转基因动物中慢病毒载体包装的优化

慢病毒载体作为基因治疗载体发展起来,现已用于转基因动物制备.本实验用磷酸钙沉淀法将转移质粒(pCCL-hCMV-eGFP)、包装质粒(pCMVΔR8.9)、包膜蛋白质粒(pMDG(VSV-G))三质粒共转染来源于人胚肾细胞系的包装细胞-293T,转染48 h后收集病毒上清,采用6孔板培养感染细胞,荧光显微镜计数EGFP阳性细胞法测定病毒滴度.载体滴度达2×107 TU/ml左右.     

慢病毒载体的构建及其应用于转基因动物的研究进展

为提高慢病毒载体构建水平,提高转基因整体效率,作者综述了慢病毒载体结构及围绕改善生物安全性、提高目标基因装载量、扩大宿主范围而进行的慢病毒载体改造研究发展历程,指出新型慢病毒载体去除了病毒所有辅助基因,引入了外源调控序列,替换了包膜蛋白,大大提高了慢病毒载体的安全性、基因转移效率和表达效率,使宿主细胞类型更广范,而下游表达载体转染方法的研究又为转基因方法的集成与优化奠定了基础。慢病毒载体制备与多种转基因技术的优化集成,将有助于发展简便、高效、经济的转基因新技术,提高转基因技术的整体水平。     

慢病毒载体在制备转基因动物中的最新进展

慢病毒（Lentivirus）属于逆转录病毒科（Retrovidae），为RNA病毒，由于这类病毒的一个重要特点是毒粒中含有依赖RNA的多聚酶即逆转录酶，故现名为逆转录病毒。慢病毒载体（Lentivirus vectors）与简单的逆转录病毒载体相比，具有可感染分裂细胞及非分裂细胞，转移基因片段容量较大，目的基因表达时间长，不易诱发宿主免疫反应等优点，已成为当前制备转基因动物的载体之一。     

慢病毒载体系统研究及应用进展

近年来,慢病毒载体系统(lentivirus vector system)研究发展迅速,作为基因改造的有效手段在生命科学领域中得到广泛运用.该系统携带基因片段大,整合效率高,能够感染多种分裂期与非分裂期的细胞,实现基因在宿主体内的长期稳定表达.现就慢病毒载体系统的基本结构、发展历程以及临床应用等方面的研究情况进行综述,...     

慢病毒载体的研究进展及应用

慢病毒载体是近年来受到广泛关注的一种逆转录病毒载体,具有更安全、转移效率高、可将目的基因整合入宿主基因组和可感染非分裂期细胞等优点,因此有望成为理想的基因转移载体,并在临床和生产实践中广泛应用。作者主要以HIV-1为代表对慢病毒载体的构建及其在基因治疗和转基因动物生产中的应用作一综述。     

慢病毒载体法制备转基因动物研究进展

慢病毒能够感染分裂细胞和非分裂细胞,因而被发展成为重要的转基因载体,已成为制备转基因动物的一种工具,转基因效率明显提高。该文介绍了制备转基因动物的技术方法,比较了慢病毒载体制备转基因动物的特点和优势,介绍了慢病毒载体安全设计的发展,并将近年来国内外利用慢病毒载体法制备转基因动物的研究进行了概述。     

水牛脂多糖结合蛋白基因表达载体构建及其shRNA片段的筛选

试验旨在构建水牛脂多糖结合蛋白(LBP)基因融合蛋白表达载体,探讨其在293细胞中的表达情况;筛选获得可抑制水牛LBP基因表达的shRNA干扰片段。采用RT-PCR方法,以水牛肝脏cDNA为模板,扩增水牛LBP开放阅读框(ORF),将其连接到pMD18-T载体中。序列测定并分析正确后,采用SalⅠ和BamHⅠ进行双酶切,将水牛LBP基因编码区定向克隆至pDsRed-N1载体中,构建其融合蛋白表达载体pDsRed-N1-LBP。设计2个针对LBP靶基因序列的shRNA(774-792、1212-1231),同时设计无关序列1864作为阴性对照。合成好的shRNA序列先退火连接到pUC 57载体上,再亚克隆到慢病毒表达载体pSicoR-GFP中,将重组质粒命名为pSicoR-GFP-shLBP774/1212/1864(N.C),采用PCR和测序方法鉴定阳性克隆。将LBP融合蛋白表达载体和其shRNA慢病毒表达载体经脂质体共转染293细胞,48 h后观测荧光蛋白表达情况。收集共转染细胞样品,采用实时定量PCR(QRT-PCR)检测LBP基因的表达,筛选有效抑制LBP基因表达的shRNA干扰序列。结果表明,成功构建水牛LBP融合蛋白表达载体pDsRed-N1-LBP,并在293细胞中瞬时表达。PCR和测序结果均证实所构建的shRNA慢病毒表达载体pSicoR-GFP-shLBP774/1212/1864(N.C)为阳性克隆。共转染48 h后观测,红色和绿色荧光蛋白均有表达。QRT-PCR检测结果显示,shRNA-774和shRNA-1212对293细胞中LBP基因mRNA的表达均有抑制效果,抑制效率分别为49.53%、29.27%。因此,设计合成的2条shRNA序列能有效抑制水牛LBP基因的表达,这为进一步探讨LBP基因在LPS诱导的革兰氏阴性菌跨膜机制和信号转导中的作用机理研究奠定了基础。     

腺病毒载体转染水牛不同原代体细胞的效果比较

试验旨在比较腺病毒载体转染水牛乳腺上皮细胞、卵丘细胞、成纤维细胞的效率。将腺病毒质粒pBHGloxdelE13cre、pDC316-eGFP脂质体转染293细胞,收集病毒并测定病毒滴度。用腺病毒载体按不同的感染复数（MOI）感染水牛乳腺上皮细胞、卵丘细胞、成纤维细胞,72 h后倒置荧光显微镜下观察,统计感染效率。MOI为25、50、100、200、400时,成纤维细胞感染效率分别为0.7%、7.0%、9.0%、12.5%、34.0%,卵丘细胞感染效率分别为42.5%、55.3%、57.4%、76.0%、80.0%,乳腺上皮细胞感染效率分别为88.7%、100%、100%、100%、100%。结果表明,腺病毒转染乳腺上皮效率最佳,卵丘细胞次之,成纤维细胞效果较差。     

利用逆转录病毒侵染技术制备转基因动物研究进展

转基因技术已成为现代生命科学中的一项重要技术,它不仅广泛地用于研究基因的功能,同时也用来快速改变生物的遗传性状。本文简要介绍了利用逆转录病毒侵染技术制备转基因动物的原理,概述了此项技术近年的研究进展。在比较了原核显微注射与慢病毒侵染技术优缺点的基础上,进一步提出慢病毒侵染技术可能成为一种制备转基因动物的较好工具。     

水牛原代体细胞慢病毒感染体系的建立

试验旨在建立水牛原代体细胞慢病毒感染体系。通过比较慢病毒（lentivirus）感染水牛颗粒细胞（buffalo granulosa cell,BuGC）、水牛乳腺上皮细胞（buffalo mammary epithelial cell,BuMEC）、水牛成纤维细胞（buffalo fibroblast cell,BuFC）的效率及荧光强度,筛选出3种水牛原代体细胞的最佳感染复数（MOI）。分离培养获得BuGC、BuMEC及BuFC。将慢病毒质粒pLVX-Puro-GFP和包装质粒pSPAX2、pMAD2.G脂质体转染HEK293T细胞,于转染后48和72 h收集病毒并通过稀释计数法测定慢病毒滴度。将慢病毒按不同的感染复数（100、200、400、600、800）感染BuGC、BuMEC和BuFC,感染72 h后于倒置荧光显微镜下观察拍照,统计感染效率及荧光强度。慢病毒感染3种水牛原代体细胞后,用嘌呤霉素筛选。结果显示,在MOI≤200时,慢病毒感染后细胞荧光强度BuMEC最强,而BuGC和BuFC间无显著差异;在MOI≥400时,慢病毒感染后细胞荧光强度为：BuMEC>BuGC>BuFC。在MOI=100时,慢病毒感染效率为：BuGC>BuMEC>BuFC;在MOI=200时,BuMEC和BuGC感染效率达到100%;在MOI=800时,BuFC感染效率达到100%。不同细胞类型对慢病毒的毒性耐受存在差异,在嘌呤霉素的筛选和维持下,获得了3种水牛原代体细胞绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）过表达慢病毒稳转细胞株。慢病毒感染BuMEC、BuGC、BuFC的最佳MOI分别为200、400和800;3种水牛原代体细胞均能通过慢病毒获得过表达外源基因细胞株。本研究结果为水牛的乳腺组织发育分化、泌乳调控、生殖发育及转基因动物制备等提供了较好的细胞模型。     

慢病毒介导的水牛CD14基因shRNA序列的筛选

研究慢病毒载体介导的RNA干扰对水牛CD14基因表达的影响,设计并筛选具有抑制作用的靶序列。将真核表达载体pDsRed-N1-buffaloCD14转染293细胞株,建立稳定表达水牛CD14基因细胞系。同时设计5条水牛CD14 shRNA(319/421/755/970/1 041)以及1条阴性对照序列(NC-1864),构建慢病毒重组质粒pSicoR-GFP-shRNA。采用磷酸钙沉淀法将三质粒共转染293T细胞包装慢病毒,并进行滴度测定。最后,通过对慢病毒感染的pDsRed1-N1-buffalo CD14-293细胞进行QRT-PCR检测,筛选具有抑制效果的shRNA。结果显示:在各感染细胞组中,外源水牛CD14基因mRNA的表达均受到不同程度的抑制,其中,CD14 shRNA-970靶点的干扰效率最高,达到79.3%(P<0.01)。成功筛选出具有较高抑制效果的水牛CD14 shRNA靶序列,为研究CD14基因在布氏杆菌所致炎症反应中的作用,建立家畜布氏杆菌病防治新方法奠定了基础。     

胚盘下腔显微注射慢病毒载体制备转基因鹌鹑

利用显微注射法给每枚新鲜鹌鹑种蛋胚盘下腔注射滴度为1×109 TU/mL人类免疫缺陷病毒I型(human immunodeficiency virus-1,HIV-1)慢病毒载体1μL,直接封口后孵化出雏,应用倒置荧光显微镜及分子生物学方法检测。结果显示:在注射慢病毒后第4天,倒置荧光显微镜下观察到发育胚胎卵黄膜上绿色荧光蛋白较强表达;试验操作240枚鹌鹑种蛋,孵化出雏34只,孵化率为14.1%;对新出雏鹌鹑解剖后,可检测到喙部、眼部、羽毛、肝脏、肾脏、盲肠、肺脏、小肠、大肠、输卵管、心脏、胸肌及大脑等内脏器官中绿色荧光蛋白广泛性表达,但在性腺中绿色荧光蛋白表达信号较弱;对发育到性成熟期的G0代19只雄性鹌鹑精液基因组聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测,其中3只为阳性,阳性率为15.7%(3/19);在3只阳性雄性鹌鹑的236只后代中,有4只经PCR及印迹杂交(Southern-blot)检测为阳性,阳性率为1.69%(4/236)。结果表明:利用慢病毒载体胚盘下腔注射成功生产出转基因鹌鹑,为转基因禽类制备提供了一种简便易行的好方法。     

应用ICSI技术生产转基因水牛胚胎的初步研究

本研究旨在探讨水牛精子完整质膜和破损质膜的方法对水牛单精子注射(ICSI)技术转基因效果的影响。水牛精子经冻融、Triton×-100、超声波3种方法破损精子质膜后与外源质粒DNA混合,采用ICSI的方法将基因转染后的精子注射到水牛体外成熟卵内,观察水牛ICSI卵激活后的发育状态和外源基因的表达效果。结果表明:精子质膜完整性实验中,冻融破损精子质膜组早期胚胎基因表达率为21.8%,显著高于活精子组的5.1%(P<0.01);冻融组与活精子组的卵裂率、囊胚发育率均无显著差异(P>0.05)。以冻融、Triton×-100、超声波3种方法破损精子质膜,冻融组的囊胚发育率(16.7%)最高,显著高于Triton×-100组(P<0.01)。同时,冻融组的早期胚胎基因表达率亦显著高于Triton×-100组和超声断尾组(60.3%vs.31.7%vs.18.2%,P<0.01)。上述结果说明,使用ICSI技术转外源基因可获得表达EGFP基因的水牛早期胚胎;冻融精子质膜破损法能有效破损精子质膜,有利于外源DNA与精子的结合,且提高转基因效率。     

影响水牛体细胞克隆胚胎移植的因素

从不同发情方式、不同胚胎类型、不同胚龄以及不同季节来探讨影响水牛体细胞克隆胚胎移植的效率。结果显示,自然发情与同期发情方法对水牛体细胞克隆胚胎的移植受胎率有显著影响。鲜胚和冻胚移植后受胎率没有显著差异,其受胎率分别是9.79%、14.5%。在移植中,不论是鲜胚还是冻胚,6日龄胚胎移植受胎率最高。而且不同日龄(5、6、7、8～10d)克隆胚胎移植受胎率差异不显著(鲜胚P=0.260 7,冻胚P=0。065 2)。克隆胚胎在秋季移植时受胎率最高,受胎率是16.06%,比其他季节高,且差异显著(P<00.05).其次是春季,但夏季和冬季克隆胚胎移植后受胎率差异不显著(P>0.05)。结果表明,水牛体细胞克隆胚胎在胚胎移植中是可行的,但效率比较低。     

猪瘟病毒Shimen株E2基因的克隆及其逆转录病毒表达载体的构建

根据已发表的猪瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）Shimen株的全基因组序列，设计2对引物P1／P2和B1／B2，在B1和B2的5’端分别加上EcoR 1和BamH 1位点，以CSFV—Shimen株脾毒为材料。一步法提取总RNA。并以此为模板采用反转录PCR（RT—PCR）和套式PCR（nPCR）。成功地扩增出约1．2kb的E2基因。将PCR产物回收后与pMD18-T载体连接并转化。经PCR和酶切鉴定获得重组质粒E2-T。将E2-T经EeoR 1和BamH 1酶切消化、回收目的基因后。与经BamH 1／EcoR 1酶切的逆转录病毒载体pBABE—puro连接并转化，经酶切鉴定获得重组质粒pBABE—puro—E2。序列测定表明，目的基因的插入位置、方向和读码框完全正确。     

靶向O型口蹄疫病毒shRNA转基因猪体细胞抗病毒活性研究

为研究靶向O型口蹄疫病毒(FMDV)VP1基因shRNA转基因猪体细胞的抗病毒活性,本实验在成功培育转基因克隆猪的基础上,通过分离与培养转基因猪体细胞,对其shRNA进行PCR和Southern blot检测,并将FMDV感染体细胞中,通过细胞病变(CPE)、间接免疫荧光试验(IFA)和实时荧光定量PCR(Real-time PCR)分析转基因猪体细胞抗FMDV活性。结果表明,转基因猪体细胞基因组DNA中携带有靶向FMDV VP1基因的shRNA基因片段。与非转基因猪体细胞相比,接种FMDV转基因猪体细胞其出现CPE的时间延迟,细胞内病毒含量显著降低,细胞感染病毒36 h时,对细胞中FMDV VP1基因抑制效率为53.6%。表明该靶向FMDV shRNA转基因克隆猪体细胞在体外具有良好的抗病毒活性。本研究为进一步在体内评价转基因动物的抗病毒活性奠定了基础。     

慢病毒载体及慢病毒介导的RNA干扰

慢病毒载体是高效的基因转导工具,能将外源基因序列稳定导入分裂期细胞和非分裂期细胞.将慢病毒载体与RNA干扰结合能在哺乳动物的各类细胞中特异性抑制同源基因的表达,它将是基因功能研究和基因治疗的有力手段.应用慢病毒栽体进行转基因动物的制备,转基因的效率将得到显著提高.慢病毒介导的RNA干扰具有高效、稳定、特异性强的特点,它能在哺乳动物的各类细胞、多种疾病的离体细胞中实现稳定的RNA干扰.该技术被广泛用于基因功能的研究,在疾病的基因治疗上也具有良好的前景.     

慢病毒载体及慢病毒介导的RNA干扰

慢病毒载体是高效的基因转导工具,能将外源基因序列稳定导入分裂期细胞和非分裂期细胞.将慢病毒载体与RNA干扰结合能在哺乳动物的各类细胞中特异性抑制同源基因的表达,它将是基因功能研究和基因治疗的有力手段.应用慢病毒载体进行转基因动物的制备,转基因的效率将得到显著提高.慢病毒介导的RNA干扰具有高效、稳定、特异性强的特点,它能在哺乳动物的各类细胞、多种疾病的离体细胞中实现稳定的RNA干扰.该技术被广泛用于基因功能的研究,在疾病的基因治疗上也具有良好的前景.     

慢病毒载体构建策略及生物安全性研究进展

慢病毒可以感染分裂细胞和非分裂细胞,是较有前途的病毒载体,来源于HIV-1型载体,能阻止形成有复制能力的HIV-1病毒,构建一个更为安全的模式是慢病毒载体构建策略的焦点。该文介绍了慢病毒载体应用过程中的不同载体系统及构建策略,对载体的生物安全性进行了分析,展望了慢病毒在基因治疗、RNA干扰及转基因领域的应用前景。