MSTN及FGF5基因编辑不改变绒山羊母羊同期发情能力

基因编辑动物是研究动物生产性状及基因功能的良好载体,目前关于各类基因编辑动物的研究广泛开展。然而,基因编辑动物繁殖性能方面是否与野生型个体具有明显差异则尚未见报道。本研究拟通过比较野生型绒山羊与MSTN、FGF5基因编辑绒山羊对同期发情处理的响应差异,确定其与野生型绒山羊同期发情效率的差异。以野生型和MSTN、FGF5基因编辑陕北白绒山羊为研究对象,在繁殖季节采用同种处理方式(CIDR + PG)对试验羊只进行处理,研究两类羊只在繁殖季节同期发情效率的差异。结果表明,野生型绒处理后同期发情率为100%,基因编辑绒山羊处理后同期发情率也为100%,两组无差异;比较MSTN和FGF5基因编辑的羊只在处理后同期发情效率的差异,发现两组无差异,与野生型绒山羊相比同样无差异。本研究结果证实了MSTN及FGF5基因编辑后不影响母羊的繁殖性能,为基因编辑动物的推广应用提供了试验基础。     

基于CRISPR/Cas9技术的水稻温敏不育基因tms5突变体的构建

为创新优良温敏不育系, 促进两系杂交稻育种的发展, 我们以水稻温敏不育基因TMS5为编辑对象, 设计了由水稻U3启动子驱动、长20 bp的guide RNA (gRNA)靶点以靶向编辑 TMS5 基因的第1个外显子, 将靶点与表达载体pCAMBIA1301连接, 再用农杆菌介导法获得水稻转基因株系。提取T₀代转基因株系的基因组DNA, 并对TMS5编辑位点附近的DNA片段进行PCR检测及测序分析。结果表明, T₀代植株的突变率为63.89%, 其中纯合缺失突变率为34.78%。对T₁代纯合缺失突变体的不育起点温度和农艺性状调查分析结果表明, 28℃是tms5突变体花粉育性的转换温度。大田试验结果表明, 与野生型相比, tms5突变体的结实率和单株重均显著降低。粳稻tms5突变体的获得为培育粳稻不育系奠定了材料基础。     

利用CRISPR/Cas9基因编辑系统创制新型水稻温敏雄性核不育系

为迅速获得优良的温敏雄性核不育(TGMS)系,本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑系统对一份优良的水稻品系GXU41的TMS5基因上2个靶点进行编辑,对编辑植株进行靶点突变检测,筛选无外源DNA的编辑TGMS系,并进行育性转换、农艺性状和米质分析评价。结果共获得12株T0代转基因阳性植株,其中靶点1和靶点2的纯合突变率分别为50%和58.4%,一个或两个靶点为纯合突变占83.3%,双纯合突变率达到25%,在T1代中筛选到无外源DNA的TGMS系。与野生型相比,编辑获得的TGMS系GXU41-5S随着温度升高小穗育性和花粉育性逐渐降低,在24℃时均表现完全不育;由于不育效应,GXU41-5S的株高增长和有效穗数增加显著,且GXU41-5S全部米质指标达到优质一等大米的标准要求。本研究证明了CRISPR/Cas9基因编辑系统是快速获得TGMS系有效途径,所创制的TGMS系对选育两系杂交水稻品种具有重要应用价值。     

新品种绿珍8072和白香占的抗白叶枯病遗传分析及其基因检测

白叶枯病(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)是水稻最严重的细菌性病害,抗病品种的培育利用是控制该病最经济有效的措施。本研究对新选育的抗白叶枯病品种绿珍8072和白香占抗性基因鉴定及遗传分析,以供生产应用参考。以绿珍8072和感病籼稻品种金刚30杂交,对亲本、F1和F2代接种广东白叶枯病强致病性菌系V型菌GD6027进行表型抗性鉴定,并利用与Xa7紧密连锁的微卫星标记对亲本和F2代个体进行了多态性和连锁分析,确定绿珍8072含有Xa7等位抗性基因并独立遗传;用同样的方法鉴定了白香占的抗性基因及其遗传方式,结果表明,白香占抗白叶枯病基因与xa5基因相关,但其F2代抗感病表现型和基因型分离比,不符合孟德尔隐性单基因遗传抗感(1:3)的分离比定律,存在偏分离现象。     

利用CRISPR/Cas9敲除NbLFY基因延迟本氏烟开花时间

开花是植物从营养生长转向生殖生长的重要标志,过早开花会造成植物早衰,严重影响以营养体为产品器官的经济作物的产量和品质,因此研究植物开花基因并对其进行编辑以延迟开花时间具有重要的理论意义和应用价值。LFY基因可抑制叶原基生长并促进花分生组织及花器官形成,是调控植物开花的关键“分子开关”。为利用LFY基因延迟易早花植物的开花时间,本研究以本氏烟为试验材料,构建了NbLFY基因的CRISPR/Cas9敲除载体,利用农杆菌介导法转化叶盘并对编辑植株的表型进行了观察分析。结果表明,通过抗性筛选和PCR检测共获得了10株T₀代植株,靶位点测序分析发现其中有2株NbLFY基因发生了突变,编辑效率为20%,突变类型均为缺失了一个碱基(T)而造成了移码突变。对T₁代基因编辑植株进行表型性状观察发现,与野生型相比,基因编辑植株株高显著降低,现蕾期延迟20 d,第一花序节位也明显提高,表明NbLFY基因的突变导致本氏烟开花时间延后,生殖生长进程延迟。本研究结果证实了NbLFY基因可促进本氏烟开花,敲除该基因可以推迟开花时间。上述研究结果为其他经济作物利用LFY基因...     

CRISPR/Cas9技术在获取双突变体材料中的应用

为了研究含双MATH结构域基因sb3 与sb6 的功能,需要创制这2 个紧密连锁基因的双突变体。利用CRISPR/Cas9 基因编辑技术对拟南芥Col-0 中的sb3、sb6 基因进行特异性定点双敲除。通过PCR和Singer 测序验证,共获得10 株T0代转基因植株,其中5 株在目标片段上没有发生编辑;另5 株在sb3 基因上的目标序列都发生了编辑,在sb6 基因的目标序列上只有2 株发生了编辑。至此成功获得了sb3 与sb6 基因双敲除的突变体,且获得该突变的类型为核苷酸缺失突变体。这个双突变体的获得为进一步研究双MATH结构域基因在拟南芥中的功能奠定了良好的基础     

聚合R基因Pigm和非R基因bsr-d1改良水稻稻瘟病抗性

综合利用CRISPR/Cas9基因编辑技术和基因芯片技术,聚合主效R基因Pigm和非R基因bsr-d1,以改良优良食味水稻品种水晶3号的稻瘟病抗性。首先利用CRISPR/Cas9基因编辑系统,以Bsr-d1为靶基因构建重组表达载体并通过农杆菌介导法转化水晶3号,筛选获得无T-DNA元件的bsr-d1纯合突变体,包括T插入、G插入、GA缺失、CGCA缺失和CGCAGA缺失5种突变类型。以无T-DNA成分的bsr-d1纯合突变体为母本、以携带Pigm基因的金玉1号为父本杂交、回交、自交,并利用分子育种芯片同时进行Pigm基因和背景辅助选择,最终获得抗病基因(同时携带bsr-d1和Pigm基因)纯合,且背景回复率均在96%以上的水晶3号改良株系(SJ3-G1、SJ3-G2、SJ3-G3、SJ3-G4、SJ3-G5)。稻瘟病抗性鉴定结果表明,各改良株系对稻瘟病生理小种GUY11的叶瘟抗性与野生型相比均显著提高;接种稻瘟病菌后,改良株系叶片中POD活性显著低于野生型对照,H₂O₂含量则显著高于野生型对照。通过CRISPR/Cas9基因编辑技术结合基因芯...     

‘异株’荨麻组织培养技术体系的建立

‘异株’荨麻是一种一年生或多年生的草本植物,既有食用价值,也具药用价值,研究‘异株’荨麻组织培养快繁技术体系很有意义。本研究以‘异株’荨麻的嫩梢茎段为外植体,采用次氯酸钠配合乙醇灭菌技术对异株荨麻的嫩梢茎段进行灭菌,在对异株荨麻外植体的初代培养、增殖培养和生根培养条件进行研究的基础上,建立了‘异株’荨麻快速繁殖的组织培养技术体系。该体系为:2%次氯酸钠5 min+75%乙醇0.5 min为最适灭菌方法;最适初代培养基为MS+0.25 mg/L 6-BA+0.25 mg/L IBA+0.25 mg/L KT+0.25 mg/L反-ZT+0.7%琼脂+3%蔗糖;最适继代增殖培养基为2/3MS+0.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA+0.25 mg/L反-ZT+0.7%琼脂+3%蔗糖;最适生根培养基为MS+0.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+0.7%琼脂+3%蔗糖。     

CRISPR/Cas9技术在获取拟南芥双突变体材料中的应用

为了研究含双MATH结构域基因sb3与sb6的功能,需要创制这2个紧密连锁基因的双突变体。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对拟南芥Col-0中的sb3、sb6基因进行特异性定点双敲除。通过PCR和Singer测序验证,共获得10株T0代转基因植株,其中5株在目标片段上没有发生编辑;另5株在sb3基因上的目标序列都发生了编辑,在sb6基因的目标序列上只有2株发生了编辑。至此成功获得了sb3与sb6基因双敲除的突变体,且获得该突变的类型为核苷酸缺失突变体。这个双突变体的获得为进一步研究双MATH结构域基因在拟南芥中的功能奠定了良好的基础。     

转CrylAc/CpTI栽培稻外源基因渗入普通野生稻中可稳定的遗传和表达

转基因水稻的研发以及环境释放,外源基因通过花粉逃逸到野生近缘种中,可能带来的生态效应愈来愈受到人们的关注.本研究采用人工杂交技术将CrylAc/CpTI双价抗虫基因从转基因栽培稻渗入普通野生稻(Oryza rufipogon Griff.)中,获得普通野生稻F1及分离后代F2、F3、F4、F5和回交后代BC1F1和BC...     

山羊FGF5基因单核苷酸多态性群体遗传学分析

为了研究成纤维细胞生长因子5(FGF5)基因在山羊被毛生长中的的作用,进一步寻找与山羊被毛生长相关的遗传标记,为山羊绒毛性状的标记辅助选择和育种提供一定的理论依据,根据人和小鼠成纤维细胞生长因子5(FGF5)基因的同源序列设计引物对山羊基因组进行PCR扩增,将扩增片段进行克隆和测序,并与人和小鼠的成纤维细胞生长因子5基因序列进行同源性比较,确定扩增的片断为山羊的FGF5基因片断。采用PCR-SSCP技术分析了FGF5基因外显子在内蒙古绒山羊、辽宁绒山羊和文登奶山羊品种的多态性,结果表明:FGF5基因在P1和P2引物扩增片段中存在PCR-SSCP多态性,而在P3和P4中没有发现多态。经克隆测序分析,位于外显子1的引物1内存在A→G突变;引物2中发生了碱基序列C→T的突变,这2个突变位点均没有引起编码氨基酸的改变,属于同义突变。对不同山羊品种的基因型和基因频率统计结果表明,引物1中内蒙古绒山羊、辽宁绒山羊、文登奶山羊均以等位基因B为主,且不同群体均处于Hardy-Weinberg平衡;引物2中内蒙古绒山羊、辽宁绒山羊均以等位基因E为主,而文登奶山羊的基因型频率与其他品种有显著差异;内蒙古绒山羊、辽宁绒山羊在引物2位点的基因频率处于Hardy-Weinberg不平衡状态,而文登奶山羊的基因频率处于Hardy-Weinberg平衡状态。     

不同发育阶段绒山羊皮肤中FGF5基因mRNA表达的RT-PCR检测

为深入研究成纤维细胞生长因子5对毛囊生长发育的生物学功能提供理论依据。在10月左右和1月左右,即皮肤毛囊处于生长旺期和退行期时采集了12只内蒙古阿尔巴斯白绒山羊皮样,利用TRIZOL试剂盒提取皮肤总RNA(一步法),利用RT-PCR方法检测FGF5基因在绒山羊绒毛周期性生长不同阶段皮肤中的表达分布情况,试验结果表明,FGF5基因mRNA在绒山羊毛囊生长旺期和退行期均有表达,却只得到了一种剪切形式的表达,经测序是长片段,而缺失外显子2的短片段形式没有检测到。     

内蒙古白绒山羊催乳素及其受体基因多态性与产绒性状的关联性分析

该研究以内蒙古阿尔巴斯型白绒山羊为研究对象,选择绒山羊催乳素(PRL)及其受体(PRLR)基因部分序列作为候选基因,采用PCR-SSCP分子标记技术和DNA测序技术研究其多态性,然后运用最小二乘方差分析方法,对各基因型间生产性状指标进行差异显著性检验,分析绒山羊PRL、PRLR基因的SNP与绒山羊产绒性状的关系,寻找可用于辅助选择的分子标记。结果表明:PRL基因P1和PRLR基因P3引物位点存在SSCP多态,在PRL基因Exon 5区域存在X76049:g.576 bp C-A突变,该突变导致第176个密码子CCC变成ACC,从而使脯氨酸变成苏氨酸(Pro-Thr)。方差分析表明,该位点多态与绒厚度存在极显著相关(P<0.01),CA基因型羊绒厚度比CC基因型长0.674cm;在PRLR基因Exon 10区域存在HQ266606:g.1076 bp T-C突变,该突变导致第359个密码子CTT变成CCT,从而使亮氨酸变成脯氨酸(Lue-Pro),该位点多态对绒山羊羊绒细度有显著影响(P<0.05),AA基因型羊绒细度比BB基因型细0.38μm。因此,在绒山羊羊绒厚度性状上,P1-CA基因型可以作为标记基因型;在羊绒细度性状上,P3-AA基因型可以作为标记基因型,作为绒山羊产绒性状的辅助选择分子标记位点。     

云上黑山羊体重与成年性状的典型相关分析

为了探讨云上黑山羊体重与成年性状间的相互关系,基于98只云上黑山羊母羊的体重记录和成年性状数据,利用R语言对体重和成年性状共11个变量进行简单相关分析和典型相关分析。简单相关分析结果表明,除18月龄校正体重和12月龄校正体重外,相邻体重之间极显著相关(0.30<r<0.42,P<0.01);18月龄校正体重与成年性状（除体高外）之间为极显著相关(0.39<r<0.76,P<0.01);胸围、管围、背膘厚和眼肌面积之间达到显著相关(0.24<r<0.76,P<0.05)。典型相关分析结果显示,体重与成年性状之间的相关性主要是由18月龄校正体重和胸围引起的。以上提示,胸围是影响云上黑山羊体重的主要成年性状,可作为重点选育指标。     

山羊GH基因5′侧翼序列多态及生物信息学分析

本试验采用PCR-SSCP方法,分析了黄淮山羊、长江三角洲白山羊以及波尔山羊168只个体GH基因5′侧翼区两个位点的遗传多态性,同时分析了三个群体是否为平衡群体。结果如下：在GH基因的两个位点上均发现了多态性,其中第1对引物出现6种基因型,存在2处突变;第2对引物出现3种基因型,存在3处突变。群体分析表明,第1个位点三个群体都处于非平衡状态,说明该位点有经过人工选择的可能;而第2个位点三个群体则都处于平衡状态。进一步利用生物信息学软件分析GH基因的5′侧翼序列,发现在其多态位点处存在IA-1、PIT-1、Gsh-2、C/EBP等多个分值较高的转录因子结合位点,其中264位T→C的突变导致PIT-1和Gsh-2结合位点的消失,至于这些位点是否会影响到GH基因的表达,进而影响到山羊个体的生长发育还需作进一步的研究。     

不同补饲水平对努比亚母羊体况及繁殖性能的影响

选择12月龄努比亚羊75只集中配种,配种后将母羊分随机分为3组,分别补饲复合预混料+尿素、浓缩料和精料补充料,在配种时、妊娠100d、妊娠150d进行体重、体况、体尺测量,同时记录母羊产羔数。结果表明：补饲精料补充料的母羊体重、增重和胸围均大于补饲浓缩料组和补饲尿素组,三组之间存在明显差异（P<0.05或P<0.01）。产羔数与母羊体况BCS和体况指数BCI密切相关,产0只羔羊母羊BCS和BCI在整个试验期间几乎没有变化,产1～3只羔的母羊BCS和BCI整个妊娠期都处于上升趋势。三组母羊产羔数分别为1.00±0.76、1.44±0.51、1.83±0.49只,羔羊出生重分别为2.25±0.18、2.51±0.37、2.64±0.40kg,组间差异显著（P<0.05或P<0.01）。母羊妊娠期体BCS和BCI变化情况一致,三组间存在显著差异（P<0.05或P<0.01）。妊娠150d母羊的体况BCS和体况指数BCI与产羔数显著相关,产羔数 =-0.4177BCS2+3.727BCS–4.9185（R2=0.9984）,产羔数=-0.0018BCI2+0.2795BCI-7.2278（R2=0.9985）。     

Wheat spike fertility: inheritance and relationship with spike yield components in early generations

In wheat, grain number is considered as the product of spike dry weight (SDW) and the number of grains per unit of SDW, that is an indicator of spike fertility (SF). The aim of this study was to determine the heritability of SF and the effect of early selection for high SF on its relationship with other spike yield components. Two field experiments were conducted in the south‐eastern Pampas (Argentina) with 400 F₂ and F_2:3 families obtained from two crosses between varieties with contrasting SF (PIG/SSN and B10/KCJ). Heritability estimates in PIG/SSN and B10/KCJ were, respectively, 0.60 and 0.51 by variance component analysis, 0.43 and 0.43 by F₂ : F₃ parent–offspring regression and 0.30 and 0.28 by realized heritability analysis. The existence of transgressive segregation (i.e. the occurrence of families with SF values that were more extreme than those of the parents) was observed. The top 25% F₃ families with the highest SF had 12% more grains per spike, despite a 13% and 5% decrease in SDW per spike and weight per grain, respectively, than the remaining families. These results give support to the application of early selection for high SF.     

21种不同类型葡萄种质资源遗传多样性的SSR分析

本研究通过SSR标记解析不同类型葡萄种质遗传多样性差异和亲缘关系,为资源分类与品种鉴定提供理论依据。利用15对SSR引物对21种不同类型葡萄种质进行PCR扩增,对扩增情况、遗传距离与亲缘关系等进行分析。15对SSR引物共扩增出等位基因位点91个,其中多态性位点89个,多态性比率高达97.8%,其中13对引物扩增多态性百分率达到100%。21份供试材料间遗传相似系数变化范围在0.45~0.91之间,并在遗传相似系数0.62处被分为2个类群。研究表明SSR标记从分子水平上解析了不同类型葡萄种质的遗传差异性,揭示了材料间亲缘关系,为育种研究提供了一定参考依据。     

Expression of a lipoxygenase encoding gene (BoLOX1) during postharvest senescence of broccoli

Lipoxygenases (LOX) belong to a large family of plant enzymes that catalyze the hydroperoxidation of polyunsaturated fatty acids. Most of them are expressed during senescence and contribute to membrane deterioration and biosynthesis of jasmonic acid, a known senescence enhancer. In this work, we cloned a fragment of a gene encoding a LOX from broccoli (BoLOX1). The analysis of the sequence revealed that BoLOX1 is closely related to other LOX from higher plants. Furthermore, we analyzed the expression of BoLOX1 and detected a larger increase during postharvest senescence. A slight increase of total lipoxygenase activity was also found during senescence. In other sets of experiments, broccoli heads were treated with plant hormones, such as cytokinin and ethylene, as a way to assess the effect of such compounds on the expression of BoLOX1. Cytokinin treatment delayed the increase of BoLOX1 expression and lipoxygenase activity whereas ethylene accelerated both processes. Also, several postharvest treatments were applied in order to delay senescence in broccoli florets and to evaluate their effects on BoLOX1 expression. Samples treated with modified atmosphere, hot air, UV-C or white light showed a delay in chlorophyll degradation and degreening. In most cases, the treatments also delayed the increase of BoLOX1 expression, reaffirming the relationship between the expression of this gene and senescence. However, treatments like modified atmospheres and visible light markedly increased lipoxygenase activity, which suggests a lack of correlation between BoLOX1 expression and lipoxygenase activity.