四翅滨藜AcDREB2转录因子编码基因的克隆及其表达

脱水应答元件结合蛋白(DREB)在植物响应盐和干旱胁迫中发挥重要作用.为研究DREB在耐盐碱耐干旱的先锋植物四翅滨藜(Atriplex canescens)中的功能及其应用前景,本研究设计了一对简并引物,通过PCR扩增和RACE法克隆得到四翅滨藜DREB转录因子编码基因AcDREB2.该基因cDNA全长为867 bp,共编码242个氨基酸.序列BLAST比对与同源性分析结果表明,该基因与其他植物的DREB具有较高的同源性.利用RT-PCR方法进行表达模式分析发现,AcDREB2在四翅滨藜叶中高丰度表达,且其表达受NaCl和渗透胁迫处理的快速诱导,表明AcDREB2参与了四翅滨藜的抗逆响应.     

羊草DREB转录因子的系统发育和功能研究

羊草是兼具经济价值和生态价值的重要牧草,具有耐寒、耐旱和耐盐碱的特点。在植物应对非生物胁迫的过程中,DREB转录因子起到关键作用。然而,目前在GenBank的核酸数据库和EST数据库中羊草仅有2条DREB序列,其中只有1个DREB基因的功能得到实验验证。本研究从羊草转录组测序数据中1次挖掘了26条DREB EST。用羊草EST和拟南芥基因组中DREB基因的蛋白序列构建了系统发育树, LcDREB21位于第4类群,是DREB2类转录因子基因。通过RACE,获得了LcDREB21编码区全长(Genbank登入号:JN860437)。荧光定量PCR结果表明,其表达受干旱和高盐诱导。另外,通过酵母单杂交实验证明了LcDREB21具有转录激活功能;通过表达GFP融合蛋白证明其专一性定位在细胞核中。总之,LcDREB21是一个具有转录激活功能和细胞核专一定位能力的转录因子,可能在植物应对干旱和高盐胁迫的过程中起作用。本实验结果丰富了羊草抗逆基因数据库,为植物改良提供了基因资源。     

水分胁迫下四翅滨藜和绵毛优若藜保护酶活性变化

在水分胁迫下.对四翅滨藜Atriplex canescens和绵毛优若藜Ceratoides lanata 2个耐旱牧草叶内的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和丙二醛(MDA)含量进行测定,试验结果表明:随着水分胁迫的增强,四翅滨藜体内的SOD和CAT活性表现为上升趋势,而绵毛优若藜体内的SOD和CAT活性呈现降低趋势;MDA含量在四翅滨藜和绵毛优若藜体内随着水分胁迫的加剧都增加了,但相对而言,四翅滨藜体内的MDA含量相对低于绵毛优若藜.由于四翅滨藜体内的SOD和CAT活性随着时间的推移而升高,使MDA含量远少于绵毛优若藜,从而能更好免遭O2-的伤害,提高了植物体的抗旱机制.在研究期间,四翅滨藜的成活率为98.35%,而绵毛优若藜的成活率仅为61.20%,表明前者的抗旱能力远高于后者.因此,研究结果可为筛选适合西北干旱荒漠地区牧草的引种和繁育工作提供基础依据.     

结缕草ZjCSD基因的克隆及表达分析

铜锌超氧化物歧化酶是植物响应逆境胁迫过程中的关键酶,其含量和活性与植物抗逆性密切相关。本研究以结缕草cDNA为模板,利用同源克隆法,从结缕草转录组数据库中克隆获得了结缕草ZjCSD基因,该基因编码一个含有152个氨基酸的蛋白质。生物信息学分析结果显示:ZjCSD基因编码蛋白为稳定的、亲水的、酸性、非分泌脂溶蛋白,定位于细胞质中,含有CSD蛋白家族特有的保守结构域,具有典型的Cu²⁺和Zn²⁺结合位点;与小米、玉米等禾本科植物具有较高的同源性,进化关系较近。采用实时荧光定量PCR研究该基因在不同组织中、不同胁迫处理下的表达模式,结果表明,ZjCSD基因在根、茎、叶中都有表达,叶中表达量最高;干旱胁迫(30% PEG)、盐胁迫(150 mmol/L NaCl)和Cd²⁺胁迫(200 mg/L Cd²⁺)均能诱导ZjCSD基因表达量上调,Pb²⁺胁迫(1 g/L Pb²⁺)诱导ZjCSD基因表达量下调。故推测结缕草ZjCSD基因在结缕草应对干旱、盐和重金属胁迫的过程中发挥作用。     

结缕草ZjCCS基因的克隆与表达分析

为了解Cu/Zn超氧化物歧化酶分子伴侣基因(CCS)在结缕草逆境胁迫过程中的表达调控机制,以结缕草(Zoysia japonica)盐胁迫条件下的转录组数据为依据,结缕草cDNA为模板,通过RT-PCR法,克隆了924 bp长的结缕草ZjCCS基因的CDS序列。同源性分析显示该基因与谷子(Setaria italica)同源性最高,含有植物CCS蛋白所特有的3个保守结构域。利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术研究该基因在非生物胁迫条件下在结缕草叶片中的表达情况,结果显示,在盐胁迫条件下,ZjCCS基因的表达量呈先上升后下降的趋势,4 h表达量最高,相对于盐胁迫,干旱和重金属胁迫对ZjCCS基因的表达量影响不大,推测ZjCCS基因可能在结缕草响应盐胁迫过程中发挥作用。     

NaCl在四翅滨藜适应渗透胁迫中的作用

泌盐盐生植物四翅滨藜是一种多年生C_4灌木,具有良好的适应盐碱和干旱环境的能力。前期研究发现,通过将过量Na~+转运至叶表面盐囊泡、增加Na~+对渗透势的贡献以提高植株保水能力是四翅滨藜耐盐的主要策略,且100 mmol·L~(-1) NaCl可显著刺激其生长。为进一步探究NaCl是否有助于缓解渗透胁迫对四翅滨藜生长的不利影响,本研究分别用不含和含有100 mmol·L~(-1) NaCl的山梨醇引起的总渗透势为-0.2和-0.5 MPa的1/2 Hoagland营养液处理5周龄四翅滨藜幼苗5 d。结果表明,在渗透胁迫下,NaCl的添加可增加叶片相对含水量、提高净光合速率以及降低叶渗透势(Ψ_s),从而促进四翅滨藜的生长。NaCl的添加还显著增加了茎叶组织及叶盐囊泡中的Na~+积累并提高了Na~+对叶Ψ_s的贡献,且对茎叶组织中K~+含量影响较小。此外,渗透胁迫下,添加一定浓度NaCl显著增加了植株中游离脯氨酸和甜菜碱含量,它们除作为保护剂减轻渗透胁迫损伤外,还参与植株的渗透调节,从而进一步提高四翅滨藜对渗透胁迫的适应性。综上所述,适宜浓度的NaCl的确能够有效缓解渗透胁迫对四翅滨藜生长的不利影响。     

人工改造野生大豆GsDREB2基因对植物耐盐和耐渗透胁迫能力的影响

DREB (dehydration responsive element binding protein)转录因子是一个干旱应答元件的结合蛋白,它能特异结合启动子中含有DRE/CRT顺式元件,激活逆境诱导基因的表达,调控植物对干旱、低温、高盐、高温等胁迫的耐逆性。大量研究表明DREB转录因子在信号传导、作用机理及基因表达方面存在复杂性。为了野生大豆来源GsDREB2基因能更有效地发挥功能,人工突变该基因的负向调节结构域(negative regulatory domain, NRD,140~204),经改造命名为GsDREB2-mNRD。在酵母中比较全长基因(FLDREB2)和GsDREB2-mNRD转录激活和与DRE元件结合的能力,并验证GsDREB2-mNRD核定位情况。分别将FLDREB2和GsDREB2-mNRD转化拟南芥,通过拟南芥幼苗期盐胁迫和渗透胁迫试验,比较GsDREB2-mNRD和FLDREB2在提高植物耐盐和渗透胁迫方面的差异。结果表明,GsDREB2基因内部存在着负向调节结构域(NRD),抑制了GsDREB2转录激活功能和DRE元件结合的特性;经改造的GsDREB2基因依然能定位在细胞核;超量表达GsDREB2-mNRD基因的拟南芥耐盐和渗透胁迫能力明显强于非转基因对照,也高于FLDREB2基因超表达的拟南芥;野生大豆来源的GsDREB2基因NRD结构域的缺失可增强该基因在植物耐盐、渗透胁迫等逆境胁迫下的功能。     

珍稀泌盐植物长叶红砂RtSOD基因的克隆及功能分析

长叶红砂是一种强旱生泌盐盐生植物,对盐渍荒漠环境具有极强的适应性。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)在植物抵御逆境胁迫过程中发挥着重要作用。本研究利用已有长叶红砂转录组数据库中SOD基因的已知序列设计引物,采用PCR方法克隆得到大小为663 bp、编码220个氨基酸的SOD基因的开放阅读框,并将其定名为RtSOD。预测该基因编码蛋白分子量为55.90 kDa,理论等电点5.11。多重序列比对分析结果显示该蛋白属于Cu/Zn SOD家族,与其他植物中SOD蛋白同源性较高。系统进化分析结果显示RtSOD基因与刚毛柽柳的SOD基因亲缘关系较近。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析结果显示NaCl、4 ℃、PEG、H₂O₂及ABA处理均能诱导该基因表达。构建RtSOD真核表达载体,将其转化到拟南芥中,结果发现:盐、干旱胁迫条件下,转RtSOD基因拟南芥的生长状况明显优于野生型,转基因株系抗氧化酶活性(SOD、POD、CAT)和脯氨酸含量较野生型显著升高,H₂O₂及MDA含量较野生型显著降低。qRT-PCR检测发现转基因拟南芥中响应逆境胁迫相关基因的表达量均显著高于野生型。上述结果说明RtSOD基因的过表达可提高转基因植物的抗逆性,进一步说明RtSOD参与长叶红砂对非生物胁迫的响应,是该植物抗氧化系统中的重要元件。     

紫花苜蓿MsUGT87A1基因克隆及其对非生物胁迫的响应分析

尿苷二磷酸(Uridine diphosphate, UDP)糖基转移酶(UDP-glycosyltransferase, UGT)催化植物体内黄酮等次生代谢产物的糖基化反应，在植物抵御逆境胁迫过程中具有重要作用。本研究从紫花苜蓿(Medicago sativa)中克隆UGT家族基因MsUGT87A1,利用生物信息学方法对其蛋白质理化性质、二级结构和亚细胞定位等进行分析，并通过荧光定量PCR分析MsUGT87A1基因的组织表达特异性及对不同非生物胁迫的响应情况。结果表明，MsUGT87A1基因全长1 353 bp,编码450个氨基酸，蛋白质相对分子量为50.98 kDa,理论等电点(pI)为5.78,属于亲水性蛋白，主要定位于细胞质中。系统进化树结果表明紫花苜蓿MsUGT87A1与蒺藜苜蓿、红三叶等豆科植物的UGT87A1同源性较高。MsUGT87A1基因在紫花苜蓿根中表达量最高，对干旱、盐和ABA处理均有响应，初步确定MsUGT87A1基因参与紫花苜蓿应对干旱及盐胁迫响应。该研究为进一步探究MsUGT87A1基因功能奠定基础，为紫花苜蓿抗逆性遗传改良提供理论依据。     

低温对青海扁茎早熟禾活性氧代谢的影响和相关基因表达分析

为研究青海扁茎早熟禾(BJ)在低温胁迫下活性氧积累、抗氧化酶防御与逆境相关基因表达的机制,以WY-2(草地早熟禾‘午夜2号')为对照,对这两种材料低温适应(10/5 ℃) 3 d和冷冻胁迫(-10 ℃) 24 h,测定了O^-·₂产生速率、H₂O₂含量、丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)和谷胱甘肽还原酶(GR)活性及其抗氧化酶相关基因、冷胁迫相关转录因子的相对表达量。结果表明,低温胁迫可引起BJ和WY-2叶片内的O^-·₂产生速率、H₂O₂含量和MDA含量的增加,BJ活性氧的积累程度和MDA含量均低于WY-2;低温胁迫可导致BJ的SOD、APX和GR活性的降低,CAT活性呈先升后降的趋势,但只有APX活性表现为BJ高于WY-2,同时,BJ和WY-2叶片内的Cu/ZnSOD、CAT、APX和GR基因的表达量在低温胁迫后被明显的上调,且BJ抗氧化酶相关基因的相对表达量普遍高于WY-2;BJ叶片内的DREB2是下调表达的,ERF、DREB1、CSP和HSP基因在低温胁迫后均表现出明显的上调表达,且ERF、CSP和HSP的相对表达量高于WY-2。从而得出结论,扁茎早熟禾在低温胁迫时有害物质的积累低于午夜二号,抗氧化酶相关基因表达上调幅度,以及一些与冷胁迫相关转录因子的表达调控均大于午夜二号。这些物质合成和基因表达的差异可能共同导致扁茎早熟禾的高耐冷性。     

NaCl在四翅滨藜适应渗透胁迫中的作用

泌盐盐生植物四翅滨藜是一种多年生C₄灌木,具有良好的适应盐碱和干旱环境的能力。前期研究发现,通过将过量Na⁺转运至叶表面盐囊泡、增加Na⁺对渗透势的贡献以提高植株保水能力是四翅滨藜耐盐的主要策略,且100 mmol·L^-1 NaCl可显著刺激其生长。为进一步探究NaCl是否有助于缓解渗透胁迫对四翅滨藜生长的不利影响,本研究分别用不含和含有100 mmol·L^-1 NaCl的山梨醇引起的总渗透势为-0.2和-0.5 MPa的1/2 Hoagland营养液处理5周龄四翅滨藜幼苗5 d。结果表明,在渗透胁迫下,NaCl的添加可增加叶片相对含水量、提高净光合速率以及降低叶渗透势(Ψ_s),从而促进四翅滨藜的生长。NaCl的添加还显著增加了茎叶组织及叶盐囊泡中的Na⁺积累并提高了Na⁺对叶Ψ_s的贡献,且对茎叶组织中K⁺含量影响较小。此外,渗透胁迫下,添加一定浓度NaCl显著增加了植株中游离脯氨酸和甜菜碱含量,它们除作为保护剂减轻渗透胁迫损伤外,还参与植株的渗透调节,从而进一步提高四翅滨藜对渗透胁迫的适应性。综上所述,适宜浓度的NaCl的确能够有效缓解渗透胁迫对四翅滨藜生长的不利影响。     

转DREB1A/Bar双价基因马铃薯的耐旱性及除草剂抗性分析

在前期获得DREB1A/Bar双价转基因马铃薯的基础上,对转基因植株进行了耐旱性和除草剂抗性分析。耐旱性分析显示,在正常浇水条件下,对照和各转基因马铃薯株系生长状态良好且大致相同,各株系的丙二醛含量、相对电导率和SOD酶活性无显著差异(P0.05)。经过控水10d后,非转基因对照植株叶片明显萎蔫卷曲,而转基因植株仍然保持良好的生长状态;转基因株系的丙二醛含量和相对电导率显著低于非转基因株系(P0.05),而SOD酶活性显著高于非转基因对照(P0.05)。控水18d时,大部分对照植株死亡,死亡率为74.33%;转基因植株只有极少数植株死亡,DR2和DR5的死亡率分别为20.43%和5.65%。用0.3%的市售草铵膦喷施各株系,10d后,对照植株全部枯死,转基因株系的个别叶片干枯,绝大多数叶片及所有茎秆生长状态良好。以上分析表明,DREB1A和Bar基因的导入,明显增强了转基因马铃薯对干旱和除草剂的抗性。     

紫花苜蓿MsMBF 1c基因在拟南芥中 表达提高转基因植株的耐热性

高温能危害植物的生长发育,是限制紫花苜蓿在南方地区推广的主要非生物胁迫因素之一。从“中苜1号”紫花苜蓿品种克隆获得紫花苜蓿多桥蛋白1c(Medicago sativa Multi protein Bridging Factors 1c, MsMBF1c)全长编码序列,发现紫花苜蓿MsMBF1c蛋白与拟南芥AtMBF1c蛋白同源相似性高达72%。分析MsMBF1c在根、茎、叶、花和果实等不同组织中,以及在高温、干旱以及高温和干旱组合胁迫条件下的表达模式,发现该基因在不同组织中的表达强度依次为花>根>叶>茎>果实;MsMBF1c显著受高温、干旱以及高温和干旱组合诱导,分别被上调4.21、2.15和4.59倍。构建pBI121-35S: MsMBF1c过量表达载体并转入模式植物拟南芥(wild type, WT),在T₃代获得卡那抗性不分离的过量表达株系(over expression, OE);利用OE与Atmbf1c突变体(mutant, MUT)杂交的方法获得互补株系(complementary, COM),并通过PCR与qRT-PCR的方法进行分子和表达验证。平行比较OE、COM、MUT以及WT等不同拟南芥株系在高温胁迫后的种子发芽率和幼苗存活率,在正常情况下,OE、COM、MUT以及WT拟南芥株系种子的发芽率没有显著差异(97.6%~100.0%),高温胁迫后,WT发芽率下降到71.7%,MUT发芽率下降到66.0%,显著低于WT(P<0.05);而COM与3个独立的OE株系的发芽率达79.3%~87.0%,显著高于WT(P<0.05)。在幼苗耐热试验中,OE、COM、MUT以及WT株系的存活率在正常条件下差异不显著,高温胁迫后,WT幼苗存活率下降到16.7%,MUT下降到10.0%,显著低于WT(P<0.05);而COM与3个独立的OE株系存活率下降到40.0%~76.7%,显著高于WT(P<0.05)。利用real-time PCR方法,分析HSFA1a、HSFA2、HSFA3、HSFB1、WRKY25、WRKY18、DREB2a等耐热调节关键基因在OE、MUT和WT拟南芥株系的相对表达情况,在正常条件下,HSFA2、WRKY18与DREB2a在MUT株系中的表达显著低于WT(0.33~0.47)。而在OE株系中,除HSFA1a外,HSFA2、HSFA3、HSFB1、WRKY25、WRKY18、DREB2a的表达相对WT株系都有不同程度上调,幅度为1.74~3.80。高温胁迫后,与WT相比,HSFA2、HSFA3、HSFB1、WRKY18与DREB2a在MUT株系中的表达中被显著下调,在OE株系中,只有WRKY18显著高于WT外,其余基因的表达在OE与WT株系中差异不显著。综合分析,MsMBF1c是一个功能比较保守的耐热调节基因,过量表达MsMBF1c能够互补拟南芥mbf1c突变体耐热缺失表型,并能够增强拟南芥在种子萌发与幼苗生长阶段的耐热性。MsMBF1c可能与AtMBF1c一样,与其他耐热调节关键基因互作调节植物耐热性。     

NaCl、PEG双重胁迫下转DREB1A基因多年生黑麦草T1代萌发期抗性研究

对转DREB1A基因多年生黑麦草(Lolium perenne)T1代种子和多年生黑麦草非转化植株F1代种子分别用1.5%NaCl溶液、15%PEG溶液、1.5%NaCl+15%PEG进行处理。测定了相对发芽势、相对发芽率、胚芽长、胚根长、细胞膜透性、相对含水量、叶绿素含量、萎蔫幼苗数、存活率等指标,研究了供试材料对单独胁迫和双重胁迫的抗性,并进行对比。相对发芽势、相对发芽率、胚芽长、细胞膜透性、叶绿素含量等指标的测定结果显示,DREB1A对三种胁迫的抗性强度依次为NaCl>PEG>NaCl+PEG。叶片相对含水量、存活率等指标的测定结果表明DREB1A对三种胁迫的抗性强度依次为PEG>NaCl>NaCl+PEG。萎蔫幼苗株数的测定结果显示,DREB1A对三种胁迫的抗性强度依次为NaCl>NaCl+PEG>PEG。胚根长在三种胁迫下的响应差异不显著。DREB1A对NaCl、PEG单独胁迫和NaCl+PEG双重胁迫均具有一定程度抗性,比非转化植株的抗性明显增强。转DREB1A基因多年生黑麦草T1代种子可以作为干旱、盐碱地区改良和利用的植物资源。     

不同刈割频率对四翅滨藜当年生产性能的影响

进行了四翅滨藜全年刈割1次、2次、3次和4次饲草生产对比试验。结果表明,四翅滨藜年刈割2次、3次可以获得较高的鲜草产量,单株鲜草产量分别为2713.2和2458.7g,年刈割2次鲜草产量是年刈割1次、4次的2.3倍和1.5倍。年刈割2次、3次的干草产量也较高,尤其以年刈割2次最高,单株干草产量可达1148.5g。随着刈割频率的增加,鲜干比不断上升,为年刈割4次>年刈割3次>年刈割2次>年刈割1次。