猪鼻支原体分子生物学检测方法研究进展

猪鼻支原体感染猪后能引起猪肺炎、多发性浆膜炎、关节炎、结膜炎、中耳炎等多种疾病,易与其他猪病混感或继发多种疾病,致猪死亡率增加,给养猪业造成巨大的经济损失。文章综述了5种猪鼻支原体分子生物学检测方法,主要包括常规PCR法、套式PCR法、多重PCR、荧光PCR方法、环介导等温扩增技术等,对猪鼻支原体的诊断和防控有一定的参考价值。     

猪肺炎支原体和猪鼻支原体双重PCR检测方法的建立与应用

根据猪肺炎支原体(Mhp)和猪鼻支原体(Mhr)的16S rRNA基因设计3条引物, 建立Mhp和Mhr的双重PCR检测方法,并对该方法进行了特异性和敏感性试验,并使用建立的方法检测了临床样品和疫苗样品。结果显示该方法具有良好的特异性,最低可检测到0.66ng 的Mhp基因组DNA和0.58 ng Mhr基因组DNA,临床样品和疫苗样品检测结果与普通PCR检测结果一致。该双重PCR方法,可用于Mhp与Mhr的鉴别、诊断以及疫苗纯粹性检查,快速而准确。     

巢式PCR检测猪鼻支原体方法的建立及应用

应用巢式聚合酶链式反应(Nested PCR)建立了一种检测猪鼻支原体(Mycoplasmah yorhinis)的方法,试验中以酚-氯仿法制备模板DNA,根据猪鼻支原体P37序列高度保守区设计2对引物,建立Nested PCR诊断方法.在特异性检测试验中,设计的引物不能扩增出猪絮状支原体、猪滑液支原体、猪肺炎支原体、鸡毒支原体、胸膜肺炎放线杆菌、猪瘟病毒、猪流感病毒、猪圆环病毒及猪繁殖与呼吸综合征病毒等病原体;敏感性试验表明,第1次PCR和第2次PCR的敏感度分别为3.01 mg/L和3.01×10-4mg/L.对41份临床样品肺组织的检测中,普通PCR和巢式PCR的检出率分别为29.3％(12/41)和82.9％(34/41).结果表明,巢式PCR方法明显优于常规PCR方法,具有较高的敏感性和实用性,为猪鼻支原体的检测提供了一种新型、可靠的诊断技术.     

猪鼻支原体PCR检测方法的建立

猪鼻支原体是猪鼻腔上的常在菌,引起仔猪多发性浆膜炎和关节炎,是猪场一种重要的消耗性疾病。为了对猪场中猪鼻支原体的感染和发病情况进行初步调查,建立一种可靠的PCR检测体系。方法的敏感性需满足检测要求,能与几种常见的导致猪呼吸道和多发性浆膜炎的疾病区分开。     

用PCR检测长沙市猪肺炎支原体和猪鼻支原体的感染情况

为对长沙市猪支原体肺炎病原流行病学进行初步调查,用PCR方法对从湖南省长沙市5个县（市、区）205头猪中收集的326份病料（205份猪肺和121份猪鼻拭子）分别进行了猪肺炎支原体和猪鼻支原体检测,并对部分基因进行了序列分析。结果发现,猪肺炎支原体检出率为24.4%（50/205）,猪鼻支原体检出率为22.3%（27/121）;长沙市每个县（市、区）的生猪中均存在这两种支原体,其中长沙县生猪阳性率最高（42.4%和31.5%）;序列分析表明,检测出的基因序列与国内外相关序列有97%～100%的同源性。本试验证实了猪肺炎支原体和猪鼻支原体在长沙市猪场的存在。     

猪场采集样品和疫苗样品中猪鼻支原体的检测

猪鼻支原体（Mycoplasma hyorhinis,Mhr）是引发猪地方性肺炎及仔猪多发性浆膜炎、关节炎的重要病原之一，也会引起猪场的常见消耗性疾病。Mhr常常污染细胞培养物，对疫苗生产造成巨大危害。定期对猪场常用的生物制品进行Mhr检测，可减少猪场由于污染的生物制品而造成损失。     

猪肺炎支原体和猪鼻支原体TaqMan双重荧光PCR检测方法的建立及应用

为建立一种可快捷鉴别检测猪肺炎支原体(Mhp)和猪鼻支原体(Mhr)的方法,针对Mhp的183基因和Mhr的p37基因保守片段,分别设计合成引物及TaqMan探针,优化反应条件,建立一种可同时检测Mhp和Mhr的TaqMan双重荧光PCR方法,并评价其特异性、敏感性和重复性。结果表明,该方法特异性强,检测其他常见猪呼吸系统病原不发生交叉反应;对标准品pMD18-T-Mhp-183、pMD18-T-Mhr-P37的最低检测限分别达45.2 copies/μL和29.7 copies/μL,比普通PCR检测灵敏度提高10³～10⁴倍;该方法检测结果的批内与批间变异系数均小于2%。用该方法检测145份广西自治区内临床样品,从中检出82份Mhp和9份Mhr阳性样品。该方法可用于临床样品快速检测及实验室Mhp和Mhr的鉴定,可为Mhp和Mhr在猪群中的早期监测提供技术支持。     

猪鼻支原体抗血清的制备与鉴定

猪鼻支原体(Mycoplasma hyrhinis,Mhr)是猪鼻腔的常在菌。将猪鼻支原体与弗氏佐剂共乳化,免疫新西兰大白兔,获得猪鼻支原体兔抗血清。Western blotting检测其特异性;建立间接ELISA方法检测其抗体效价;将获得的猪鼻支原体兔抗血清分别加入猪鼻支原体和猪肺炎支原体培养物中,进行生长抑制试验。结果显示,制备的猪鼻支原体兔抗血清与猪鼻支原体具有反应原性;抗体效价达1:160 000以上;猪鼻支原体兔抗血清可以显著抑制猪鼻支原体的生长,而对猪肺炎支原体的生长影响较小。本试验结果为鉴定和检测猪鼻支原体提供了方法,也为猪肺炎支原体的分离提供了参考。     

用探针杂交法检测鸡毒支原体和滑液囊支原体

根据鸡毒支原体(MG)和滑液囊支原体(MS)的16SrRNA基因序列，设计并合成了探针MG和MS共同目的基因，跨幅为580bP的一对引物。用这对引物对2个标准的MG和1个标准的Ms菌株DNA模板进行聚合酶锭反应(PcR)，结果得到了预期大小约580bP的PcR产物。回收纯化琼脂糖电泳凝肢中的MG扩增产物克隆至T载体中，DIG随机引物法合成核酸探针，斑点杂交试验对MG和MS均呈阳性，检测灵敏度分别为2ng和3ng，其它对照菌(毒)株为阴性。     

生物制品生产中支原体污染的检测和预防

支原体是生物制品中常见的一种污染微生物,工作环境、操作者本身、培养基、污染支原体的细胞、试验器材和用来制备细胞的原始组织或器官都可能给生产带来支原体的污染。生物制品一旦污染支原体,会引起质量下降,免疫效果得不到保证,严重时可造成人力、物力、财力上的巨大损失,因此在生物制品生产中,需严格保持无菌操作,建立快速有效的检测方法,有效防止支原体的污染。     

规模化猪场肺炎支原体、鼻支原体与蓝耳病病毒感染情况调查

[目的]为分析猪肺炎支原体(MHP)、猪鼻支原体(MHR)与猪蓝耳病病毒(PRRSV)在临床感染中的相互关系。[方法]对从山东省规模化猪场收集的213份疑似病料进行PRRSV、MHP和MHR的检测,结合猪场的免疫背景对结果进行分析。[结果]发现在猪肺炎支原体免疫猪场,猪肺炎支原体感染比例显著降低,而在猪肺炎支原体非免疫猪场,猪鼻支原体与猪肺炎支原体、猪蓝耳病病毒的混合感染率极高。无论在肺炎支原体免疫场还是非免疫场,猪蓝耳病病毒与猪鼻支原体的混合感染率,都超过了猪蓝耳病病毒与猪肺炎支原体的混合感染率。[结论]PRRSV与MHP和MHR之间有着密切的关系,除猪肺炎支原体外,猪鼻支原体目前已成为危害养猪业的又一重要因素。     

三种血清学方法和qPCR方法在鸡滑液囊支原体检测中的综合应用研究

为评价不同方法对鸡滑液囊支原体（MS）活疫苗免疫和非免疫状态鸡群的监测效果,研究分别采用HI、SPA与ELISA三种抗体检测方法和qPCR方法同步对某养殖场A、B和C三组鸡群进行MS感染和抗体水平监测,其中A鸡群23日龄免疫MS活疫苗（MS-H株）,B、C鸡群不免疫MS疫苗。结果显示：三种血清学检测方法所测MS抗体阳性率趋势基本一致,HI抗体效价变化规律和ELISA抗体效价变化规律相似,但血清学方法相对于qPCR方法具有一定的滞后性,qPCR可以最早发现MS野毒感染,且在使用活疫苗免疫的情况下对疫苗和野毒进行鉴别检测。研究提示：在条件允许的情况下,qPCR可以作为MS首选的监测方法;当检测条件受限时,上述三种血清学方法同样也可以用于评估MS野毒感染状况,但对结果的判断受母源抗体水平、疫苗免疫状况、野毒感染时间等多重因素的影响,在结果判断时应进行综合分析。     

基于SYBR Green Ⅰ的桑树皱叶病毒qPCR检测方法的建立及应用

根据桑树皱叶病毒(mulberry crinkle leaf virus,MCLV)cp基因的核苷酸序列,设计了3对用于实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)的引物,以含有cp基因全长序列的重组质粒为模板,通过PCR和熔解曲线分析筛选出1对适合用于qPCR的特异性引物。以10倍梯度稀释的含有cp基因全长序列的重组质粒为模板,进行SYBR GreenⅠqPCR并制作标准曲线,建立了MCLV的qPCR检测方法。该方法对MCLV cp基因的检测灵敏度≥47.8个拷贝/μL。利用建立的qPCR方法对大田样品进行检测,结果显示15个样品都为MCLV感染阳性,其中病毒含量最高的样品的病毒拷贝数为5.26×10~4个拷贝/μL,最低的样品为8.36×10~2个拷贝/μL。MCLV qPCR检测体系的建立可以为培育健康桑树种苗、预防病毒病的发生提供精准保障技术,也为研究桑树不同生长时期或不同组织中病毒滴度变化奠定了基础。     

支原体PCR检测方法的建立和应用

依据GenBank中登录的常见细胞污染支原体16S rRNA基因序列,选择高度保守的区域设计引物,建立了一种快速灵敏的支原体PCR检测方法.该方法可以特异性检测出6种支原体,并能敏感的检测到10个拷贝数的目的基因.采用建立的PCR方法和传统的培养法对23个不同样品(细胞、血清、疫苗成品、半成品)进行检测,符合度100％.该方法的建立可大大缩短疫苗生产过程中支原体检验所需时间.     

应用电镜技术快速检测培养细胞中的支原体污染

应用电镜技术可快速准确地检测培养细胞中的支原体污染。通过高速离心浓缩样品,负染色后电镜观察,可在30min内做出判定,方法快速、简便、准确。     

两组探针和SYBR Green染料qPCR检测柑橘黄龙病的灵敏度研究

本研究把柑橘黄龙病（Citrus Huanglongbing,HLB）阳性核酸样品进行梯度稀释后,分别采用HLBp、CQULAP两组TaqMan水解探针法和以rpl基因为目的片段的SYBR Green染料法进行HLB实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR, qPCR)灵敏度检测研究,结果发现HLBp探针法可以从105倍稀释的阳性叶片核酸样品中检测到病原菌（病菌拷贝数约为60个）,高于CQULAP探针法和SYBR Green染料法;将三种qPCR检测体系用于赣州安远县、寻乌县和赣县送检的60份田间样品检测,结果HLBp探针阳性率为86.66%,CQULAP探针阳性率为60%,以rpl基因为目的片段的SYBR Green染料法检测阳性率为68.33%。     

应用巢式PCR方法检测牛支原体肺炎

根据Genbank发表的牛支原体全基因序列,设计2对特异性引物,建立了诊断牛支原体肺炎的巢式PCR方法,第一轮引物P1、P2扩增片段长度为1912bp,第二轮引物P3、P4扩增片段长度为422bp:该方法特异性试验未扩增出丝状支原体丝状亚种小克隆和无乳支原体特异性条带;敏感性试验证明扩增DNA最低含量达到10-7μg/mL,是单一PCR的103倍;用该方法对阳性病料进行检测,均扩增出特异性片段。该体系的成功构建,可以为牛支原体肺炎的活体检测,和流行病学调查提供技术支持。     

应用巢式POR方法检测牛支原体肺炎

根据Genbank发表的牛支原体全基因序列,设计2对特异性引物,建立了诊断牛支原体肺炎的巢式PCR方法,第一轮引物P1、P2扩增片段长度为1912bp,第二轮引物P3、P4扩增片段长度为422bp：该方法特异性试验未扩增出丝状支原体丝状亚种小克隆和无乳支原体特异性条带;敏感性试验证明扩增DNA最低含量达到10—7Hg／mL,是单一PCR的10^3倍;用该方法对阳性病料进行检测,均扩增出特异性片段。该体系的成功构建,可以为牛支原体肺炎的活体检测,和流行病学调查提供技术支持。     

应用双重PCR方法检测羊支原体肺炎病原

通过对丝状支原体山羊亚种(M.mycoides subsp.capri,Mmc)特异性引物MmcF/MmcR和绵羊肺炎支原体(M.ovipneumontiae,Mo)特异性引物LmF/LmR退火温度、引物浓度比例等条件的选择,建立了一个可以同时检测Mmc和Mo的双重PCR方法。该方法可同时扩增出Mmc 195 bp和Mo 361 bp目的片段,但对其他病原菌不能扩增出任何条带,具有良好的特异性。敏感性试验表明,该方法能够分别检测出0.1ng的Mmc DNA和0.01 ng的Mo DNA,或同时检测出1ng Mmc和1ng Mo混合的DNA。用该双重PCR方法可对实验室保存的4株绵羊肺炎支原体和2株丝状支原体山羊亚种进行准确鉴定,并可从临床病料中检测出相应支原体,表明建立的双重PCR方法可用于Mmc和Mo的快速鉴定、实验室诊断和病原学调查。     

鸡毒支原体与滑液囊支原体双重PCR检测方法的建立与应用

为建立鸡毒支原体(MG)与滑液囊支原体(MS)双重PCR检测方法,一次反应即可诊断鸡毒支原体与滑液囊支原体感染情况.根据GenBank公开的MG和MS基因序列,设计了2对质粒构建引物和2对检测引物,优化检测反应体系与条件,进行灵敏性试验、特异性试验和临床检测应用.结果显示,该方法对MG和MS阳性质粒的最低检测限为10拷...