柑橘黄龙病菌在染病贡柑枝条和果实橘络内的分布规律

 柑橘黄龙病是柑橘生产上最具毁灭性的病害之一,由目前还无法分离培养的候选韧皮部杆菌亚洲种(“Candidatus Liberibacter asiaticus”, CLas)引起的。早期研究表明CLas在染病柑橘植株内的分布并不均匀。为进一步探究CLas在染病枝条及果实内的空间分布规律,本研究以感染黄龙病的贡柑(带果实)枝条为材料,利用定量PCR(quantitative PCR, qPCR)分析同一枝条不同部位及果实橘络中的CLas浓度。结果表明,带果贡柑枝条不同部位的CLas分布不均匀且以果实橘络部位的CLas浓度最高(15 487.6 CLas cells/ng总DNA)。通过对同一橘络不同片段长度(每1.5 cm)中的CLas进行定量分析发现,同一橘络中的CLas同样呈不均匀分布(CLas个数范围:12 407~10 271 089)。此外,定量分析发现黄龙病引起的畸形果大小两侧橘络中的CLas浓度差异不显著。该结果可为探究CLas在柑橘枝条及果实中的转运规律提供参考。     

柑橘黄龙病菌在染病贡柑枝条和果实橘络内的分布规律

 柑橘黄龙病是柑橘生产上最具毁灭性的病害之一,由目前还无法分离培养的候选韧皮部杆菌亚洲种(“Candidatus Liberibacter asiaticus”, CLas)引起的。早期研究表明CLas在染病柑橘植株内的分布并不均匀。为进一步探究CLas在染病枝条及果实内的空间分布规律,本研究以感染黄龙病的贡柑(带果实)枝条为材料,利用定量PCR(quantitative PCR, qPCR)分析同一枝条不同部位及果实橘络中的CLas浓度。结果表明,带果贡柑枝条不同部位的CLas分布不均匀且以果实橘络部位的CLas浓度最高(15 487.6 CLas cells/ng总DNA)。通过对同一橘络不同片段长度(每1.5 cm)中的CLas进行定量分析发现,同一橘络中的CLas同样呈不均匀分布(CLas个数范围:12 407~10 271 089)。此外,定量分析发现黄龙病引起的畸形果大小两侧橘络中的CLas浓度差异不显著。该结果可为探究CLas在柑橘枝条及果实中的转运规律提供参考。     

柑橘黄龙病菌亚洲种分子检测引物评价及绝对定量PCR体系优化

柑橘黄龙病是对柑橘产业最具毁灭性的病害, 目前没有可用的有效药剂和抗病品种, 分子检测对黄龙病有效防控至关重要。本研究对国内外常用的常规PCR和巢式PCR检测引物进行评价, 针对多拷贝的nrdB和16S rDNA基因, 构建质粒标准品并筛选适用于绝对定量PCR的最佳质粒。结果表明, 使用Es Taq MasterMix对感染 Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas)的柑橘样品进行常规PCR检测时, 在评价的16对引物中, OI1/OI2c、Las606/LSS和HLBF468/R877灵敏度最高, 推荐同时使用检测黄龙病菌含量低的样品;各组巢式PCR检测引物有其适用扩增体系, 部分引物用Es Taq MasterMix扩增时出现非特异性扩增, F1/B1→F3/B3则适用Es Taq MasterMix体系, 且最高可稳定特异检出105倍稀释感染CLas柑橘总DNA样品（2×10-3 ng/μL）, 是灵敏度最高的引物组, OI1/OI2c→S3/S4在Es Taq MasterMix和Ex Taq DNA聚合酶体系中均可稳定特异检出104倍稀释感染CLas柑橘总DNA样品（2×10-2 ng/μL）, 是适用扩增体系最广的引物组;构建的5个绝对定量PCR质粒标准品中, pnrdB83扩增效率最接近100%, 且在2次重复试验中波动最小, 稳定性最强, 并且作为标准品对黄龙病待测样品进行绝对定量时, 各样品在2次重复试验中的拷贝数差值最小, 是本研究筛选的最佳质粒。本研究的结果将为柑橘黄龙病菌的定性和定量分子检测提供参考。     

黄龙病菌和植原体在长春花体内的移动、增殖以及相关症状研究

 由“Candidatus Liberibacter asiaticus”(CLas)引起的柑橘黄龙病是我国柑橘生产上最严重的病害之一。有研究发现,感染柑橘黄龙病的甜橙植株内可以同时检测到CLas和相关植原体(“Candidatus Phytoplasma asteri”,CPa),但二者关系尚不清楚。本研究利用长春花为实验材料,采用不同嫁接组合探究CLas与CPa的互作关系。研究结果表明:CPa单独接种长春花造成花变叶和节间缩短症状,但不会致长春花死亡;CLas单独接种长春花产生叶片斑驳症状,接种后2个月长春花死亡。CLas和CPa同时接种长春花,出现斑驳伴随花变叶症状,长春花约3个月后死亡,相比CLas单独接种,长春花的存活时间更长。研究结果还表明CLas在长春花植株内的转移速率较CPa快,但增殖速率较CPa慢。本研究通过人工接种CLas和CPa,分析2种接种体在长春花植株上的症状表现,以期为研究CLas与CPa在长春花上的症状表现差异及其互作关系提供理论依据。     

基于原噬菌体类型的我国柑橘黄龙病菌种群遗传结构分析

 柑橘黄龙病是柑橘生产上最严重的病害之一,由难培养的候选韧皮部杆菌亚洲种(“Candidatus Liberibacter asiaticus”, CLas)引起。目前,已报道的与CLas相关的原噬菌体有3种,并且不同的CLas样品中可以检测到不同类型的原噬菌体或不同类型的组合。本研究基于原噬菌体类型特异引物对从我国南方8省收集的548个黄龙病样品进行原噬菌体类型的鉴定和分析。结果表明,基于原噬菌体类型,在548个样品中共鉴定了7种类型的菌株,分别为Type 1(7.12%)、Type 2(60.22%)、Type 3(3.83%)、Type 1+Type 2(3.28%)、Type 1+Type 3(17.34%)、Type 1+Type 2+Type 3(3.47%)和None类型(不含上述3种类型原噬菌体)(4.74%),其中只携带Type 2类型原噬菌体菌株为华南地区优势种群。此外,基于遗传多样性和遗传距离对我国南方地区的CLas种群进行种群结构分析发现,我国南方地区的CLas种群可以分为3个组,即I组(广东、江西、广西、福建)、II组(浙江和湖南)以及III组(云南和海南),其中I组和II组又可聚为一大组。该结果可为研究我国柑橘黄龙病流行规律提供一定的理论基础。     

离体砂糖橘黄龙病病果中病菌浓度变化规律的探究

柑橘黄龙病(Citrus Huanglongbing,HLB)是柑橘生产上最具毁灭性的病害,对我国乃至世界的柑橘产业造成了巨大的经济损失[1].由于CLas还无法进行分离培养[2],导致对CLas的研究(如病原学、基因组学等)主要依赖于含有CLas的寄主材料,如染病柑橘和带菌柑橘木虱(Diaphorina citri)...     

海南柑橘黄龙病发生分布调查及病原种类鉴定

本研究在海南全省范围进行了柑橘黄龙病的发生分布调查和病原种类鉴定,共采集了14个市县62处柑橘种植点的不同柑橘品种样品1227份。用柑橘黄龙病菌亚洲种和非洲种rpIA-rpIJ基因片段的通用检测引物A2/J5和柑橘黄龙病菌美洲种16S rRNA基因片段的特异检测引物GB1/GB3,对样品进行PCR扩增,发现海南柑橘黄龙病的病原为柑橘黄龙病菌亚洲种,检测样品中阳性率为79.01%,未发现柑橘黄龙病菌非洲种和美洲种。结果发现,柑橘黄龙病已分布在海南的琼中、澄迈、儋州、琼海等8个市县。同时选取海南澄迈、儋州、琼海等4个市县有代表性的甜橙、柚子、柠檬感染黄龙病的样品,扩增样品的rpIA-rpIJ基因A2/J5片段,进行序列比对和系统进化分析。序列比对结果发现,海南各地不同品种中的柑橘黄龙病菌rpIA-rpIJ基因A2/J5片段序列一致性为99.87%,序列十分保守。系统进化分析表明,海南各地不同品种的柑橘黄龙病菌都与黄龙病菌亚洲种聚集为同一进化分枝,与黄龙病菌非洲种和美洲种分属不同的进化分枝。本研究明确了海南柑橘黄龙病的发生分布情况和病原种类,对柑橘黄龙病的防控具有重要的理论意义。     

田间柑橘植株不同部位黄龙病菌的PCR检测及发病原因分析

［目的］了解黄龙病菌在柑橘植株不同部位的分布,为深入研究病菌在植株体内的扩散情况奠定基础;明确病害的发生原因为有效防控该病害提供借鉴。［方法］ 调查浙江省台州市柑橘黄龙病（huanglongbing, HLB）的发生情况,通过常规和巢式PCR,检测了发病情形不同的两个果园内柑橘病株不同部位及不同植株中的黄龙病菌,并对其发病原因进行分析。［结果］ 发现一果园内病株的无症状叶片、有症状叶片和枝条中均含有黄龙病菌,而其周围植株不含病菌;另一果园内病株的有症状叶片、枝条、主干和砧木中均含有黄龙病菌,而其周围植株也含菌。［结论］分析认为这两种果园内柑橘植株发病原因不同,一种可能为通过携带黄龙病菌的柑橘木虱所感染,另一种可能为嫁接过程中通过带菌的接穗感染。     

基于短串联重复和PAGE的柑橘黄龙病菌‘Candidatus Liberibacter asiaticus’种间遗传多样性分析

 韧皮部杆菌亚洲种(‘Candidatus Libriacter asiaticus’,‘Ca. L. asiaticus’)是目前流行范围最广、危害最严重的柑橘黄龙病致病菌。本研究利用‘Ca. L. asiaticus’基因组中全套串联重复基因(short tandem repeat, STR)开发了一套系统的方法用于‘Ca. L. asiaticus’遗传多样性和黄龙病分子流行学研究。PCR和PAGE分析筛选到的36个STR位点中,有33个获得了有效扩增。其中20对引物对不同来源的32个样品的扩增产物多态性较好,最多的可扩增出9种条带类型。采自我国6省的32个‘Ca. L. asiaticus’阳性样品之间的Shannon’s信息指数为0.14~1.90,平均为0.68;Nei’s基因多样性指数为0.06~0.81,平均为0.38,各省的菌株表现出较高的遗传多样性,特别是来自福建、广西和云南三省的。聚类分析发现可能为中国黄龙病发源地的广东省的黄龙病菌株具有一定的遗传特异性;其余邻省之间存在由木虱传播引起的菌株交流的可能性可以解释该病害在省际间传播。研究表明,开发的STR标记结合PAGE的方法可作为今后菌株遗传多样性和病害分子流行学分析的高效方法。     

应用多聚酶链式反应(PCR)技术检测和定量分析柑桔黄龙病病原

 应用多聚酶链式反应(PCR)技术对柑桔黄龙病病原进行检测和定量分析。研究结果表明:PCR技术能准确、快速地检测出田间和温室内罹病的柑桔、长春花以及带菌柑桔木虱样本中的柑桔黄龙病病原(BLO),而健康植株和柑桔木虱样本则呈阴性反应。采用的PCR引物(Primers)是根据柑桔黄龙病病原亚洲株系的DNA序列(In-2.6,基因库号码:M9491)设计的。应用竞争性定量多聚酶链式反应(Q-PCR)方法能测定病原在不同样品中的含量。该技术关键在于:病原DNA和浓度系列稀释后的竞争物DNA,在同一试管中进行DNA扩增反应时,共用相同的引物。由于彼此互相竞争反应引物的结果,病原的PCR产物和竞争物的PCR产物在数量上呈反向线性相关。因竞争物的浓度为已知,便可从线性关系中推算出病原的含量。     

柑橘黄龙病症状与“Candidatus Liberibacter asiaticus”PCR检测结果的相关性分析

柑橘黄龙病症状较为复杂,且因寄主品种、生长期、病程等因素而异。利用PCR检测其病原菌"Candidatus Liberibacter spp."是目前柑橘黄龙病诊断的可靠方法之一。分析柑橘黄龙病症状与PCR检测结果的相关性有助于提高黄龙病的田间诊断准确率。本研究结果表明,与PCR检测相比,根据症状诊断柑橘黄龙病具有较高的假阳性率(8.20%)和假阴性率(50%);通过分析1 839个样品的症状与病原PCR检测结果发现,表现为斑驳型黄化、均匀黄化和"绿岛"这3种叶部症状以及"红鼻子果"和畸形果这2种果实症状的PCR病原检出率高;具有斑驳和黄化、黄化和"绿岛"、"绿岛"和花叶等复合症状样品的PCR检测"Ca.L.asiaticus"的阳性率最高;直径小于1 cm的幼果中的"Ca.L.asiaticus"检测稳定性低。这些结果为更准确地通过症状诊断柑橘黄龙病提供了科学依据。     

侵染木薯的两种单组分菜豆金色花叶病毒属病毒及卫星分子基因组结构特征分析

为明确木薯(Manihot esculenta Crantz)植株叶片皱缩、畸形是否由菜豆金色花叶病毒属病毒侵染引起,从云南省红河州田间采集具有疑似感染症状的木薯植株叶片样品,应用菜豆金色花叶病毒属病毒简并引物、种专化性引物及卫星分子引物进行PCR扩增、克隆,通过测序分析其核苷酸序列特征并对其进行系统进化分析.结果 显...     

北京地区辣椒上黄瓜花叶病毒和甜菜西方黄化病毒复合侵染的分子鉴定

辣椒是我国重要的蔬菜和经济作物,受多种病毒危害。2014年在北京市顺义区调查时发现部分种植的辣椒植株上叶片大面积黄化,边缘症状明显,个别植株叶片轻微上卷。提取典型症状样品的总RNA,反转录得到cDNA,分别用黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)特异引物和马铃薯卷叶病毒属(Polerovirus)通用引物进行PCR检测,CMV特异引物和马铃薯卷叶病毒属通用引物分别扩增得到约650bp和1 400bp的特异条带。测序和核苷酸序列比对表明,其分别与CMV和甜菜西方黄化病毒(Beet western yellows virus,BWYV)序列同源性最高为99%和96%。这是对我国种植的辣椒上发生的CMV和BWYV复合侵染的首次报道。     

基于近红外技术柑橘黄龙病田间快速检测方法研究

柑橘黄龙病在感病植株和健康植株之间传播速度快,因此快速检测柑橘黄龙病对其防治十分关键。本文研究了近红外技术快速检测柑橘黄龙病的方法。采用PLS-LDA建立的模型对未参与建模的样品进行了检测,结果表明,该模型检测的准确率与普通PCR检测的结果符合率达到100%,假阳性率小于1%。该技术具有检测周期短、无污染等优点,可用于田间黄龙病的快速检测。     

柑橘黄龙病PCR检测技术研究

以柑橘黄龙病病原亚洲菌系β-操纵子的特异引物fA2/rJ5进行PCR扩增,依据是否有目标DNA片段的产生来检测柑橘黄龙病菌的存在与否。该检测技术,具有快速、简便、灵敏等特点,可用于柑橘黄龙病的早期诊断,对控制该病害的传播具有重要意义。     

LncRNA在柑橘木虱与黄龙病病原菌互作中的差异表达分析及验证

为明确柑橘黄龙病的唯一自然传播媒介——柑橘木虱Diaphorina citri的长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是否参与调控黄龙病病原菌Candidatus Liberibacter asiaticus(CLas)的侵染及复制,采用生物信息学预测及PCR扩增方法进行lncRNA的预测、特征分析、验证及差异表达分析。结果显示,柑橘木虱的13个转录组RNA-Seq数据中共有10 192个lncRNA基因,对应15 747条lncRNA转录本;与蛋白质编码基因相比,柑橘木虱lncRNA具有更少的外显子数量和更短的转录本长度;随机选取的10条lncRNA基因中,有7条lncRNA基因在无菌柑橘木虱广州品系或赣州品系中有表达,其中1条lncRNA基因TCONS_00034665在无菌广州品系和无菌赣州品系中存在差异表达;带菌和无菌柑橘木虱成虫中预测获得2个差异表达的lncRNA基因TCONS_00096118和TCONS_00234564,实时荧光定量PCR验证发现TCONS_00234564与预测结果一致,在带菌柑橘木虱成虫中高表达。表明lncRNA参与了黄龙病病原菌与寄主柑橘木虱的互作。     

柑橘黄龙病PCR检测引物比较研究

柑橘黄龙病潜伏期长、尚无可用于大田的有效治疗药剂,快速、准确的早期检测是防控柑橘黄龙病的关键.PCR检测是目前柑橘黄龙病最常用的早期检测方法.为提高柑橘黄龙病PCR检测的准确性和检出率,本研究依据已测序的黄龙病菌全基因组序列对检测引物OI2c进行了改进(标记为OI2c-gj),将其与其他常用的7对PCR检测引物进行了特...     

柑橘黄龙病菌亚洲种菌毛装配蛋白基因(PAP)序列分析、原核表达及抗血清制备

菌毛装配蛋白(Flp pilus assembly protein, PAP)是一种分泌蛋白,参与细菌菌毛的组装,表达量高。本研究以感染柑橘黄龙病的海南琼海市绿橙叶片为材料提取总DNA,用其菌毛装配蛋白基因(PAP)的特异引物进行PCR扩增,获得该基因的目的片段,序列分析表明海南琼海柑橘黄龙病菌PAP基因与柑橘黄龙病菌亚洲种(GenBank登录号:CP001677.5)PAP基因序列一致。功能预测表明它含有两个与分泌功能相关的CpaC和Secretin结构域。PCR产物通过EcoRⅤ和XhoⅠ双酶切构建重组载体pET32a-PAP。将pET32a-PAP载体转化BL21(DE3)大肠杆菌,经终浓度为1 mmoL/L IPTG诱导,目的蛋白主要以包涵体形式表达。目的蛋白经Ni~(2+)-NTA层析柱纯化,并作为抗原腹腔免疫小白鼠,获得效价在1∶500～1∶1 000的多克隆抗血清。Western blot分析表明,PAP多克隆抗血清特异性强;以田间样品总蛋白做抗原时,能特异性检测染病样品。本研究为PAP蛋白功能研究和开发柑橘黄龙病菌的蛋白检测产品提供研究基础。     

柑橘黄龙病常规PCR检测技术研究与初步应用

柑橘黄龙病是世界范围具有毁灭性危害的柑橘细菌性病害,在我国大部分柑橘产区发生,严重制约了我国柑橘产业的发展。本文根据黄龙病病原物亚洲韧皮杆菌核糖体16SrRNA基因设计了1对PCR引物HLBF468/HLBR877,并以此为基础建立了常规PCR反应体系,确定了检测体系的特异性和灵敏度。结果表明该体系的检测灵敏度比先前报道的常规PCR方法有了明显提高。利用建立的PCR体系完成了对广东和广西两省区果园柑橘黄龙病的抽样检测。本研究建立的常规PCR方法可以作为一种简便、准确、灵敏的检测技术应用于柑橘黄龙病的早期诊断。     

西番莲中夜来香花叶病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

夜来香花叶病毒(telosma mosaic virus, TeMV)是对西番莲危害较大的一种病毒病原。根据病毒末端结合蛋白(VPg)序列设计引物, 建立了以Vpg-334F/506R为特异性引物, 退火温度54℃, 引物浓度0.6 μmol/L的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法。该方法可特异性扩增TeMV基因组6 483~6 675 nt区域, 所得标准曲线扩增效率为102.77%, 决定系数为0.996 1, 最低检测浓度为2.370×10 2 拷贝/μL, 灵敏度是普通PCR的1 000倍。应用该方法对接种TeMV的西番莲进行检测, 发现接种3 d后可在叶片中检测到TeMV, 定量分析不同温度下TeMV在叶片中的积累, 发现26~28℃下病毒积累速度最快, 且植株症状表现与病毒积累量密切相关。对赣南地区采集的76份西番莲田间样品进行检测, 共检出71份阳性样品, 检出率为93.4%。综上, 本研究建立的实时荧光定量PCR方法特异性强, 灵敏度高, 适于TeMV的快速检测。