-1在6对多态引物扩增结果中,10-6n-1-1多继承了父本的带型,而10-6n-1扩增多显示为双亲杂合带型。鉴定结果为育种中相同亲本杂交组合黑莓优株区分提供了依据,也一定程度上揭示了黑莓杂交重组中的复杂性和不确定性。     

14个油茶良种遗传多样性的SRAP分析

对14个油茶良种进行SRAP标记(序列相关扩增多态性)的遗传多样性分析。采用改良CTAB法提取的油茶叶片基因组DNA为模板,利用优化的SRAP-PCR反应体系,从16个正向引物和20个反向引物中筛选出条带特异、多态性好、稳定性高的8对引物组合。利用这些引物组合对14个油茶良种扩增出65条清晰可重复的条带,其中22条是多态性条带,多态性条带百分率为33.85%。通过生物学软件对所得数据进行遗传学分析,计算出遗传相似系数,绘制出分子聚类图,为油茶良种的后续分子鉴定及分子育种提供了科学基础。     

基于转录组测序的陈山红心杉EST-SSR开发及应用

【目的】目前杉木分子标记数量无法满足种质资源评价及分子标记辅助育种等相关研究需求,需要开发更多的杉木SSR标记十分重要。【方法】以陈山红心杉转录组测序数据为基础,进行EST-SSR标记的检测和开发,并对陈山红心杉二代种子园进行遗传变异分析。【结果】转录组测序共获得99 122 394个reads片段,包含了14.87 Gb的序列数据。序列组装后,获得76 597个unigene,共计104.18 Mb数据,平均长983 bp。寻找到8 072个SSR位点,单核苷酸和三核苷酸是主要重复类型,分别占总数的66.30%和17.48%,其次是二核苷酸重复类型,占总数的12.31%。AT/TA和AG/TC是主要的双碱基重复序列,分别占总位点数的6.79%和1.93%。AGA/TCT和AAG/TTC是主要的三碱基重复序列,分别占总位点数的1.45%和1.44%。从随机挑选的150对SSR引物中筛选出11对多态性引物。陈山红心杉二代种子园SSR位点间的平均等位基因数为4.4个,有效等位基因为2.4个;群体平均观察杂合度、期望杂合度、Shannon多样性指数分别为0.533 5、0.563 8、1.003 4,表明该种子园遗传多样性较高。陈山红心杉二代种子园无性系间的遗传相似系数在0.240 0～0.977 8之间,平均值为0.589 3,说明这一群体有较宽的遗传基础。在阈值0.62处可将无性系划分为6个亚群体,亚群体内个体数量差异较大。【结论】本研究基于陈山红心杉转录组数据开发出11对EST-SSR标记,丰富了杉木分子标记库,这些标记可用于杉木种质资源评价、遗传多样性分析及分子标记辅助育种等方面。     

毛白杨木材形成功能基因内SSR标记的开发及评价

利用直接测序法开发木材形成功能基因内一套新的核基因组SSR标记.通过对参与木材形成的16个基因在40个毛白杨基因型个体中的序列比较分析,共检测剑20个SSR多态性位点.在毛白杨自然群体中,SSR多态性位点的碱基重复呈现出二碱基、三碱基、五碱基、六碱基与七碱基形式,基元霞复次数变异范围为2～34次,其中以二碱基重复的位点较多,占总数的55.0%.在此基础上,依据SSR位点两侧的保守序列,设计20对SSR位点PCR扩增引物对.利用设计的引物检测开发的SSR位点在杨属内15个基因型个体中PCR扩增的有效性及SSR位点的保守性.PCR扩增结果显示,90.0%的SSR位点能够在杨属至少2个派内有效扩增,每对引物组合可检测到SSR多样性位点数为3～9个,平均5.3个.开发的这些SSR位点在功能基因内小同区域的分布频率不同.