Study on Survival Competitive Ability of Transgenic Cotton Harboring CrylAc＋Cry2Ab Double Bt Genes in Cultivated Field

为建立国家转双价双Bt抗虫基因棉环境安全评价技术,对转双价双Bt基因（Cry1Ac＋Cry2Ab）抗虫棉栽培地生存竞争能力进行研究,结果表明,转双价双Bt基因棉花与对照赣棉11相比,各生育期株高生长具有显著竞争优势,优势值3.48～4.75 cm;吐絮期棉覆盖度竞争优势超对照46.77个百分点,达显著水平;产量竞争力优势籽棉超对照1 013.85 kg/hm2,皮棉超对照433.20 kg/hm2,均未达到显著水平;发芽率竞争优势极显著,超过对照2.75个百分点。与非转基因常规棉相比,转双价双Bt抗虫基因棉生存竞争能力优势显著。     

转双价抗虫基因(Cry1Ac+Cry2Ab棉靶标害虫不防治环境下检测技术和生存竞争能力研究

[目的]为国家转双价抗虫基因(Cry1Ac+Cry2Ab)棉环境安全评价技术的建立提供参考。[方法]在靶标害虫不防治的环境下,以杂交抗虫棉赣棉杂1号(CK1)和非转基因棉赣棉11号(CK2)为对照,对转双价抗虫基因(Cry1Ac+Cry2Ab)棉进行生存竞争能力研究。[结果]转双价双Bt基因抗虫棉与2个对照相比未显示抗虫优势;在株高、覆盖度、果枝层数、单铃壳重方面无显著竞争优势;在单铃籽棉重、单铃皮棉重、衣分率方面表现显著或极显著负竞争优势;在单株成铃、脱落率、籽棉产量方面与CK1相比无显著竞争优势,与CK2相比表现极显著和显著竞争优势;在皮棉产量方面与CK1相比表现极显著负竞争优势,与CK2相比表现极显著竞争优势。[结论]转双价双Bt基因抗虫棉推广种植可行性为一般。该项检测技术和评价方法有较好的适用性。     

转双价抗虫抗除草剂基因棉栽培地生存竞争能力研究

此研究为国家转双价抗虫抗除草剂棉花环境安全评价技术建立而设。结果：转双价抗虫抗除草剂基因棉在吐絮期株高生长竞争优势达显著水平,超对照9.12 cm;吐絮期棉花覆盖度竞争优势达极显著水平,超对照100.5个百分点;产量竞争优势不显著,籽棉超对照66.92 kg/亩,皮棉超对照21.14 kg/亩;发芽率无竞争优势,低于对照0.5个百分点。与非转基因常规棉相比,转双价抗虫抗除草剂基因棉总体上生存竞争能力具有优势。     

2种新的转双价基因棉种子越冬能力研究

以非转基因常规棉赣棉11号为对照,用当年的种子进行年前与年后室内发芽试验,研究转双价抗虫基因(Cry1Ac+Cry2Ab)棉和转双价抗虫抗除草剂基因(Cry1Ac+EPSPS)棉种子的越冬能力,结果表明:室内常温越冬后,转双价抗虫基因(Cry1Ac+Cry2Ab)棉的发芽势及发芽率并未衰减,反而有所增强,分别提高0.75和1.00个百分点,转双价抗虫抗除草剂基因(Cry1Ac+EPSPS)棉的发芽势及发芽率都提高1.00个百分点;而常规棉(CK)的发芽势及发芽率分别衰减2.75和1.00个百分点,这说明转双价抗虫基因棉及转双价抗虫抗除草剂基因棉种子的越冬竞争能力较强。此外,3个供试棉花品种的种子野外越冬均不能发芽和生苗,野外播种无越冬能力。     

转抗虫抗草甘膦除草剂基因(Cry1Ac+EPSPS)棉的检测技术与生存竞争能力研究——基于草甘膦压力和对靶标害虫不防治环境下

此研究为国家转抗虫抗草甘膦除草剂基因(Cry1Ac+EPSPS)棉环境安全评价技术建立而设。在草甘膦压力和对靶标害虫不防治环境下的检测技术,以杂交抗虫棉赣棉杂1号和非转基因棉赣棉11号为2个对照,来检测评价转抗虫抗草甘膦除草剂基因(Cry1Ac+EPSPS)棉的生存竞争能力。结果:转Cry1Ac+EPSPS棉与两个对照相比不显示抗虫优势;株高增长无竞争力;覆盖度有不显著的弱竞争力;单株成铃、单铃籽棉重、单铃皮棉重、衣分率、脱落率、籽棉产量、皮棉产量与赣棉杂1号比呈现显著或极显著的负竞争优势,与赣棉11号比无竞争优势;果枝层数前期与两对照相比有极显著的负竞争优势,后期与赣棉杂1号比无竞争优势,与赣棉11号比有显著的负竞争优势。结论:转Cry1Ac+EPSPS棉推广种植可行性较差。本项检测技术和评价方法有较好的适用性。     

转Bt基因油菜的抗虫性分析

利用农杆菌介导的遗传转化分别将Cry1C和Cry2A的2个单价Bt基因转入油菜(Brassica napus L.),以两个纯合的转基因抗虫油菜为亲本,通过有性杂交的方法将不同Bt基因聚合,培育双价Bt抗虫油菜,并对其抗虫性和种子品质性状进行评价。结果表明,Cry1C、Cry2A在聚合后均能稳定表达,和单价Cry1C转基因植株相比,双价株系中蛋白质含量明显降低,以Cry2A为母本的聚合株系蛋白质含量降低更多,Cry1C在遗传上存在母本效应。室内接种小菜蛾二龄幼虫结果显示,转化单价和双价聚合Bt基因的抗虫性增强,其中转化单价Cry1C的抗虫性优于双价聚合Bt基因和单价Cry2A基因的转基因植株。玻璃温室栽培转基因植株,单价Bt和双价聚合Bt基因的转基因植株能生存而非转基因植株受到严重虫害而死亡。对抗性优良的单价和双价聚合的转基因植株种子品质测定发现,与未受到虫害的受体材料双低优良恢复系7-5的含油量和硫苷含量差异不显著,从而达到抗性改良的目的。     

转双价(Chi+Glu)基因抗病棉栽培地生存竞争能力研究

为研制和制定转基因抗病棉生存竞争能力检测技术和标准而进行田间试验,结果:转入几丁质酶和葡聚糖酶双价抗病基因(Chi+Glu)棉花吐絮期株高超过受体对照9.8 cm,差异极显著;平均单株籽棉增产约50.1 g,单株皮棉增产24.12g;种子的发芽势比对照强8～10.75个百分点,差异显著;发芽率比对照高10～12.5个百分点,差异极显著,显示转入双价抗病基因后棉花在栽培地的生存竞争得到显著提高。     

转双价抗虫抗除草剂基因(Cry1Ac+EPSPS)棉与非转基因棉生物学特性差异的研究

以双价抗虫抗除草剂基因(Cry1Ac+EPSPS)棉为观察品种,非转基因棉赣棉11号为对照品种,进行了棉花生育性状、产量性状等的比较和评价研究。结果表明:与对照品种相比,双价抗虫抗除草剂基因棉在成铃至吐絮期株高增长显著(超速6.6～9.1 cm);在盛铃期之前成铃变缓极显著(少10.7个铃);花铃期至盛铃期果枝层生成慢显著(少1层);果枝角度变大极显著(大2.1°);主茎节距拉长极显著(长0.6 cm);叶色加深显著;衣分率降低极显著(低1.7%);籽指升高极显著(高1.77 g);纤维整齐度指数升高显著(高1.325%);纺纱均匀指数增加显著(增7.5);籽棉、皮棉、霜前籽棉、霜前皮棉均减产极显著。初步评价:双价抗虫抗除草剂基因棉的生育性状、产量性状较差,纤维纺纱性状较好,推广种植性较差。     

4种不同类型棉田昆虫群落结构的比较

在田间小区研究了转双价基因棉(中棉所41号)对昆虫群落结构与组成的影响。结果表明,转双价 基因棉田昆虫群落的结构与转Bt基因棉田和常规棉田无明显差异,但与常规棉常规施药田差异显著;转双价基因 棉田昆虫群落的物种数(50种)与常规棉田(50种)和转Bt基因棉田(53种)无明显差异,但均明显高于常规棉常规 施药田(44种);转双价基因棉田昆虫群落的个体总数和相对丰盛度与其他棉田无明显差异;转双价基因棉和转Bt 基因棉对昆虫群落物种数的时空动态无明显影响,而常规药物防治对棉田物种数的时空动态分布影响较大;棉铃 虫已不是转双价基因棉田和转Bt基因棉田的优势害虫,但仍然是常规棉田和常规棉常规施药田的优势害虫。     

转双Bt基因巨霸杨外源基因表达及抗虫性检测

为提高转基因杨树中Bt基因的表达效率并扩大抗虫谱,以同时转入Cry1Ac和Cry3A基因的转双Bt基因巨霸杨(Populus deltocdes‘55/56’×P.deltocdes‘2KEN8’)株系1年生苗为材料,对外源基因的表达和抗虫性进行检测。经PCR检测,证明目的基因已被整合到巨霸杨基因组中。利用荧光定量PCR和ELISA技术检测了4个转基因株系叶片中Bt基因的转录丰度和毒蛋白表达量。结果表明:不同株系间Bt基因的转录丰度存在显著差异,Cry3A基因的转录丰度显著高于Cry1Ac基因的转录丰度;2种Bt毒蛋白表达量在各株系间存在显著差异,Cry3A毒蛋白质量分数均显著高于Cry1Ac毒蛋白质量分数。各株系对鳞翅目害虫美国白蛾(Hyphantria cunea)幼虫抗虫效果不明显,且无显著差异;对鞘翅目害虫柳蓝叶甲(Plagiodera versicolora)表现出极高抗虫效果,且均显著高于转单基因Cry3A 741杨高抗株系CC84,不同株系间存在显著差异。     

两种转Bt基因棉杀虫蛋白Cry1Ac表达量的检测

用EnvirologixCry1Ab/Cry1Ac平板试剂盒检测了两种转Cry1Ac基因的棉花品系 (NUCOTN33B、NUCOTN99B) 以及常规对照品系 (苏棉 12) 不同生育期主茎嫩叶、侧枝嫩叶、蕾及蕾的苞叶中杀虫蛋白Cry1Ac的含量。结果表明, 两种转Bt基因棉主茎嫩叶杀虫蛋白Cry1Ac的含量随生育期的推移呈明显下降趋势, 花铃期 (NUCOTN33B和NUCOTN99B分别为 4 43和 2 93μg·g-1 ) 和吐絮期 (3 87和 2 86μg·g-1 ) 的含量分别降至苗期第 6叶 (7 64和 8 38μg·g-1 )的 58%、35%和 51%、34%; 相同时期的主茎嫩叶和侧枝嫩叶中Cry1Ac的含量均显著高于蕾及蕾的苞叶, 前两者均为后两者的两倍以上。     

用人工合成多肽作为半抗原制备Bt Cry1Ac的单克隆抗体

为了制备Bt Cry1Ac特异性单克隆抗体(MAB),本试验从NCBI获得了Bt Cry1Ac蛋白的氨基酸序列,根据抗原性、亲水性和表位性分析选定Bt Cry1Ac特异性肽段进行人工合成,并将其偶联于匙孔血蓝蛋白（KLH）免疫动物,应用细胞融合技术制备了抗该肽段的杂交瘤细胞34株。通过ELISA和免疫印迹试验从中筛选出与Bt Cry1Ac天然蛋白产生特异性反应的单克隆抗体杂交瘤细胞株一株（6G9）。ELISA和免疫印迹试验结果显示,该克隆株所分泌的MAB能对合成肽和Bt Cry1Ac产生特异性反应,而与同源的Bt Cry1Aa、Bt Cry1Ab天然蛋白均无交叉反应。通过对转基因棉花的ELISA 检测结果表明,本试验所制备的Bt Cry1Ac单克隆抗体能够有效的区分常规棉和抗虫棉,并且能对其中的Bt Cry1Ac蛋白进行特异性的识别。     

转双价基因棉田昆虫群落的多样性研究

2002-2003年在田间研究了转双价基因(CrylAc CpTI)棉田昆虫群落的多样性,并分析了昆虫群落多样性的时间格局,结果表明,4种类型棉田昆虫群落的多样性指数以双价棉田和Bt棉田最高,其次为常规棉田,常规施药田最低;害虫亚群落多样性指数以双价棉和Bt棉田最高,其次为常规用药田,常规棉田最低;天敌亚群落多样性指数以双价棉田最高,其次为常规棉田和常规用药田,Bt棉田最低,4种类型棉田昆虫群落的多样性时间格局总体变化趋势为5月升高,6月下降,7～9月又有所回升。     

苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白对棉铃虫活性分析

利用已克隆的5种Bt Cry基因Cry2Ab4、Cry1Ia8、Cry1Ie1、Cry1Ca7、Cry1Cb2和1种野生菌株HD-73(Cry1Ac)表达的6种Bt Cry杀虫晶体蛋白,对棉铃虫进行生物活性分析,并将Cry1Ac杀虫晶体蛋白分别与其它5种Cry蛋白按1:1的比例组合,对棉铃虫进行生物活性测定。结果表明,单独使用Cry1Ac时对棉铃虫活性最高,LC50为3.16μg·mL-1,其次为Cry2Ab4。Cry1Ac与Cry2Ab4组合对棉铃虫也有较高的活性,LC50为48.70μg·mL-1,该组合对棉铃虫的共毒系数为1.21,有相加作用。Cry1Ac与这5种蛋白的组合对棉铃虫都有较高的毒力。     

基于三级营养传递Cry1Ac蛋白对普通草蛉酶活力及生长发育的影响

【目的】研究Cry1Ac蛋白通过棉花、棉蚜的传递对普通草蛉酶活性及生长发育的影响,为转Bt基因棉花的安全性评价提供参考和依据。【方法】采用ELISA方法,检测Bt棉、取食Bt棉的棉蚜和捕食棉蚜普通草蛉体内Bt杀虫蛋白含量;通过酶活力测定普通草蛉幼虫取食Bt棉花上棉蚜后其体内的类胰蛋白酶、类胰凝乳蛋白酶和氨肽酶的酶活性;室内生物测定普通草蛉取食Bt棉花上的棉蚜后对其生长发育的影响。【结果】Cry1Ac杀虫蛋白在棉叶中的表达量为788.76 ng/g,远高于棉蚜体内的2.35 ng/g,取食Bt棉花上棉蚜的普通草蛉3龄幼虫体内并未检测到Bt杀虫蛋白;通过三级营养传递的Cry1Ac蛋白对普通草蛉酶活力影响甚微。【结论】棉蚜取食Bt棉花后体内仅能累计微量Cry1Ac蛋白;普通草蛉取食Bt棉花上的棉蚜后,对其体内三种酶活性和生长发育均没有负面影响。     

利用分子标记辅助选择技术培育抗虫水稻品种的研究

Bt基因是从苏云金芽孢杆菌中克隆出的针对鳞翅目害虫的抗虫基因,经过基因工程方法人工改造已经获得Cry1Ab/Ac、Cry1C等抗虫基因。以云南主栽水稻品种楚粳28为受体,以携带Bt抗虫基因的"华恢1号"、"RJ-5"和"T1C-19"分别作为供体,利用分子标记辅助选择(MAS)技术进行回交育种,选育成携带Bt抗虫基因水稻新品系。结合农艺性状表现,获得了云抗虫稻1号、云抗虫稻2号、云抗虫稻3号Bt蛋白高表达的水稻抗虫品系。这些抗虫品系为云南省抗虫水稻的遗传改良和生产应用提供了基因资源和应用基础。