一株拮抗水稻白叶枯病菌的淡紫灰链霉菌的筛选鉴定及其生防效果研究

 为发现绿色安全的水稻白叶枯病天然生物防治微生物,本研究从植物根际土壤中分离获得165株放线菌。利用共培养法和牛津杯法,筛选获得了5株拮抗水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)的放线菌,其中拮抗能力最强的是Sl-10菌株,发酵液抑菌圈直径为62.1 mm ± 1.5 mm。根据形态特征、生理生化实验、16S rDNA序列和系统发育分析,鉴定Sl-10菌株为淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendulae)。Sl-10菌株发酵液对大豆斑点病菌(Pseudomonas syringae pv. glycinea)、烟草野火病菌(P. syringae pv. tabaci)、油菜黑腐病菌(X. campestris pv. campestris)、大豆斑疹病菌(X. axonopodis pv. glycines)、水稻条斑病菌(X. oryzae pv. oryzicola)、烟草青枯病菌(Ralstonia solanacearum)和番茄叶斑病菌(P. syringae pv. tomato)7种植物病原细菌均有拮抗作用。Sl-10菌株发酵液具有较好的耐光、耐酸碱和热稳定性。SDS-PAGE电泳结果显示,Sl-10菌株可抑制Xoo的蛋白质合成。4个品种水稻(甬优15、湘两优900、嘉丰2号和甬优1540)喷施Sl-10菌株发酵液,水稻白叶枯病的病斑抑制率达到82.27%~91.78%。研究结果显示,淡紫灰链霉菌Sl-10菌株具有较好的水稻白叶枯病生物防治潜能。     

豆薯细菌性角斑病的病原鉴定

 在安徽滁州的豆薯叶片上发现一种由细菌侵染引起角斑症状的病害,从角斑上分离到具有致病性的非荧光的杆状细菌,菌株的表型特征、细菌学特征、LOPAT试验和生理生化试验表明该细菌与丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae van Hall)相似,BIOLOG系统鉴定结果与丁香假单胞菌豌豆致病变种(P.syringae pv.pisi)相近,接种试验表明豆薯菌株能侵染大豆、菜豆和眉豆,但对豌豆的致病性差;在豇豆、绿豆和蚕豆上不表现症状。结果表明豆薯细菌性角斑病是一种新病害,病原菌属于丁香假单胞菌群的一个新的致病变种,命名为P.syringae pv.pachyrhizus nov.     

广东南瓜细菌性叶枯病及其病原鉴定

 在广东省雷州市发生一种南瓜(Cucurbita moschata)叶枯病,病株叶片边缘开始出现水渍状病斑,逐步发展成大病斑,后期病斑焦枯;在叶片上也可形成近圆形水渍状病斑,伴有黄色晕圈,后期病斑联合形成不规则大枯斑;叶柄和匍匐茎被侵染后呈水渍状腐烂。从病斑上分离到一种细菌,在KB培养基上,菌落为椭圆形,乳白色,半透明,边缘参差不齐,紫外灯照射下产生荧光反应。致病性测定结果表明,该病原细菌可侵染6个南瓜品种引起与田间症状相同的叶枯病。生理生化试验结果表明,该病原细菌与丁香假单胞丁香致病变种(Pseudomonas syringae pv. syringae)的特性一致。应用假单胞菌属特异引物Ps-for/Ps-rev和丁香假单胞丁香致病变种组群特异性引物Group III-F/Group III-R,可从该病原细菌中扩增出预期大小分别为1 018 bp和750 bp的目的片段。应用丁香致病变种syrB基因特异性引物B1/B2,可从该病原菌中扩增出预期大小为750 bp的丁香霉素基因片段。基于16S rDNA与gyrB基因序列系统进化分析均表明,南瓜叶枯病菌株与已报道的P. syringae pv. syringae菌株HS191(CP006256)亲缘关系最近,二者聚类在一起形成一个小分支。人工接种条件下,该病原细菌还可侵染西葫芦、丝瓜、茄子、番茄、菜豆、扁豆等植物。这些结果表明,引起广东省南瓜叶枯病的病原为丁香假单胞丁香致病变种(Pseudomonas syringae pv. syringae)。这是首次在中国发现丁香假单胞丁香致病变种引起南瓜叶枯病。     

进境油菜籽中十字花科黑斑病菌的检测

 利用MT选择性培养基从加拿大进境油菜籽样品中分离到2株细菌分离物2305-1和5309-1,对分离物进行致病性测定、LOPAT测试、Biolog测试、hrpZ和cfl基因序列分析,以及多位点序列分析。结果表明:2株分离物人工接种油菜、花椰菜和番茄幼苗都能引起典型黑斑症状;LOPAT测试和Biolog测试结果与丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)的各项生理指标一致;hrpZ基因序列与十字花科黑斑病菌(P. syringae pv. maculicola)和番茄细菌性叶斑病菌(P. syringae pv.tomato)的序列相似性均为99.18%～100%;cfl基因序列分析表明分离物2305-1和5309-1基因组中存在冠毒素合成基因;选择gyrB、ropD、gltA、 gap1、 acnB和pgi 6个看家基因进行多位点序列分析,系统发育树显示分离物2305-1和5309-1均与P. syringae pv. ma-culicola聚在一起。根据试验结果将分离物2305-1和5309-1鉴定为十字花科黑斑病菌P. syringae pv. maculicola。     

中国猕猴桃细菌性花腐病菌的鉴定

 从福建、湖南和湖北猕猴桃病花上分离到能引起花腐病的32个细菌菌株,经细菌学和BiologGN测试板测定,可以看出中国的猕猴桃细菌性花腐病菌与新西兰的猕猴桃花腐病菌、丁香假单胞菌丁香致病变种Pseudomonas syringae pv.syringae和绿黄假单胞菌P.viridiflava相似,与萨氏假单胞菌P.savastanoi和猕猴桃溃疡病菌P.syringae pv.actinidiae有更多的不同,但是DNA/DNA同源性测定结果却显示出中国的菌株可分为2个类型:第1个类型与新西兰猕猴桃花腐病菌和萨氏假单胞菌有很高的同源性,第2类型与绿黄假单胞菌有很高的同源性,说明中国菌株分别属于这2个种。第1类型来自于福建和湖北,第2类型来自于湖南。     

应用PCR方法快速检测黄瓜细菌性角斑病菌

黄瓜细菌性角斑病是黄瓜上的一种重要细菌病害,其病原为丁香假单胞菌黄瓜致病变种(Pseudomonas syringae pv.lachrymans),目前未见到该病害特异性PCR检测方法的报道。通过分析丁香假单胞菌(P.syringae)不同致病变种glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 1(gap1)基因序列设计得到一对Psl特异性PCR引物。利用该引物对丁香假单胞菌不同致病变种、假单胞菌属其他种及其他属的共46株菌株进行了PCR扩增,结果表明,所有不同来源的12株黄瓜细菌性角斑病菌均得到179bp的目标片段,而所有其他参试菌株均无扩增条带,PCR检测的灵敏度为7.5×103cfu/mL。利用该方法可从接种后发病的黄瓜叶片总DNA中检测到特异条带,而健康叶片无条带。该引物的PCR检测方法可直接用于植株总DNA的检测,无需进行病原菌的分离培养,快速简便,适用于进出境检验检疫及种苗健康检测等。     

新疆加工型辣椒细菌性斑点病的发生和病原鉴定

 新疆加工型辣椒主要产区巴音郭楞蒙古自治州发生了一种严重危害辣椒的细菌性病害。从发病辣椒叶片中分离细菌,通过烟草过敏性反应、马铃薯软腐试验和接种辣椒等致病性测定,确定了13个致病菌株,各菌株之间致病力无明显差异。通过菌体形态、培养性状观察、生理生化反应、寄主范围测定,结合16S rDNA和rpoD基因扩增、序列测定和系统发育分析,将病原菌鉴定为丁香假单胞菌丁香致病变种(Pseudomonas syringae pv. syringae)。病原菌人工接种还能侵染番茄、茄子、马铃薯及黄瓜、四季豆、白菜、萝卜、芹菜等植物。P. syringae pv. syringae引起加工型辣椒细菌性斑点病在国内属首次报道。     

云南猕猴桃细菌性溃疡病病原菌鉴定

为明确云南省发生的猕猴桃溃疡病种类,通过田间发病症状、菌落形态、致病性测定、Biolog分析,16S rDNA序列分析比较,对疑似猕猴桃溃疡病病原菌进行鉴定。结果表明:病原菌接种可引起烟草过敏反应,同时在猕猴桃叶片表面形成带有黄色叶晕的不规则褐色斑点,将菌株测序序列与现有的丁香假单胞菌菌株的16S rDNA序列构建进化树,结果显示病原菌与丁香假单胞猕猴桃致病变种聚在同一分支上。以上表明云南省猕猴桃溃疡病病原菌为丁香假单胞猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv. actinidiae)。这是云南省首次报道由Pseudomonas syringae pv. actinidiae引起的猕猴桃细菌性溃疡病。     

构树上一种新的丁香假单胞菌致病变种的研究

 构树细菌性疫病是一种荧光假单胞菌引起的新病害。主要症状有叶片角斑,嫩梢肿大和幼枝溃疡。从江苏一带分离获得的12个构树菌株和3个桑树对比菌株进行交互接种试验,发现构树菌株与桑树菌株之间不能交互侵染其寄主。细菌学特征和LOPAT试验及其它37项生理生化和营养特性试验表明,两种菌的表型特征基本相似,仅在7种化合物的利用上存在差异。两种菌的血清学反应无相关性。细胞全蛋白SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱也略有不同。试验结果证明,构树细菌性疫病细菌属于假单胞菌属(Pseudomonas),丁香假单胞菌(P.syringae)的一个新致病变种,定名为Pseudomonas syrzngae pv.broussonetiae pv.nov.     

黄瓜细菌性茎枯萎病病原鉴定及温度对其致病力的影响

自2003年以来, 在我国北京?辽宁和山东等地的黄瓜上发现了一种重要细菌病害—黄瓜细菌性茎枯萎病, 对黄瓜生产造成了严重危害?从发病的黄瓜叶片?茎部和果实上分离的菌株接种到黄瓜后, 症状与自然发病症状完全一致?经过多位点序列分型和BOX-PCR技术, 以及LOPAT?GATTa和Ayers碳源利用试验等, 确定该病害的病原菌为丁香假单胞流泪致病变种 Pseudomonas syringae pv. lachrymans?以黄瓜细菌性茎枯萎病菌A2为供试菌株, 黄瓜细菌性角斑病菌丁香假单胞菌流泪致病变种 P.syringae pv. lachrymans pslb8为对照菌株, 对其进行不同温度下致病力?体内和体外生长能力测定, 结果表明:20℃条件下, A2菌株的致病力?体内和体外生长能力均强于pslb8菌株, 相对低温的条件更有利于黄瓜细菌性茎枯萎病病原菌的侵染和病害的发生?     

进境加拿大豌豆中豌豆细菌性疫病菌的检测

 利用MT选择性培养基从进境加拿大豌豆样品上分离到一株细菌分离物(编号1314),对该分离物进行PCR检测、16S和23S rRNA序列扩增、多位点序列分析、Biolog测定、烟草过敏性反应和致病性测试。豌豆细菌性疫病菌(Pseudomonas syringae pv. pisi, Ppi)特异引物AN7F/AN7R扩增分离物1314和Ppi菌株ATCC 11043得到预期272 bp的条带,二者的PCR产物序列一致,与GenBank中Ppi (X97405)的序列相似性为99.57%。分离物1314的部分16S rRNA、23S rRNA序列以及16S-23S序列均与Ppi菌株ATCC 11043一致。选择gap1、gltA、gyrB和ropD 4个看家基因进行多位点序列分析,系统发育树显示分离物1314与Ppi菌株聚在同一组内。Biolog鉴定结果表明:分离物1314为Ppi,PROB值为0.898,SIM为0.72。该分离物人工接种豌豆茎秆能引起水渍状症斑,接种烟草叶片产生过敏性反应。基于上述试验结果,将分离物1314鉴定为豌豆细菌性疫病菌。     

7种检疫性植物病原黄单胞菌III型分泌系统和效应蛋白编码基因的差异性分析

 γ-变形菌纲(γ-Proteobacteria)的黄单胞菌属(Xanthomonas)的大多数种类可引起植物病害,多数是我国检疫对象。与其他革兰氏阴性植物病原细菌一样,植物病原黄单胞菌可通过高度保守的III型分泌系统(type-III secretion system, T3SS)分泌效应蛋白(T3SS-secreted effectors, T3SEs)进入植物细胞,在非寄主植物和抗病寄主植物上产生过敏反应(hypersensitive response, HR)以及在感病寄主植物上具有致病性。尚不清楚哪些种类的黄单胞菌具有T3SS和缺少哪些T3SE是否可作为检疫的依据。搜集7种检疫性植物病原黄单胞菌,通过PCR和Southern杂交试验结果发现:香蕉细菌性青枯病菌(X. campestris pv. musacearum)的ICMP287和ATCC49084菌株、甘蔗流胶病菌(X. axonopodis pv. vasculorum)ATCC13901菌株、洋葱细菌性叶枯病菌(X. axonopodis pv. allii)的LMG576和LMG578菌株中不含有tale基因,并且ATCC13901菌株既不含有T3SS基因也不含有hpa1和xopQ基因;菜豆细菌性疫病菌(X. campestris pv. phaseoli)ATCC49119菌株不含有hpa1基因。相应地,推测含有2~12个tale基因的黄单胞菌有:大豆斑疹病菌(X. axonopodis pv. glycines)ICMP5732和ATCC43911菌株、豌豆细菌性疫病菌(X. axonopodis pv. vignicola)ATCC11648菌株、棉花细菌性角斑病菌(X. campestris pv. malvacearum)ATCC12131和(X. campestris pv. phaseoli)ATCC49119菌株。大豆细菌性斑疹病菌ATCC43911菌株尽管含有hpa1、xopQ和hrcC基因,但在非寄主烟草上不能激发HR反应;而甘蔗流胶病菌ATCC13901菌株不含有hpa1、xopQ和hrcC基因,却激发烟草产生HR反应。这些结果对于分析比较不同植物病原黄单胞菌的致病性因子和设计特定的植物检疫靶点提供了科学线索。     

拮抗水稻白叶枯病菌链霉菌的筛选、鉴定和防效研究

 为寻找水稻白叶枯病天然生防药剂,本研究利用共培养和牛津杯法分离筛选植物根际土壤放线菌,共分离纯化获得65株放线菌菌株。在8株能够拮抗水稻白叶枯病菌Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo)放线菌菌株中,Sr-63菌株对水稻白叶枯病菌拮抗能力最强,其发酵液抑菌圈直径为46.4 mm ± 2.3 mm。优化发酵条件后,Sr-63菌株发酵液抑菌圈直径可达50.0 mm ± 1.2 mm;依据形态特征、生理生化特征和系统发育分析,鉴定菌株Sr-63为玫瑰轮丝链霉菌(Streptomyces roseoverticillatus)。抗菌谱实验结果表明,Sr-63菌株发酵液对水稻细菌性条斑病菌、大豆细菌性斑疹病菌、番茄细菌性叶斑病菌以及大豆细菌性斑点病菌4种植物病原细菌也有较好的拮抗作用。水稻白叶枯病防效实验结果表明,Sr-63菌株发酵液对水稻白叶枯病具有良好的防治效果,对‘Chai Nat 2'、‘KDML105'、‘Khao luang' 3个水稻品种的病斑抑制率均达到了90 %以上,且Sr-63菌株的发酵液防治效果优于化学农药叶枯唑。     

丁香疫霉病菌PCR和实时荧光PCR检测

 为了快速、准确地检测丁香疫霉病菌 (Phytophthora syringae, PSY),根据GeneBank中PSY的ITS序列设计特异引物Psy1/Psy2和探针P-Psy,建立了常规PCR和实时荧光PCR检测方法。利用引物Psy1/Psy2扩增供试的26株PSY能得到585 bp的预期目标条带,但扩增其它61个非PSY供试菌株不能得到预期产物,检测灵敏度为12 pg菌丝DNA;探针P-Psy对供试26株PSY表现为阳性扩增,而对其它菌株和空白对照均表现为阴性扩增,检测灵敏度可达120 fg菌丝DNA,比常规PCR高100倍;引物Psy1/Psy2和探针P-Psy对5 g土壤中PSY卵孢子的检测灵敏度分别为20 000个和200个。样品检测试验表明两种PCR方法可用于口岸植物检疫中快速、准确和特异地检测丁香疫霉病菌。     

芹菜细菌性软腐病病原的分离与鉴定

 由植物病原细菌引起的芹菜软腐病在北京地区普遍发生,其中以顺义及通州区县较为严重。自发病芹菜茎段中分离细菌,通过接种芹菜进行致病性测定,确定了54个致病菌株。虽然菌株间致病力有一定的差异,但大多数菌株对芹菜致病力强。通过培养性状和菌体形态观察、生理生化反应和Biolog测定,结合胡萝卜软腐果胶杆菌Pectobacterium carotovorum 6个管家基因(pgi、rpoS、mdh、proA、mtlD、icdA)的基因扩增、序列测定和多基因联合系统发育分析,将病原菌鉴定为胡萝卜软腐果胶杆菌P. carotovorum的3个亚种。其中45个菌株为P. carotovorum subsp. odoriferum,频数为83.33%;6个菌株为P. carotovorum subsp. carotovorum,频数为11.11%;3个菌株为P. carotovorum subsp. brasiliensis,频数为5.56%。上述结果显示,北京地区芹菜细菌性软腐病的病原菌为胡萝卜软腐果胶杆菌P. carotovorum的3个亚种,其中以P. carotovorum subsp. odoriferum为优势种。     

番茄细菌性髓部坏死病病原的鉴定

2015年,在广东省广州市番茄种植区发生番茄髓部坏死病,从番茄病样中分离到一种细菌。随机选取5株细菌进行致病性测定,结果显示,这5株细菌均可侵染番茄植株产生典型的髓部坏死症状,与田间病株的症状相同。5株细菌的16S rDNA序列间同源性为99.9%~100%,且与菊苣假单胞菌(Pseudomonas cichori)MAFF211996、TIs01和IP1-05菌株的16S rDNA序列同源性最高,为99%。利用菊苣假单胞菌hrcR基因的特异引物Hrp1a/Hrp2a进行PCR,从这5株细菌的DNA中均能扩增出大小约897 bp的特异片段;这些片段序列间同源性为99%~99.9%,且与P.cichori 83-1菌株hrcR基因的序列同源性为99.9%。这些结果表明,引起广东番茄髓部坏死病的病原为菊苣假单胞菌(P.cichorii)。生理生化试验显示,该病原菌与文献报道的菊苣假单胞菌的生理生化特征均相吻合,进一步证实引起广东番茄髓部坏死病的病原为菊苣假单胞菌。     

一串红穿孔病病原鉴定和初侵染源分析

 2021年夏季,受台风“烟花”影响,上海市奉贤区海湾镇大面积一串红种苗突发穿孔病,本文按照柯赫氏法则鉴定病原物并进行初侵染源分析。从田间病样中分离出的黄色分离物YchA回接一串红形成穿孔症状,在非寄主本氏烟草上可激发过敏反应。16S rDNA序列分析显示YchA为黄单胞菌属;以持家基因fyuA、gyrB、rpoD进行多位点序列分析(Multi-locus sequence analysis, MLSA)发现,菌株YchA与核桃细菌性黑斑病菌(Xanthomonas arboricola pv. juglandis, Xaj)亲缘关系最近;Biolog鉴定系统分析显示,一串红穿孔病病原为Xaj的可能性约为68%。对育苗基质、种子和灌溉水的检测发现,种子和灌溉水带菌。这些结果表明,一串红细菌性穿孔病的病原为树生黄单胞菌(X. arboricola),可能是一个新致病变种;种子带菌是病害的初侵染来源,灌溉水带菌扩散。